Esse experimento teve por objetivo avaliar a participação do sistema gabaérgico-benzodiazepínico na extinção da aprendizagem aversivamente condicionada ao contexto dos ratos selecionados previamente em subgrupos como HR e LR frente à novidade inerente do campo aberto. Assim, utilizou-se o diazepam, um agonista do sítio benzodiazepínico do receptor gabaérgico, para avaliar essa possível participação.
Os animais foram divididos em quatro grupos após a seleção no campo aberto: HR-diazepam; HR-salina; LR- diazepam; e LR-salina. O procedimento comportamental realizado foi idêntico a aquele conduzido no experimento 5 da primeira etapa desse trabalho, com exceção de que os animais foram tratados com veículo ou droga imediatamente após a sessão de teste e as sessões de reteste.
Fig. 28: Esquema ilustrativo do procedimento de administração das drogas na extinção do condicionamento de medo ao contexto
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No dia do treino, ambos os grupos não expressam congelamento significativo visto que a medida reflete um momento no qual ainda não havia sido administrado o estímulo aversivo, o choque nas patas. No dia do teste, os grupos também não diferem entre si ao longo da sessão (Anova, efeito grupo: F= 0,59 (3,31), p=0,62) mostrando que não há diferença estatisticamente significante em relação à aquisição da tarefa emocional condicionada ao contexto entre os subgrupos; como já esperado e visto na primeira etapa desse trabalho. Como esperado, não houve influência do tratamento no desempenho dos animais na sessão de treino e teste da tarefa (F(1, 31)=1,27, p=0,27). Todos os grupos aprendem igualmente a tarefa como mostra a ANOVA para o efeito sessão (Anova, efeito sessão: F=515,43 (1,31), p<0,01), mas não há interação entre os fatores (Anova, efeito interação: F= 0,51 (3,31), p=0,67). A análise a posteriori do fator sessão, efetuada pelo teste de Tukey, mostrou que o tempo de congelamento na sessão de treino é menor do que na sessão de teste (p<0,05) [dados mostrados na figura 29].
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Fig. 29: Média de tempo de congelamento por minuto, apresentada em segundos (média +erro padrão), ao longo dos dias de treino e teste da tarefa de extinção no CCONT, para os grupos AR e BR submetidos ao tratamento de salina (SAL) ou Diazepam (DIA) (experimento 2). O número de animais por grupo é mostrado entre parênteses. Não há diferença estatisticamente significativa entre os grupos na sessão de treino e na sessão de teste. * p < 0,05 vs sessão de treino (Anova efeito sessão, seguida de teste de Tukey).
Em relação à extinção / reexposição dos animais ao mesmo ambiente sem a presença do US, pode-se observar na figura 30 o desempenho dos animais.
A análise apenas dos animais dos subgrupos selecionados como HR e LR que receberam salina ao longo das sessões de teste e retestes mostra que os grupos são diferentes entre si (Anova, efeito grupo: F(1, 15)=8,27, p<0,05) e que há extinção ao longo das sessões de reteste (Anova, efeito sessão: F(4, 60)=26,03, p<0,01), mas não há interação entre os fatores (Anova, efeito interação: F(4, 60)=2,04, p=0,10). A análise a posteriori do fator seleção demonstra que os animais LR apresentam mais tempo de congelamento que os animais HR (p<0,05). A análise a posteriori do fator sessão feita pelo teste
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de Tukey mostra que todas as sessões são diferentes do teste (p<0,01). Detalhadamente, o reteste 1 é diferente do teste, reteste 3 e reteste 4; o reteste 2 é diferente do teste, reteste 3 e reteste 4; o reteste 3 é diferente do teste e reteste 1; e o reteste 4 é diferente do teste e reteste 1 (Tukey, p<0,05). Assim como nos experimentos anteriores, esses dados mostram o padrão comportamental de déficit de extinção dos animais do subgrupo LR frente à tarefa de condicionamento de medo ao contexto.
Quando todos os fatores são analisados, há efeito seleção HR e LR (Anova, efeito seleção: F(1, 31)=11,37, p<0,01) e efeito sessão demonstrando a extinção ao longo das sessões (Anova, efeito sessão: F(4, 124)=52,65, p<0,01), mas não há efeito tratamento (Anova, efeito tratamento: F(1, 31)=2,93, p=0,10), nem interação entre os fatores (Anova, efeito interação: F(4, 124)=0,83, p=0,51). A análise a posteriori do fator seleção indica que os animais LR apresentam mais tempo de congelamento que os animais HR (p<0,05). A análise a posteriori do fator sessão feita pelo teste de Tukey mostra que todas as sessões são diferentes do teste (p<0,01). Detalhadamente, o reteste 1 é diferente do teste, reteste 3 e reteste 4; o reteste 2 é diferente do teste, reteste 3 e reteste 4; o reteste 3 é diferente do teste, reteste 1 e reteste 2; e o reteste 4 é diferente do teste, reteste 1 e reteste 2 (Tukey, p<0,05). [dados apresentados na figura 30].
