MATERIAL E MÉTODOS

2.1. Delineamento experimental, adubação e salinização do solo

O experimento foi conduzido na Universidade Estadual Paulista – Unesp, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – FCAV, Câmpus de Jaboticabal, São Paulo, Brasil, no período de fevereiro a março de 2014. Os vasos foram montados em casa de vegetação com temperatura e umidade relativa média de 30 °C e 40%, respectivamente. As plantas foram obtidas a partir de mini-toletes fornecidos pela APTA – Agência Paulista de Tecnologia dos Agronegócios, utilizando-se duas cultivares: SP 81-3250 e IAC 87-3396, transplantadas em vasos de 2 L. Foi utilizado um Latossolo Vermelho distrófico, coletado de uma profundidade de 0-20 cm, com a seguinte caracterização química: pH de 5,7; 10 mg dm-3 _{de matéria orgânica; 0,1 mg}

kg-1 de Na+; 26 mg dm-3 de P (resina); 1,6 mmolc dm-3 de K; 34 mmolc dm-3 de Ca; 21 mmolc dm-3 _{de Mg; 12 mmolc dm}-1 _{de H + Al; 341 g kg}-1_{de argila; 28 g kg}-1_de

silte; 310 g kg-1 _{de areia fina; 321 g kg}-1 _{de 20 areia grossa; classe textural média e}

densidade de 1,24 kg dm-3_{. A adubação do solo foi realizada segundo a}

recomendação da cultura (RAIJ et al., 1997), em três parcelas com intervalo de 10 dias, sendo utilizados: 0,3 g vaso-1 _{de NH}

4H2PO4 e 0,35 g vaso-1 de KH2PO4

(incorporados antes do transplantio) e 0,45 g vaso-1 de uréia e 0,35 g vaso-1 de K2SO4 (segunda e terceira parcelas, em cobertura). Não houve restrição hídrica. A

irrigação foi realizada diariamente, de forma a repor a perda de água pela evapotranspiração.

O delineamento experimental foi inteiramente casualisado, em esquema fatorial 2 x 4, sendo 2 cultivares de cana-de-açúcar (SP 81-3250 e IAC 87-3396) x 4 concentrações de NaCl (0, 40, 80 e 160 mM), com quatro repetições por tratamento. Após 30 dias desenvolvimento, as plantas receberam o estresse. Foram realizadas avaliações em duas épocas: 15 e 30 dias após aplicação do NaCl, ou seja, plantas com 45 e 60 dias de desenvolvimento, respectivamente.

A salinização do solo foi realizada de acordo com o método proposto por Raij et al. (2001). Para isto, foi realizado um ensaio preliminar que consistia de salinização de 0,1 dm3 de solo com 30 ml de solução salina, em doses de 0, 200, 400 e 800 mg L-1 no solo, utilizando como fonte de solução salina de NaCl (Sigma- Aldrich). Após 24 horas de secagem, as amostras foram peneiradas (malha de 2 mm) e uma amostra de 10 cm3 foi recolhida adicionando 50 mL de água deionizada. Depois de se agitar durante 15 minutos, seguido de decantação, o sobrenadante foi filtrado e a sua condutividade elétrica lida. A condutividade elétrica do solo em doses de Na, após a adição de NaCl, foi de cerca de 0, 2, 4 e 8 dS m-1, respectivamente, como a curva de calibração feita e relacionada com a concentração no solo e a respectiva condutividade elétrica. Assim, as concentrações utilizadas foram de 0, 40, 80 e 160 mM de NaCl.

2.2. Teores foliares e de raiz de Na+_{e K}+

As análises dos teores de Na+ _{e K}+ _{das folhas e raízes das duas cultivares de}

cana-de-açúcar foram realizadas conforme metodologia do laboratório de Tecidos Vegetais, Departamento de Ciência do solo, da Escola Superior de Agronomia Luís de Queiroz – ESALQ/USP, ambos determinados por fotometria de chama, segundo Bloise e Moreira (1976), utilizando-se a folha +3 segundo critério de Kuijper (1915).

