UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP
CÂMPUS DE JABOTICABAL
ESTRESSE SALINO EM PLANTAS JOVENS DE
CANA-DE-AÇÚCAR: RESPOSTAS BIOQUÍMICAS E FISIOLÓGICAS
Denise Aparecida Chiconato
Bióloga
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP
CÂMPUS DE JABOTICABAL
ESTRESSE SALINO EM PLANTAS JOVENS DE
CANA-DE-AÇÚCAR: RESPOSTAS BIOQUÍMICAS E FISIOLÓGICAS
Denise Aparecida Chiconato
Orientadora: Profa. Dra. Durvalina Maria Mathias dos Santos
Coorientadora: PhD Rana Munns
2016
Chiconato, Denise Aparecida
C533e Estresse salino em plantas jovens de cana-de-açúcar : respostas bioquímicas e fisiológicas / Denise Aparecida Chiconato. – – Jaboticabal, 2016
xix, 89 p. : il. ; 28 cm
Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, 2016
Orientador: Durvalina Maria Mathias dos Santos
Banca examinadora: Raffaella Rossetto, Jose Antonio Proença Vieira de Moraes, Priscila Lupino Gratão, Arthur Bernardes Cecílio Filho
Bibliografia
1. Fotossíntese. 2. NaCl. 3. Osmoprotetores. 4. Peroxidação lipídica. 5. Redutase do nitrato. 6. Saccharum spp. I. Título. II.
Jaboticabal-Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias.
CDU 631.92:633.61
DADOS CURRICULARES DA AUTORA
“Eu sou um intelectual que não tem medo de ser amoroso.
Amo as gentes e amo o mundo. E é porque amo as pessoas
e amo o mundo que eu brigo para que a justiça social se
implante antes da caridade.”
- Paulo Freire -
“A principal meta da educação é criar homens que sejam
capazes de fazer coisas novas, não simplesmente repetir o que
outras gerações já fizeram. Homens que sejam criadores,
inventores, descobridores. A segunda meta da educação é formar
mentes que estejam em condições de criticar, verificar e não
aceitar tudo que a elas se propõe.”
- Jean Piaget -
“Não haverá borboletas se a vida não passar por longas e silenciosas
metamorfoses.”
Aos meus pais, Cleso e Maria, que mesmo com dificuldade, mesmo não concordando, sempre estiveram ao meu lado
me apoiando e batalhando para que meus sonhos se tornassem realidade...
A minha irmã Daniele, que igualmente aos meus pais, sempre esteve ao meu lado torcendo por mim...
DEDICO
A todos que, assim como eu, admiram a beleza da vida e da natureza, em especial, o fascinante e misterioso mundo das plantas...
AGRADECIMENTOS
A Deus, por essa força que eu nem mesmo entendo, mas sinto comigo em todos os momentos da minha vida;
A Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – UNESP, seus funcionários e professores, que me acolheram como uma verdadeira família nesses oito anos que passei aqui;
A Capes, pela concessão de bolsa de Doutorado e de Doutorado Sanduiche no exterior;
A minha orientadora profa. Dra. Durvalina Maria Mathias dos Santos, pela brilhante orientação, pelos conselhos, carinho e por ter tornado este trabalho o melhor possível;
A minha coorientadora Dra. Rana Munns do CSIRO – Austrália, pelos valiosos conselhos e dicas neste trabalho, bem como pelo acolhimento e prontidão em ajudar;
Ao professor Dr. João Antonio Galbiatti que começou esta etapa ao meu lado, foi meu orientador de Mestrado e Iniciação Científica, lutou para meu crescimento pessoal e profissional, me deu segurança, amizade e me ajudou a trilhar boa parte do caminho até chegar aqui e foi fundamental a todo esse processo;
Ao CSIRO – Austrália e toda a equipe que foi minha família fora do Brasil, em especial, Richard James, Carol Blake, Gonzalo Estavilo, por todos os ensinamentos, conselhos e amizade. Aos amigos que fiz lá, brasileiros, argentinos, ingleses, australianos, asiáticos, europeus, americanos... que me acolheram tão bem! Fabi, Alex, Rosangela, Jeremy, Lucy, Asty, Macarena, Sarah, Azzie, Retika, Katherine, Allan, Adinda;