Em resumo, os animais LR demoram mais para extinguir que os animais HR, confirmando a diferença encontrada na primeira etapa do trabalho. A administração de diazepam pós-teste desses animais (injeção imediatamente após a reexposição) não altera per se o desempenho desses na tarefa.
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Fig. 30: Tempo total de congelamento em segundos (média +erro padrão), ao longo dos dias de teste e reteste da tarefa de extinção no CCONT, para os grupos AR e BR submetidos ao tratamento de salina (SAL) ou Diazepam (DIA) (experimento 2). O número de animais por grupo é mostrado entre parênteses. Não há diferença entre os grupos nas sessões de teste e retestes. * p <0,05 vs animais LR independente de tratamento (Anova efeito grupo, seguida de teste de Tukey). α p < 0,05 vs sessão de teste, p< 0,05 vs sessão de reteste 1, p< 0,05 vs
sessão de reteste 2, εp< 0,05 vs sessão de reteste γ, θ p< 0,05 vs sessão de reteste 4 (Anova
efeito sessão, seguida de teste de Tukey).
Embora não tenha sido observada diferença estatisticamente significativa entre os animais que receberam salina e aqueles tratados com diazepam pós- sessão, é possível observar uma tendência de aumento no tempo de congelamento tanto dos animais do subgrupo HR quanto dos animais do subgrupo LR após tratamento com a droga em todas as sessões de reteste. A ausência de diferença estatística encontrada pode ter se dado pela extrema variabilidade do desempenho comportamental dos animais ao longo das sessões (o comportamento de congelamento condicionado tem grande variabilidade) e pelo pequeno número final de animais por grupo, em vista da necessidade do processo prévio de seleção em subgrupos HR e LR.
*
* *
* α ε θ α ε θ
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DISCUSSÃO PARCIAL – ETAPA 2
A segunda etapa desse trabalho mostrou que os animais selecionados como HR e LR que receberam tanto imipramina (experimento 1) quanto diazepam (experimento 2) pós-sessão da tarefa de extinção do condicionamento de medo ao contexto não apresentam diferenças estatísticas quando comparados aos respectivos subgrupos que receberam salina; apesar da administração de diazepam ter provocado leve tendência, não estatisticamente significativa, de aumento no tempo de congelamento em ambos os subgrupos tratados.
Recentemente, autores que estudam as bases neurobiológicas e experimentais do condicionamento de medo têm proposto que a compreensão e manipulação desse paradigma experimental pode ser utilizada para o entendimento de certos transtornos mentais ansiosos, como o estresse pós- traumático (LeDoux, 2000; Cammarota et al. 2006; Fendt & Fanselow, 1999). No transtorno de estresse pós-traumático (TEPT), após uma experiência aversiva, o indivíduo exibe uma série de respostas-sintomas que vão desde a hiperestimulação autonômica, revivência cognitiva intrusiva da situação traumática, até comportamentos de esquiva e congelamento; essa última classe de respostas similar ao estudado nos modelos de condicionamento de medo (Bremner, 2003; Etkin & Wager, 2007). De maneira geral, indivíduos com TEPT exibem hiperconsolidação e déficit de extinção da experiência aversiva, tornando-se incapazes de esquecer ou extinguir adequadamente essa
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experiência (Milad et al., 2008). Esses pacientes também apresentam alterações significativas da estrutura hipocampal, como hipoativação e redução do volume do hipocampo (Bremner, 2003). Em animais de laboratório, o déficit de extinção do medo condicionado é considerado como um bom modelo para o estudo do TEPT, por ser esse um dos mais marcantes e incapacitantes sintomas do transtorno (LeDoux, 2000). Animais selecionados como de baixa expressão do comportamento de empinar no campo aberto (LR) possuem hipoatividade do hipocampo (Alves et al., 2005), hiperconsolidação e déficit na extinção de memória aversiva, já observada na tarefa de esquiva inibitória (Borta & Schwarting, 2005a, 2005b). A primeira etapa de nosso estudo estendeu os dados sobre o processo de aprendizagem e memória aversiva desses animais mostrando que seu déficit de extinção e hiperconsolidação da memória aversiva é restrito ao envolvimento do hipocampo; sendo observadas diferenças apenas na tarefa de condicionamento de medo ao contexto, hipocampo dependente, e não no condicionamento de medo ao som, hipocampo independente. Tendo em vista que pacientes com TEPT mostram hipoatividade hipocampal (Bremner, 2003) e prejuízo no esquecimento e extinção de respostas aversivamente condicionadas (Milad et al., 2008), sugeriu-se que animais selecionados como LR poderiam ser utilizados como potencial modelo para o estudo do TEPT
Assim, a administração de drogas utilizadas na clínica humana para tratamento do TEPT foi realizada na segunda etapa desse estudo para refinar a compreensão do possível envolvimento dos mesmos mecanismos fisiológicos do TEPT em animais com baixa expressão do comportamento de empinar e
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ampliar a discussão sobre seu potencial uso como modelo animal para o transtorno.