2.3. Osmólitos compatíveis

2.3.1. Prolina (Pro)

Os teores de prolina foram determinados pela adaptação do método de Bates et al., (1973). Utilizou-se 200 mg de material seco de raiz e de folha, utilizando-se a

folha +2 segundo critério de Kuijper (1915). A extração foi realizada em banho-maria a 100°C, por 30 min, homogeneizando as amostras em 5 mL de água destilada. Após centrifugação a 700 g, por 20 minutos, o sobrenadante foi coletado e deste foi utilizado uma alíquota de 1 mL para a quantificação de prolina, iniciada pela adição de 1 mL de ninhidrina ácida e 1 mL de ácido acético glacial 99,5%. A mistura foi agitada e incubada a 100ºC por 1 hora. As amostras foram resfriadas em banho de gelo. Após o resfriamento foram adicionados 2 mL de tolueno para a separação das fases. A fração contendo grupo cromóforo foi coletada e a absorbância determinada a 520 nm em espectrofotômetro (Beckman DU 640). A concentração de prolina foi determinada por meio de uma curva de calibração de prolina e o resultado expresso em mmoL prolina g-1 de massa de matéria seca (MS).

2.3.2. Glicina betaína (GB)

A quantificação de GB foi determinada segundo o método de Grieve & Grattan (1983). As amostras de raiz e folha (folha +2 segundo critério de Kuijper, 1915) de 500 mg foram maceradas em 2 mL de água destilada sob agitação constante, à temperatura ambiente, por um período de 4 horas, seguindo de centrifugação a 3.500 g por 10 minutos, a 25ºC. O sobrenadante foi coletado e dele retirado uma alíquota de 250 μL para a quantificação de glicina betaína. Para tanto, 250 μL de ácido sulfúrico concentrado foi adicionado a cada amostra, seguindo de incubação em banho de gelo por 1 hora. Após esse tempo, 200 μL de iodeto de potássio (à aproximadamente 8°C) foram adicionados e a mistura incubada por 16 horas a 0ºC. Após este período, as amostras foram centrifugadas a 3.500 g, por 15 minutos a 0ºC e o resíduo coletado. Este foi lavado por duas vezes em 2 mL de ácido sulfúrico 1 N (à aproximadamente 8°C) e após centrifugação a 3.500 g, por 5 minutos a 0 ºC, o precipitado dissolvido em 3 mL de 1,2-dicloroetano, por meio de agitação vigorosa. Após 2 horas e 30 minutos de repouso, foi realizada a leitura da absorbância das amostras em 365 nm, mediante espectrofotômetro (Beckman DU

640). Para os cálculos foi utilizada uma curva padrão de glicina betaína. Os resultados foram expressos em mg glicina betaína g-1 _MS.

2.3.3. Sacarose (Sac)

O conteúdo de sacarose foi aferido de acordo com Van Handel (1968). A extração foi realizada com 50 mg de material liofilizado de folha (folha +2 segundo critério de Kuijper, 1915) e 1,5 mL de solução M:C:W (metanol: clorofórmio: água 12:5:3 v/v) colocados em “eppendorfs”. Procedeu-se com agitação a 25 ºC, por 30 min e após homogeneizado o material foi centrifugado a 10.000 g, por 10 min, coletando-se o sobrenadante. O resíduo foi extraído pela segunda vez nas e realizado novamente o mesmo procedimento. Os sobrenadantes foram então reunidos para a obtenção do extrato total. Após a extração,foram adicionados 2 mL do extrato em tubos de ensaio com 0,5 mL de clorofórmio e 0,75 mL de água. Os tubos foram centrifugados a 2.000 g, por 10 min, para a separação da fase aquosa. Posteriormente, a fração aquosa metanólica foi coletada e transferida para banho- maria a 35 ºC, por 30 min., para a evaporação do clorofórmio residual. A partir da fase aquosa foi realizada a dosagem da sacarose. Em tubos de ensaio foram adicionados 0,1 mL da fração aquosa e 0,1 mL de KOH 30% e aquecidos em banho- maria a 100 ºC, por 10 min. Após o resfriamento foram adicionados aos tubos 3 mL de antrona (antrona 0,2% em ácido sulfúrico), levando-os ao banho-maria a 40 ºC, por 20 min. As leituras foram realizadas em espectrofotômetro a 620 nm.