Aos professores Dra. Priscila L. Gratão, Dr. Pedro Luís da Costa Aguiar Alves e Dr. Eduardo Gasparino do Dep. de Biologia; Dr. Tiago S. Balbuena do Dep. de Tecnologia; Dr. Renato de Mello Prado do Dep. de Solos; Dr. Arthur Bernardes Cecilio Filho do Dep. de Produção Vegetal, por todo apoio desde a minha chegada à Unesp e ao Departamento de Biologia, bem como pelas valiosas dicas no meu trabalho e na vida;
Aos professores Dr. Pedro L. C. A. Alves, Dr. Rogério Faleiros Carvalho, Dr. Rinaldo de Paula e Dr. Davi Rodrigo Rossato pelo empréstimo de materiais;
Ao professor Dr. Francisco Monteiro da ESALQ-USP Piracicaba, pela realização de análises;
Aos professores de fora que fizeram parte da banca de tese, Dra. Raffaella Rossetto e Dr. José Antonio Proença Vieira Moraes, pela excelente avaliação e dicas;
Aos queridos funcionários do Dep. de Biologia, Sonia Maria Raymundo Carregari e Jamil Ferraz, que me ajudaram exaustivamente no desenvolvimento de experimentos, amizade, torcida e orações;
Ao amigo Flávio José Rodrigues Cruz que foi meu companheiro ao longo de todo o Doutorado, me ajudou tanto no experimento quanto na vida, esteve presente em todas as etapas, seja no laboratório, na casa de vegetação, nos almoços ou nos cafezinhos na cantina;
Aos amigos do Laboratório de Plantas Daninhas (LAPDA): Wendy (por toda força e carinho), Willians, Ana, Anne, Andreísa, Gianmarco, pela animação no whats e nas folgas;
Aos amigos e funcionários do Dep. de Engenharia Rural, onde iniciei o Doutorado;
Ao pessoal do Dep. de Tecnologia, Edwin, Bruna, Fernanda, Marilia, Gabi, por todo apoio e amizade;
A minha “best” Adriana Castro, que foi um presente do Doutorado e que vai ficar para sempre, independentemente da distância;
As amigas da República Abduzidas, onde passei parte da minha vida em Jaboticabal, as que se foram, as que permaneceram e as que estão sempre presentes. Papete, que continuamos juntas após a saída da Rep. Taxinha, que esteve presente na etapa seguinte e em todas as possíveis. Porka, que mesmo distante se faz presente. Jú, Cidynha, Traçada... e as queridas amigas que permaneceram: Aotra, companheira, com seu jeitinho calmo. Maloca, amiga-irmã desde o início até o final, que nunca me deixou e sempre está por perto me dando força e carinho. Bici e as quartas no bar do tão, saudades;
A todos os amigos que “Jabuka” me trouxe, provavelmente esquecerei alguns, mas os de sempre/para sempre: Bruna Brancalion, Ku-baxo, Mutchatcha, Kicada, Saulo Strazeio... obrigada pela amizade;
Aos amigos que Taquaritinga me trouxe e permaneceram: Fabiana de Simoni (pela força no início de tudo), Mateus, Talita, Daiane, Norte, Artur, Simony, Nathalia, Felipe;
A Rep. As Coyotes, que me acolheu e, em especial, as amigas sempre tão dispostas a ajudar: Du-fluxo, Pau-mirinha, Garrafinha, Guariroba, muito obrigada;
Aos admiráveis professores da E.E. Victor Maida que estiveram ao meu lado durante toda essa fase, em especial, a “esquerda marxista” Marina, Samanta, Welton;
Aos amigos de Ibitinga, aos que estão sempre presentes. Thales, Xt, Laís, Pina, Du, Joyce, Mura, Sandra, Tabaco, Conrado, Ciça... pela amizade, apoio e animação aos finais de semana e ao Felipe pela torcida e inspiração, mesmo distante;
As irmãs de coração Alessandra e Amélia, por toda a amizade ao longo destes vários anos, desde sempre a para sempre!!!;
A toda minha família, alguns distantes outros mais próximos, mas com a mesma importância. Em especial, aos meus pais Cleso e Maria, minha irmã Daniele, meu irmão Zé Maria e vó Ana, e aos pets Pitty e Gaia por todo o amor;
Todos vocês foram essenciais para a conclusão de mais esta fase. Sozinha eu não teria conseguido. Pelo menos não tão bem e nem tão feliz...