No primeiro experimento da segunda etapa desse trabalho, a imipramina foi utilizada para tentar interferir na extinção dos animais selecionados como LR, porém, nenhum efeito no desempenho dos animais foi observado, contradizendo nossa hipótese inicial.
A imipramina é um antidepressivo tricíclico utilizado na clínica psiquiátrica para o tratamento do TEPT. Diversos estudos antigos, entre eles um ensaio clínico randomizado, mostram que esse é um medicamento eficaz em humanos para minimizar os sintomas do transtorno (Kosten et al., 2001; Frank et al., 1988; Blake, 1986; Burstein, 1984), embora autores sugiram que o tratamento farmacológico com imipramina deva necessariamente estar associado a técnicas psicoterápicas ou intervenções paliativas a fim de aumentar a efetividade da redução de sintomas do TEPT (Bernik et al., 2003).
Em animais de laboratório, a literatura tem mostrado que essa droga prejudica algumas tarefas hipocampo-dependentes como a versão espacial do labirinto radial, quando administrada cronicamente, a tarefa de reconhecimento de objetos, após administração aguda ou crônica (Naudon et al., 2007), e a retenção da memória na tarefa de esquiva inibitória quando administrada i.p. ou i.c.v. pós-treino (Zarrindast et al., 2004). Além disso, administração intrahipocampal de imipramina prejudica a consolidação da tarefa de esquiva inibitória, sugerindo que sua influência na memória poderia ocorrer via hipocampo (Zarrindast et al., 2003). Todavia, outro estudo mostrou que a imipramina é inefetiva numa tarefa espacial no labirinto complexo, mesmo
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quando administrada cronicamente por 14 dias (Nowakwaska et al., 2003) trazendo algum conflito na literatura. Esses dados sugerem que é relevante lembrar que nosso procedimento consistia na administração pós-teste de imipramina que perfez apenas quatro dias de administração, não podendo ser considerada uma administração crônica. A diferença entre uso crônico e uso agudo deve ser levada em consideração para compreender o perfil diferente de nossos resultados obtidos, em comparação com a literatura e sugerir que novos estudos sejam realizados nesse sentido para determinar, realmente, a efetividade da imipramina no desempenho dos animais LR.
Além disso, em relação ao medo condicionado ao contexto, seja no que se refere à aquisição ou extinção, não há dados prévios na literatura que mostrem o efeito da imipramina sobre o desempenho de ratos. Assim, pode-se hipotetizar que o prejuízo encontrado após administração de imipramina nas tarefas como esquiva inibitória ou labirinto esteja sendo mediado por mecanismos como o componente de aprendizagem instrumental dessas tarefas, diferentes daqueles relacionados à extinção do condicionamento de medo ao contexto
É importante ainda ressaltar que a memória possui diversas fases passíveis de manipulação farmacológica – como aquisição, consolidação e extinção – e que podem apresentar perfis diferentes de influência de fármacos. Sendo assim, os dados de prejuízo encontrados após administração de imipramina na aquisição ou retenção das tarefas de labirinto radial, reconhecimento de objetos (Naudon et al., 2003) e esquiva inibitória (Zarrindast
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nas mesmas tarefas. Além disso, o prejuízo obtido na consolidação da tarefa de esquiva inibitória pode estar relacionado aos mecanismos neurofisiológicos da fase rápida de consolidação, visto a administração da droga ter sido realizada imediatamente após o treino. A extinção, como sugere Medina et al. (2008), estaria mais relacionada à alterações moleculares lentas, dependente de regiões neocorticais e suas interações com estruturas do lobo temporal medial que reorganizariam o recente material aprendido, podendo durar semanas ou meses; tais alterações moleculares podem ser influenciadas pela reexposição do animal aos estímulos que geraram o pareamento da memória condicionada, como acontece no procedimento de extinção da tarefa de condicionamento de medo ao contexto utilizado nesse trabalho.
