Purificação do proteassomo 20S

Após o teste sistemático da metodologia sugerida inicialmente (adaptado de GROLL e HUBBER, 2005; GALLASTEGUI e GROLL, 2012), verificamos baixíssima produção do proteassomo 20S de levedura (<0,5 mg do proteassomo por 80 gramas de célula de levedura). Este método era baseado em precipitações com gradientes de sulfato de amônio, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de troca iônica e cromatografia de exclusão molecular. Em seguida foi testada a purificação do proteassomo de levedura com cauda de histidina utilizando a linhagem RJD1144 (MAT a his3Δ200 leu2-3,112 lys2-801 trp1Δ63 ura3-52 PRE1FH∷Ylplac211 (URA3)) gentilmente cedida pelo Prof. Dr. Raymond J Deshaies seguindo o método de Silva, 2010, que consistia apenas de uma etapa de cromatografia de afinidade. Infelizmente, a produção do proteassomo de levedura com His-tag pela cepa fornecida pelo

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Prof. Dashaies não foi eficiente, sendo que a produção e purificação do complexo 20S não foi possível.

Desta forma, buscamos outras alternativas para a purificação deste complexo enzimático. O protocolo alternativo de purificação do complexo 20S de levedura foi adaptado de outro protocolo descrito na literatura (LEGGETT et al, 2005).

Para a obtenção do proteassomo 20S de levedura foram utilizados 80g de células (fermento Fleischmann®). Estas células foram ressuspensas em 320 mL de água Milli-Q gelada e centrifugadas por 10 minutos a 4.000 xg. Em seguida as células foram novamente lavadas com água repetindo o passo anterior. Após lavagem o sobrenadante foi descartado e cada grama de célula foi ressuspenso em 4 mL de tampão 50 mM Tris-HCl pH 7,5.

As células ressuspensas foram então gotejadas em nitrogênio líquido utilizando uma pipeta sorológica, formando assim drops/pop-corn de células. Após a evaporação do nitrogênio os drops foram armazenados a -80°C até o momento da lise.

A lise foi realizada utilizando nitrogênio líquido (DUNN e WOBBE, 2001) adaptando o uso do liquidificador para moedor de café. Para tanto os drops foram moídos em nitrogênio por 30 segundos, para garantir a lise efetiva moeu-se por até três vezes consecultivas. O lisado foi armazenado em um béquer contendo nitrogênio líquido até todos os drops serem lisados, sendo então guardados em ultrafreezer até o momento da purificação (Figura 15).

Figura 15. Preparo das células de levedura. A. Fermento Fleischmann® B. Drops de levedura. C. Drops de

levedura após serem moídos.

Para a purificação do proteassomo 20S de levedura o lisado foi descongelado sendo adicionado MgCl2 e DTT para uma concentração final, respectivamente, de 10 mM e 1 mM. O

lisado foi então centrifugado por uma hora a pelo menos 43.100 xg. Após a centrifugação o pH do sobrenadante foi ajustado para 7,4 utilizando 1 M Tris-Base. Em seguida o lisado foi filtrado em gaze, papel de filtro de gramatura 80 g/m² e filtro de poro 0,22 µm.

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O extrato clarificado foi incubado com 50 mL de resina DEAE Affi-Gel® Blue Gel (Bio-Rad) previamente equilibrada com tampão 25 mM Tris pH7,4, 1 mM DTT, 10 mM MgCl2

(Tampão A) sob agitação constante a 4°C. Após a incubação a resina foi distribuída em 5 colunas Econo-Pac (Bio-Rad) e o extrato foi eluído (flow-trough). A resina foi lavada com 200 mL de tampão A, seguida por uma lavagem de 250 mL com tampão A suplementado com 50 mM NaCl. O proteassomo foi eluído com 220 mL de tampão A, suplementado com 150 mM de NaCl e 100 mL com 250 mM de NaCl. A resina foi regenerada utilizando 3 M NaCl.

Os eluatos foram submetidos a ensaio bioquímico para identificação da atividade proteolítica do proteassomo. Resumidamente o ensaio de atividade foi realizado utilizando placas de 96 poços ½ área (Greiner Bio-One), foram adicionados 5 µL de tampão 1 M Tris pH 7,5; 0,1% SDS (Assay Buffer 10X), 35 µL do eluato a ser analisado e 10 µL do substrato fluorogênico 0,2 mM Suc-LLVY-AMC. A atividade foi verificada utilizando o leitor de placas Enspire (Perkin Elmer), utilizando λexc= 360nm e λemi=460nm a 37°C. (Figura 16). Foi

realizada também eletroforese em gel desnaturante (SDS-PAGE) das frações de interesse (Figura 17).

Figura 16. Ensaio de atividade das frações da purificação em resina DEAE Affi -Gel® Blue Gel. Na parte

superior há o gráfico de 120 ciclos de leitura, na parte inferior a leitura (RFU) no ciclo 60. 1. Controle negativo; 2. Lisado; 3.Lisado após filtração em papel de filtro; 4. Lisado após filtração em filtro de poro 0,22µm; 5. Flow- trough; 6. Lavagem 0mM 1; 7. Lavagem 50mM 2; 8. Eluição 150mM I; 9. Eluição 150mM II; 10. Eluição 150mM III; 11. Eluição 150mM IV; 12. Eluição 150mM V; 13. Eluição 250mM I; 14. Eluição 250mM II. Em destaque os eluatos de 150 mM NaCl contendo o proteassomo

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.