2.4. Potencial hídrico foliar

O Ψw foliar foi determinado segundo Scholander (1956), utilizando-se uma

câmara de pressão modelo m670 (Pms Instrument Co., Albany, USA), nas folhas +2 KUIJPER, 1915), entre 04h 30min e 05h 30min.

2.5. Peroxidação lipídica

2.5.1. Ácido malondialdeído (MDA)

O conteúdo de MDA foi determinado estimando-se as substâncias reativas ao ácido 2-tiobarbitúrico (TBA) e expresso em equivalentes de aldeído malônico (MDA) (CAKMAK; HORST, 1991). O tecido foliar (0,25 g) foi macerado na presença de nitrogênio líquido e homogeneizado com 0,1% (p/v) de ácido tricloroacético (TCA) e 20% de insolúvel polivinilpirrolidona. O homogenato foi centrifugado a 15000 x g por 15 min a 4°C. Foi adicionada uma alíquota de 0,5 mL do sobrenadante a 1,5 mL de 0,5% de ácido 2-tiobarbitúrico (TBA) (preparado em 20% de TCA). As amostras foram homogeneizadas e a reação colorimétrica foi conduzida a 90 °C por 20 min após incubação em banho-maria. A seguir, as amostras foram imersas em banho de gelo e clarificadas através de centrifugação a 15000 x g por 15 min a 4 °C. A absorbância das amostras foi lida a 532 nm e a absorbância inespecífica (660 nm) descontada, em espectrofotômetro (modelo Beckman DU 640, USA). A peroxidação de lipídios foi estimada como conteúdo total de substâncias reativas ao TBA e expressa como equivalentes de MDA. Os resultados foram expressos em nmol de MDA g-1 _MF.

2.5.2. Peróxido de hidrogênio (H2O2)

O teor de H2O2 foi determinado de acordo com Gay et al. (1999). As folhas

foram homogeneizadas em metanol (5: 1, volume de tampão: massa fresca) e centrifugou-se a 10.000 rpm durante 5 min. A absorbância foi lida a 560 nm e o conteúdo de H2O2 foi determinado usando uma curva padrão.

2.6. Teores de clorofilas e rendimento quântico do fotossistema II (Fv/Fm)

Os teores de clorofila foram mensurados pelo método indireto de cor verde, utilizando-se um medidor portátil, modelo SPAD-502 (Soil and Plant Analysis Development), da MinoltaCo e o rendimento quântico do FSII (Fv/Fm), mensurado in vivo, após as folhas serem adaptadas ao escuro por meia hora, usando um portátil fluorômetro, modelo OS-30p (Opti-Science, USA), ambos na folha +1 (KUIJPER, 1915).

2.7. Crescimento das plantas jovens

A altura das plantas foi medida pela maior folha totalmente esticada. A área foliar e densidade de raízes foram aferidas após a separação das partes vegetativas, utilizando-se o sistema de analise de imagem Delta–T Devices LTD e a massa seca total de parte aérea e raiz foi obtida após secagem em estufa de ventilação forçada à temperatura de 65 ºC até peso constante.

2.8. Análises estatísticas

A análise estatística dos dados foi realizada pelo software estatístico AgroStat (BARBOSA; MALDONADO JÚNIOR, 2011). Os dados foram submetidos à análise de variância pelo teste F e as diferenças significativas entre os tratamentos foram comparadas pelo teste Tukey a 5% de probabilidade.