Deve-se ainda apontar que as diferenças intrínsecas dos animais selecionados em subgrupos HR e LR poderiam produzir sensibilidade diversa aos efeitos gerais da imipramina e, portanto, não mostrar seus efeitos deletérios sobre a memória, vistos na média de uma população geral de ratos. A possível sensibilidade diferencial a fármacos nos animais selecionados em HR ou LR já foi demonstrada com experimentos descrevendo os efeitos distintos da indução a convulsões pela administração de DMCM (Alves, 2005), habituação à nicotina (Pawlak & Schwarting, 2005) e prejuízo na memória com administração de metanicotina (Borta & Schwarting, 2005). Sabe-se ainda que animais selecionados em subgrupos HR e LR não diferem no teste de natação forçada, modelo aceitável para mensuração de depressão em animais (Alves, 2009) e sensível à administração de imipramina (Barros & Ferigolo, 1998), sugerindo que os animais não apresentam diferença em comportamentos
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depressivos. Apesar da inexistência de dados prévios sobre os efeitos da imipramina nos subgrupos de animais selecionados em HR e LR, o hipocampo desses animais, possível sítio de atuação da imipramina no cérebro (Gentsch
et al., 1983), funciona de forma diversa (Alves, 2005; 2009) o que poderia
também estar relacionado com a não observância dos efeitos dessa droga. Outro ponto importante a ressaltar é que, clinicamente, tem se discutido que a imipramina é mais efetiva para reduzir respostas-sintomas cognitivos, relacionados à intrusão de pensamentos e reminiscências dos pacientes, do que para respostas-sintomas comportamentais implicados na esquiva e medo condicionado a situação traumática (Bernik et al., 2003). Nesse sentido, embora seja efetiva clinicamente para o TEPT, melhorando a qualidade de vida do paciente, essa droga estaria associada a uma classe específica de respostas e diferente do medo condicionado inerente ao transtorno.
Dos medicamentos especificamente efetivos avaliados na evitação de estímulos relacionados à esquiva e medo condicionado, ensaios clínicos sugerem que apenas a fluoxetina (Nagy et al., 1993), paroxetina (Marshal et al., 1998), nefazodona (Hertzberg et al., 2002) e lamotrigina (Hertzberg et al., 1999) reduzem significativamente essa classe de repostas. Dos quatro medicamentos com efetividade, três deles (fluoxetina, paroxetina e nefazodona) são antidepressivos que possuem como mecanismo de ação a inibição seletiva de transportadores da serotonina; ao passo que a imipramina, utilizada no presente trabalho, é classificada como antidepressivo tricíclico. Nesse sentido, talvez a resposta de medo condicionado esteja mais envolvida com o sistema serotonérgico e não com os mecanismos gerais da imipramina,
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que atua simultaneamente em diversos sistemas (como colinérgico, dopaminérgico, histaminérgico, serotonérgico, entre outros (Moreno et al., 1999; Feighner, 1999)). Dentre as ações da imipramina, sabe-se que ela possui grande afinidade com os transportadores de noradrenalina, mas baixa afinidade com os transportadores de serotonina (Plenge et al., 1991) – ao contrário dos inibidores seletivos de recaptação de serotonina - o que poderia explicar os resultados diversos nas respostas-sintomas de TEPT entre essas classes de drogas.
De fato, estudos em animais mostram que inibidores seletivos de transportadores de serotonina interferem no condicionamento de medo. Apesar de não haver estudos que avaliam a memória condicionada de animais com a nefazodona, a paroxetina administrada pré-teste, realizado 24 horas ou 14 dias após o treino, reduz o tempo de congelamento de animais na tarefa de condicionamento contextual de medo (Nishikawa et al., 2007). A fluoxetina administrada aguda ou subcronicamente reduz o tempo de congelamento de animais submetidos à tarefa de condicionamento contextual de medo com choques altos, que produzem grande resposta de congelamento condicionado, mas não com choques baixos (Santos et al., 2006). Além disso, ratos submetidos a um modelo animal de estresse pós-traumático (SPS – Single
Prolonged Stressx) e que apresentam habitualmente altos níveis de
congelamento no teste da tarefa de condicionamento de medo ao contexto, apresentam redução do tempo de congelamento avaliado no teste 24 horas
x
O modelo animal de estresse pós-traumático denominado de SPS (single prolonged stress) ocorre por
meio da exposição de um rato a um estímulo estressor agudo e, após um período mínimo de sete dias,
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depois do treino da tarefa se recebem administração crônica de paroxetina por 14 dias, mas não se administração é aguda (Takahashi et al., 2006).