Figura 17. SDS-PAGE (15%) da cromatografia em resina DEAE Affi-Gel® Blue Gel. 1, Lisado; 2, Lisado

após filtrações; 3, Flow-trough; 4, Lavagem 0mM; 5, Lavagem 50mM; 6, Eluição 150mM I; 7, Eluição 150mM II; 8, Eluição 150mM III; 9, Eluição 150mM IV; 10, Eluição 150mM V; 11, Eluição 250mM I; 12, Eluiç ão 250mM II.

Utilizando sistemas ÄKTA Purifier as frações ativas (eluatos de 150 mM NaCl) foram aplicadas à uma coluna de troca iônica HiTrap Q HP previamente equilibrada com tampão IEX- A (20 mM Tris pH7,4, 1 mM DTT, 10 mM MgCl2, 100 mM NaCl). Inicialmente a coluna foi

lavada com tampão IEX-A até redução da absorção UV, sendo então realizada a eluição até 100% IEX-B (20 mM Tris pH7,4, 1 mM DTT, 10 mM MgCl2, 500 mM NaCl) em 20 volumes

de coluna (Figura 18A). Foi realizado um novo ensaio de atividade para identificação das frações contendo o proteassomo (Figura 18B) e correu-se um SDS-PAGE para análise das frações (Figura 18C).

Após a identificação da condutividade necessária para a eluição (~36 mS), um novo protocolo de eluição foi estabelecido onde a coluna foi lavada com concentrações crescentes de tampão IEX-B até 60%, só então sendo iniciado o gradiente de eluição até 100% de IEX-B em 30 volumes de coluna (Figura 19A). Para controle da purificação um novo ensaio de purificação foi conduzido para validação do protocolo de eluição e confirmou-se a eluição do proteassomo nas frações de condutividade entre 34,9 e 37,4mS (67,9 a 75,1% B-IEX - Figura 19B e C).

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A

B

C

Figura 19. Cromatografia de troca iônica. A. Cromatograma – a seta vermelha indica a fração com atividade

catalítica sob o substrato Suc-LLVY-AMC. Devido ao proteassomo ser composto por 14 subunidades, ele pode ser identificado no gel pelas diversas bandas de massa próxima a 27kDa. B. Ensaio de atividade das frações da cromatografia de troca iônica. C. SDS-PAGE (15%) da cromatografia de troca iônica.

Inject - Flow - Wash - 107mL - 117mL - 122mL - 126mL- 131mL 133mL - 141mL - 144mL - 150mL - 154mL - 161mL - 170mL - 183mL - 188mL - Ctrl neg.

46kDa

22kDa

14kDa

66kDa

50

A

B

C

Figura 19. Cromatografia de troca iônica com eluição otimizada. A. Cromatograma – a seta vermelha indica

a fração com atividade catalítica sob o substrato Suc-LLVY-AMC. B. Ensaio de atividade das frações da cromatografia de troca iônica. C. SDS-PAGE (15%) da cromatografia de troca iônica.

Neg Ctrl - Inject - Flow - Wash 40%- Wash 50%- Wash 60%- 125,49mL -127,20mL - 128,90mL – 130,60mL- 151,00mL - 157,80mL - 159,50mL - 164,60mL – 188,39mL – 188,39mL - 237,69mL

46kDa

27kDa

22kDa 14kDa 66kDa

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Para melhor refinamento da purificação as frações ativas provenientes da troca iônica foram concentradas até 1 mL (Vivaspin – MWCO 30kDa) e a amostra foi submetida a cromatografia de exclusão molecular em sistema ÄKTA FPLC UPC-900 utilizando uma coluna HiPrep 16/60 Sephacryl S-400 HR (tampão 25 mM Tris pH7,4, 10 mM MgCl2, 150 mM NaCl,

1 mM DTT) - Figura 20A. O pico contendo o proteassomo foi identificado através do ensaio de atividade (Figura 20B) e as frações ativas concentradas até 1 mg/mL. Foram separados 50 µg do proteassomo de levedura purificado (concentração= 1 mg/ml) para ensaios de atividade. O restante teve o tampão trocado para 10 mM MES pH6,8 e concentrado até 38 mg/mL para obtenção de cristais. A pureza da amostra foi avaliada por eletroforese ( Figura 21). O rendimento da purificação foi de cerca de 1 mg do complexo 20S puro por 80 gramas de célula de levedura. O procedimento foi repetido pelo menos 5 vezes, utilizando menor volume para ressuspensão das células (1 grama de células para 2 ml de tampão de lise), obtendo -se rendimento entre 1-2 mg do complexo 20S puro por 80 gramas de célula de levedura.

Figura 20. Cromatografia de exclusão molecular. A. Cromatograma – a seta vermelha indica a fração com

atividade catalítica sob o substrato Suc-LLVY-AMC. B. Ensaio de atividade das frações da cromatografia de exclusão molecular.

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Figura 21. Eletroforese de proteassomo 20S de S. cerevisae. A. SDS-PAGE (15%) do proteassomo obtido in

house utilizado para cristalização. B. Perfil de eletroforese de proteassomo 20S (SDS-PAGE 12,5%) descrito na literatura (FINLEY et al., 2002).