SUMÁRIO
Página
RESUMO... iii
ABSTRACT... iv
CAPÍTULO I – CONSIDERAÇÕES GERAIS... 1
1. INTRODUÇÃO... 1
2. OBJETIVO... 2
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA... 3
3.1. Cana-de-açúcar: cenário atual e salinidade... 3
3.2. Estresse salino... 5
3.3. Sódio (Na+) e Potássio (K+)... 8
3.4. Osmólitos compatíveis... 10
3.4.1. Prolina (Pro)... 10
3.4.2. Glicina betaína (GB)... 12
3.4.3. Sacarose (Sac)... 13
3.5. Atividade da enzima redutase do nitrato (RN)... 14
3.6. Peroxidação lipídica... 16
3.7. Trocas gasosas... 17
REFERÊNCIAS... 20
CAPÍTULO 2 – OSMÓLITOS COMPATÍVEIS, PEROXIDAÇÃO LIPÍDICA E CRESCIMENTO EM PLANTAS JOVENS DE CANA- DE-AÇÚCAR SOB ESTRESSE SALINO... 31
1. INTRODUÇÃO... 33
2. MATERIAL E MÉTODOS... 35
2.1. Delineamento experimental, adubação e salinização do solo... 35
2.2. Teores foliares e de raiz de Na+e K+... 36
2.3. Osmólitos compatíveis... 36
2.3.1. Prolina (Pro)... 36
2.3.2. Glicina betaína (GB)... 37
2.3.3. Sacarose (Sac)... 38
2.4. Potencial hídrico foliar... 38
2.5. Peroxidação lipídica... 39
2.5.1. Ácido malondialdeído (MDA)... 39
2.5.2. Peróxido de hidrogênio (H2O2)... 39
2.6. Teores de clorofilas e rendimento quântico do fotossistema II (Fv/Fm)... 40
2.7. Crescimento das plantas jovens... 40
2.8. Análises estatísticas... 40
3. RESULTADOS... 41
3.1. Teores de Na+ e K+ em folhas e raízes... 41
3.2. Osmólitos compatíveis: Pro, GB e Sac... 45
3.3. Potencial hídrico (Ψw)... 45
3.4. Peroxidação lipídica: MDA e H2O2... 50
3.5. Teor de clorofilas e rendimento quântico do FSII (Fv/Fm)... 50
3.6. Crescimento de plântulas... 53
4. DISCUSSÃO... 56
5. CONCLUSÕES... 61
REFERÊNCIAS... 62
CAPÍTULO 3 – TROCAS GASOSAS EM PLANTAS JOVENS DE CANA-DE- AÇÚCAR SOB ESTRESSE SALINO... 69
2. MATERIAL E MÉTODOS... 72
2.1. Delineamento experimental e adubação... 72
2.2. Salinização do solo... 73
2.3. Trocas gasosas: fotossíntese (A), condutância estomática (gs), transpiração (E) e Ci (CO2 intracelular)... 74
2.4. Crescimento das plântulas (massa seca e área foliar)... 74
2.5. Atividade da enzima redutase do nitrato... 75
2.6. Teores foliares de Na+... 75
2.7. Aferição indireta dos teores de clorofila... 75
2.8. Eficiência fotoquímica do FSII (Fv / Fm)... 76
2.9. Potencial hídrico foliar (Ψw)... 76
2.10. Análise estatística... 76
3. RESULTADOS... 77
3.1. Trocas gasosas: fotossíntese (A), condutância estomática (gs), transpiração (E) e Ci (CO2 intracelular)... 77
3.2. Crescimento das plântulas (massa seca e área foliar)... 77
3.3. Atividade da enzima redutase do nitrato ... 81
3.4. Teores foliares de Na+... 81
3.5. Clorofila, Fv/Fm e Ψw... 81
4. DISCUSSÃO... 83
5. CONCLUSÕES... 85
ESTRESSE SALINO EM PLANTAS JOVENS DE CANA-DE-AÇÚCAR: RESPOSTAS BIOQUÍMICAS E FISIOLÓGICAS
RESUMO – A cana-de-açúcar é uma cultura mundialmente importante. O Brasil é o maior produtor mundial de cana-de-açúcar e se destaca na comercialização e exportação de açúcar e etanol originados a partir desta cultura. Os diferentes estresses abióticos alteram negativamente o desenvolvimento das plantas e, entre os estresses, a salinidade de solos se apresenta pela grave redução de produtividade, sendo o principal fator estressante em regiões de clima árido e semiárido. Este trabalho objetivou verificar os efeitos do NaCl sobre o desenvolvimento de plantas jovens de cana-de-açúcar, cultivares SP 81-3250 e IAC 87-3396, mediante o estudo de variáveis fisiológicas-bioquímicas: (I) os osmoprotetores prolina, glicina betaína e sacarose, (II) a ocorrência de alterações nutricionais pela relação Na+/K+, (III) a peroxidação lipídica (IV) a influência do NaCl