Por outro lado, a literatura não apresenta dados quanto à administração de fluoxetina ou paroxetina na extinção de ratos submetidos ao modelo de estresse pós-traumático SPS, sugerindo que outros estudos sejam também necessários para verificar não apenas a hiperconsolidação da resposta de medo desses animais, mas a extinção ao medo condicionado; necessária para a compreensão mais abrangente de um modelo animal de TEPT. No mesmo sentido, estudos farmacológicos com administração de inibidores seletivos de transportadores de serotonina devem ser conduzidos em animais selecionados como LR para verificar possíveis mecanismos de redução de resposta de medo condicionado similares aos efeitos obtidos em humanos.
No segundo experimento dessa etapa do trabalho, a administração pós- sessões do agonista benzodiazepínico diazepam não interfere de forma estatisticamente significativa na extinção do condicionamento de medo ao contexto dos animais selecionados em subgrupos HR ou LR; embora tendência não estatística de aumento no tempo de congelamento de ambos os subgrupos de animais que receberam a droga tenha sido observada. Esse resultado também contradiz a hipótese inicial do presente trabalho que esperava que um agonista benzodiazepínico interferisse na extinção dos animais LR.
Em humanos, os benzodiazepínicos têm sido utilizados como redutores de ansiedade geral para o transtorno de estresse pós-traumático (Gelpin et al.,
Essas alterações são consideradas um bom paradigma para a avaliação do estresse pós-traumático(TEPT)
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1996; Cates et al., 2004; Pitman & Delahantly, 2005). Seus efeitos miorelaxantes, sedativos e ansiolíticos são especialmente úteis para auxiliar os pacientes na retomada da qualidade de vida e para facilitar a condução da terapia cognitivo-comportamental (Bernik et al., 2003); apresentando seus méritos como farmacoterapia adjuvante e podendo ser necessário para o tratamento do TEPT. Além disso, sabe-se que a administração de diazepam em humanos interfere com desempenho em tarefas de memória, entre elas, tarefas de condicionamento de medo. Hellewell et al. (1999) e Brignell & Curran (2006)mostraram que a administração de diazepam (nas doses de 2 mg/kg ou 10 mg/kg) reduz a aquisição da resposta aversivamente condicionada de condutância galvânica da pele em voluntários normais. Em animais de laboratório, o diazepam também interfere na aquisição da resposta condicionada: Gravius et al. (2006) observaram que a administração sistêmica pré-treino de diazepam (2 mg/kg) reduz o tempo de congelamento de ratos no teste da tarefa de condicionamento contextual de medo, demonstrando o efeito amnésico dessa substância em uma tarefa hipocampo-dependente.
Como discutido, todavia, não é possível esperar sempre efeitos semelhantes de influência de uma droga em todas as fases do processo de aprendizagem e memória, visto existir especificidades em relação aos mecanismos e circuitarias neurais subjacentes a cada uma delas, aquisição, evocação, esquecimento e extinção. De fato, a literatura mostra que o perfil de administração de diazepam na fase de consolidação e extinção da tarefa de condicionamento de medo ao contexto parece depender de variáveis como dose administrada, momento da injeção e via de administração, além dos
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procedimentos comportamentais utilizados em cada trabalho. Gravius et al. (2006) observaram que a administração sistêmica de diazepam (2 mg/kg) pré- teste (24 horas depois do treino) da tarefa de condicionamento de medo ao contexto produz aumento no tempo de congelamento. Por outro lado, Resstel
et al. (2006) obtiveram redução do tempo de congelamento de ratos com
administração em dose similar (2,5 mg/kg, i.p., pré-teste). Finalmente, Bouton
et al. (1990) observaram que se a administração sistêmica de diazepam for
realizada antes de ambas as sessões de treino e testes (dois dias de teste consecutivos) da tarefa, sob a dose de 5 mg/kg (mas não sob as de 2,5 e 1,25 mg/kg), há aumento no tempo de congelamento de fêmeas na extinção (segundo dia de teste), mas não na sessão de consolidação (primeiro dia de teste). A administração sistêmica de diazepam parece apresentar afinidade de atuação preferencialmente com a amígdala, visto que lesão de amígdala bloqueia o prejuízo no teste de esquiva inibitória obtido com administração pré- treino de diazepam sistêmico. Além disso, microinjeção de diazepam pré-treino nos núcleos lateral/basolateral, mas não no central, prejudica a retenção da