na atividade da enzima redutase do nitrato; (V) o efeito do estresse salino nas trocas gasosas; (VI) o crescimento de parte aérea e raízes das diferentes cultivares de cana-de-açúcar sob estresse salino. Para tanto, foram utilizadas quatro concentrações de NaCl (0, 40, 80 e 160 mM) e realizadas as seguintes avaliações: teores de Na+ e K+ nas folhas e raízes, os osmólitos compatíveis prolina, glicina betaína e sacarose, potencial hídrico, a peroxidação lipídica, atividade da enzima redutase do nitrato, trocas gasosas, clorofilas totais, rendimento quântico do FSII e crescimento de parte aérea e raiz aos 15 e 30 dias de desenvolvimento após aplicação do estresse. A partir dos resultados, observou-se maior suscetibilidade das plantas da cv. IAC 87-3396 pelo maior acúmulo de Na+ e relação Na+/K+, maior
peroxidação lipídica pelo acúmulo de MDA e maior efeito negativo sobre as trocas gasosas. Ambas as cultivares apresentaram acúmulo de prolina sob estresse, porém, plantas da cv. SP 81-3250 apresentaram, além de mais rápido acúmulo deste aminoácido, menor peroxidação lipídica e crescimento superior. Sob estresse salino severo a cv. IAC 87-3396 apresenta maior suscetibilidade.
SALT STRESS IN YOUNG SUGARCANE PLANTS: BIOCHEMICAL AND PHYSIOLOGICAL RESPONSES
ABSTRACT – Sugarcane is a globally important crop. Brazil is the largest producer of sugarcane and stands out in the marketing and exportation of sugar and ethanol derived from this culture. The various abiotic stresses adversely change plant growth and between the stresses, soil salinity is presented by the severe reduction in productivity, it is the main stressor in arid and semi-arid climates. This study aimed to verify the effects of NaCl on the development of sugarcane young plants, SP 81-3250 and IAC 87-3396 cultivars, through the study of physiological-biochemical variables: (I) the osmoprotectors proline, glycine betaine and sucrose, (II) the occurrence of nutritional changes the ratio Na+/K+ (III) lipid peroxidation (IV) effect of NaCl in the activity of nitrate reductase enzyme; (V) the effect of salt stress on gas exchange; (VI) the growth of shoots and roots of the sugarcane cultivars under salt stress. Thus, it was used four concentrations of NaCl (0, 40, 80 and 160 mM) and made the following assessments: Na+ and K+ accumulation in the leaves and roots, compatible osmolytes: proline, glycine betaine and sucrose, water potential, peroxidation lipid, activity of nitrate reductase enzyme, gas exchange, total chlorophyll, quantum yield of PSII and shoot and root growth at 15 and 30 days of development after stress application. The results showed higher susceptibility of the cv. IAC 87-3396 by higher accumulation of Na+ and Na+/K+ ratio, increase in lipid peroxidation by MDA accumulation and greater negative effect on gas exchange. Both cultivars showed proline accumulation under stress, however, the cv. SP 81-3250 showed in addition faster accumulation of this amino acid, reduced lipid peroxidation and higher growth. Under severe salt stress cv. IAC 87-3396 is more susceptible.
CAPÍTULO I – CONSIDERAÇÕES GERAIS
1. INTRODUÇÃO
A cana-de-açúcar (Saccharum spp.) se destaca pela sua importância e
grande influência no agronegócio brasileiro uma vez que, além da produção em larga escala de etanol e açúcar, e vem sendo conhecida e utilizada como uma cultura que causa menor impacto ambiental pela substituição dos combustíveis fósseis e, ainda, pelo aproveitamento de seus resíduos, como a vinhaça, torta de filtro e bagaço. O Brasil é o maior produtor mundial de cana-de-açúcar, sendo São Paulo o estado que lidera esta produção. A utilização da cultura é crescente ao longo dos anos, conduzindo a expansão da sua produção em ambientes que não são propícios ao seu cultivo e a preocupação em se estudar e mitigar/amenizar os efeitos causados. Entre estes ambientes, salientam-se aqueles que causam estresses abióticos nas plantas, como o estresse por temperatura, o estresse hídrico e o estresse salino.
O estresse salino é um dos mais importantes estresses abióticos que causam diminuição de produção e rendimento das culturas (PATADE et al., 2011; JAMES et al., 2012) e ocorre, basicamente, de duas formas (MUNNS; TESTER, 2008). A salinidade pode causar deficiência hídrica por diminuir o potencial da água no solo e pela absorção de íons tóxicos, como o Na+. As plantas apresentam tolerância ao sal
funções de proteção à membrana plasmática, como antioxidantes e na manutenção das quantidades de carbono e nitrogênio em plantas que estão se recuperando do estresse (GUPTA; HUANG, 2014). A planta desencadeia outras reações pelo estresse salino na tentativa de diminuir os danos causados e, nesta fase, pode haver diminuição ou aumento da atividade de algumas enzimas, tanto as fundamentais ao metabolismo, quanto as antioxidantes, quando o estresse intensifica a produção de radicais livres. E, neste estágio, pode estar ocorrendo uma série de reações, como a peroxidação lipídica e o extravasamento de eletrólitos. O estresse salino reflete diretamente no processo fotossintético, com consequentes perdas de crescimento e produtividade (MUNNS, 2011).
Por todas estas modificações celulares que ocorrem nas plantas sob estresse é de grande importância o estudo da fisiologia do metabolismo vegetal, de modo a entender como o estresse ocorre e quais suas consequências, uma vez que cada espécie pode responder de forma distinta. O conhecimento de possíveis indicadores fisiológicos contribui com a seleção de cultivares mais tolerantes e com programas de melhoramento genético da cana-de-açúcar.
2. OBJETIVOS
Os objetivos deste estudo foram verificar:
(I) O acúmulo dos osmólitos compatíveis prolina, glicina betaína e sacarose;
(II) A ocorrência de alterações nutricionais pela relação Na+/K+,
(III) A peroxidação lipídica pelo conteúdo de ácido malondialdeído e peróxido de hidrogênio;
(IV) A influência do NaCl na atividade da enzima redutase do nitrato; (V) O efeito do estresse salino nas trocas gasosas;
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1. Cana-de-açúcar: cenário atual e salinidade
A cana-de-açúcar (Saccharum spp.) é uma Magnoliophyta, da ordem
Cyperales, família Poaceae, do gênero Saccharum, com algumas espécies
conhecidas e, entre estas, diversas cultivares. A cultura é cultivada em diversos países, tendo o Brasil como o maior cenário produtivo.
Antigamente relacionada à escravidão e monocultura, atualmente a cana-de-açúcar associa-se fortemente ao menor impacto ambiental, principalmente, no que tange ao desenvolvimento de energias renováveis. A cultura se destaca no cenário agrícola pelos seus produtos altamente comercializáveis, sendo considerada uma das principais “commodities” agrícolas em todo o mundo (GUERZONI et al., 2014). Ainda, se apresenta pela sua capacidade de renovação, com o aproveitamento de seus resíduos e a utilização do álcool como combustível renovável, o que demonstra que a cultura está relacionada tanto para a economia, como para a redução do impacto ambiental do sistema de produção. O etanol tem sido utilizado como combustível renovável visando substituir, em partes ou totalmente, o uso de combustíveis fósseis, como a gasolina. Estes fatores induzem a um aumento da produção de cana-de-açúcar, o que demanda o desenvolvimento de tecnologias e meios de se cultivar em diversos tipos de ambientes.
no que se refere à expansão da produção de cana-de-açúcar, tanto no Brasil quanto no mundo, pela grande área atingida pela salinidade.
O Brasil se destaca pela produção de cana-de-açúcar, sendo que o maior produtor é o estado de São Paulo. A produção de cana no Brasil se mantém crescente ao longo dos anos (Figura 1).
Figura 1. Produção brasileira de cana-de-açúcar (2001-2013). Fonte: Adaptado de UDOP, 2015.
Apesar de não ser o maior produtor mundial de etanol, perdendo para os EUA, o Brasil é o país que produz com menor impacto ambiental, uma vez que a energia gerada para a produção do etanol vem da biomassa do bagaço da cana, enquanto nos EUA a produção vem do milho e a energia requerida não é de origem renovável (FURTADO et al., 2011). No Brasil, a cana-de-açúcar é responsável por 17,5% da energia primária do país (MANTOAM et al., 2014).
No sudeste brasileiro, onde estão as maiores produções da planta, não é comum apresentar solos com problemas de salinidade, porém, esses tipos de solo estão presentes em larga escala em áreas do nordeste brasileiro, bem como em diversos países, como a Austrália, Índia, China, etc.
A cana-de-açúcar é uma glicófita (SENGAR et al., 2013; KUMAR et al., 2014), sendo, assim, pouco tolerante à salinidade de solos. As fases iniciais, tais como
0 100.000.000 200.000.000 300.000.000 400.000.000 500.000.000 600.000.000 700.000.000
germinação e na planta jovem, os sintomas do estresse são mais severos e nestas fases a planta apresenta maior sensibilidade (SENGAR et al., 2013). A salinidade atinge as plantas de cana-de-açúcar em crescimento e desenvolvimento e, ainda, reduz o conteúdo de sacarose nos colmos (GUERZONI et al., 2014). Estas plantas que são mais sensíveis à salinidade podem apresentar mecanismos de tolerância mais fracos, com consequente retardo no crescimento e maiores perdas de produtividade que as plantas halófitas, aquelas tolerantes à salinidade (CHA-UM; KIRDMANEE, 2009).
Sengar et al. (2013) relatam perdas de até 40% na produtividade de cana-de-açúcar na Índia devido a salinidade de solos. Cha-Um e Kirdmanee (2009) encontraram efeitos mais prejudiciais na fisiologia e crescimento de cana-de-açúcar quando submetidas ao estresse salino que em condições de deficiência hídrica, pela diminuição de clorofilas e carotenóides, com consequentes prejuízos na fotossíntese e desenvolvimento das plantas.
3.2. Estresse salino
A salinidade dos solos, com consequente prejuízo às culturas, pode ocorrer tanto de forma natural pela constituição geológica do solo, quanto de forma antropogênica. Um exemplo da salinidade natural são as plantações próximas às costas marítimas, onde a água do mar leva o sal ao solo. Há mais de 800 milhões de hectares de solo em todo mundo atingidos pela salinidade, sendo que a causa pode estar relacionada ao intemperismo físico e químico de rochas, materiais geológicos e biológicos, chuvas, bem como pelas atividades humanas (RENGASAMY, 2010).
e indiretamente, efeitos prejudiciais para as plantas pelos desequilíbrios fisiológicos (MUNNS, 2002) e atinge a maioria das culturas por serem sensíveis a altas concentrações de sais no solo (HASANUZZAMAN et al., 2014). A chuva e o vento exercem papel importante no carregamento de sais das águas oceânicas e, consequentemente, o seu acúmulo, sendo o cloreto de sódio (NaCl) o sal mais solúvel e abundante (MUNNS; TESTER, 2008). Quanto mais distante da costa menor a quantidade de sais dissolvidos na água da chuva (variando de 6 a 50 mg kg-1 de NaCl). Ainda, o agravamento do aquecimento global por causar aumento do nível de mares e tempestades, contribui para o depósito de sal no solo próximo a costas (JAMES et al., 2012). No entanto, um grande problema na agricultura e no que tange a interferência antropogênica, está relacionado à água de irrigação com alto acúmulo de sais. A qualidade da água de irrigação, principalmente em regiões semiáridas e áridas, é muito pobre, e, quando não é possível descarregar esses sais em um sistema de drenagem, eles rapidamente podem se tornar prejudiciais a espécies sensíveis (RENGASAMY, 2002). Estima-se que o sal atinja um terço de água irrigada no planeta (TAIZ; ZEIGER, 2013) e, em relação a terras agricultáveis, cerca de 2 milhões de km2 é atingido pela salinidade em todo o mundo (NEVES et
al., 2010). Por isso, a salinidade é um dos estresses mais estudados, tanto pela grande área atingida quanto pelos efeitos causados nas culturas, como os efeitos iônicos, osmóticos, desequilíbrios nutricional e hormonal e produção de espécies reativas de oxigênio (ASHRAF, 2009).
A tolerância a salinidade está comumente associada a tolerância à seca, uma vez que a alta concentração de sódio no solo inibe a absorção de água pela planta induzindo a deficiência hídrica (PLAZEK et al., 2013). O prejuízo na absorção de água é um dos fatores mais importantes no que se refere ao prejuízo do crescimento das plantas sob solos salinos (BHATT et al., 2008), estando diretamente relacionado à fotossíntese, ou seja, plantas sob estresse diminuem a capacidade fotossintética, bem como o crescimento (KUMAR et al., 2014). Os prejuízos na taxa fotossintética ocorre, principalmente, pela diminuição da área foliar da planta, redução dos teores de clorofilas e condutância estomática, além de prejudicar a eficiência do fotossistema II (FSII) (SENGAR et al., 2013). A planta responde rapidamente em situação de estresse salino de forma a fechar seus estômatos na tentativa de amenizar a perda de água (JAMES et al, 2002). Ainda, pode haver aumento na produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), desidratação celular, prejuízo na fotossíntese e redução no desenvolvimento das folhas (PLAZEK et al, 2013). Além dos efeitos de diminuição na absorção de água pela planta, a toxicidade por íons pode causar diminuição na absorção de nutrientes (DEINLEIN et al., 2014; RODRIGUES et al., 2014).
Plantas submetidas ao estresse salino iniciam mecanismo de ajuste osmótico para manter a turgidez das células, o que causa o crescimento lento das plantas estressadas (GUERZONI et al., 2014). Este ajuste pode ser realizado por alguns compostos que as plantas comumente produzem em situação de estresse, entre eles a prolina, glicina e glicina betaína. Algumas vezes, os sintomas podem se confundir e não permitir o diagnóstico exato, impossibilitando afirmar se o estresse está alterando o potencial hídrico devido à toxicidade (GANDONOU et al., 2011).
O estudo da salinidade de solos é importante, principalmente, por dois fatores: a possibilidade do cultivo em ambientes de desertos salinos e para o entendimento dos mecanismos que a planta utiliza para tolerar o estresse salino (BHATT et al., 2008), de forma a conhecer indicadores para a seleção e o melhoramento de cultivares. Uma abordagem pertinente sobre estresse salino em plantas cultivadas deve ser feita relacionando os fatores fisiológicos, bioquímicos e moleculares, de forma a permitir a seleção de cultivares tolerantes ao sal (HASANUZZAMAN et al., 2014). Com o conhecimento dos fatores fisiológicos do estresse nas plantas é possível o desenvolvimento de ferramentas moleculares que podem ser utilizadas para identificar genes e/ou indicadores que facilitarão nos trabalhos de melhoramento genético (MUNNS, 2011).
O estresse salino conduz a redução de massa seca em plantas de milho, além de induzir mecanismos de ajuste osmótico, como a produção de prolina e glicina betaína (HAJLAOUI et al., 2010). Saadat e Homaee (2015), estudando níveis de salinidade em plantas jovens de sorgo (Sorghum bicolor L. Moench), encontraram
um limiar de salinidade de 1 dS m-1 para as plântulas sendo que em 11 dS m-1 o desenvolvimento apresentou redução de 50% nestas plantas. O estresse salino diminui drasticamente o crescimento do sorgo tanto de parte aérea quanto de raiz (TIGABU et al., 2013). Em cana-de-açúcar foi observada diminuição no conteúdo de clorofilas, seguida por aumento da fluorescência e queda de massa fresca nas plantas (WILLADINO et al., 2011).
3.3. Sódio (Na+) e Potássio (K+)
folhas quanto nas raízes (MAGGIO et al., 2007). Algumas glicófitas, plantas sensíveis à salinidade, acumulam o mínimo de Na+ e Cl-, podendo, também,
demonstrar menor sensibilidade ao acumular estes íons em seus tecidos ou compartimentalizar no vacúolo, sem prejuízos na produtividade (GANDONOU et al., 2011). O K+ é o cátion inorgânico mais abundante nas células vegetais que juntamente com o nitrogênio (N) e o fósforo (P) é fundamental para o rendimento das culturas (DREYER, 2014). O K+ é um nutriente de plantas que não faz parte da constituição de moléculas orgânicas, porém, está relacionado direta e indiretamente em processos bioquímicos e físicos, como na ativação de enzimas, principalmente, as de formação de amido (exigindo cerca de 50 mM de K+ para a sua atividade normal). Este nutriente também está relacionado com a manutenção do turgor celular, alongamento, osmorregulação, movimentos das folhas e de abertura e fechamento dos estômatos, tropismos, transporte de solutos no floema, balanço de íons, polarização da membrana e controle do pH, função e estrutura de cloroplastos, conservação de energia nas membranas (BENITO et al., 2014; SHABALA; POTTOSIN, 2014), sendo o seu equilíbrio intracelular de extrema importância para os vegetais manterem o metabolismo funcionando de forma eficiente (SHABALA; POTTOSIN, 2014). Um agravante do estresse salino causado por NaCl, portanto, é a competição de Na+ pelos mesmos sítios de absorção de nutrientes na membrana
plasmática e o K+ é o nutriente mais prejudicado neste processo por ambos serem
cátions monovalentes (DEINLEIN et al., 2014). Como o K+ é um dos principais
componentes celulares relacionados com o equilíbrio osmótico da célula e o estresse salino prejudica diretamente este equilíbrio, uma forma de suprir esta demanda é a produção de osmólitos compatíveis pelas plantas, como a prolina e a glicina betaína (SHABALA; POTTOSIN, 2014).
tolerância ao sal uma vez que plantas de sorgo tolerantes a salinidade apresentam maior relação que as plantas sensíveis.
3.4. Osmólitos compatíveis
Na tentativa de amenizar os efeitos prejudiciais do sal, as plantas podem produzir compostos que atuarão em diversas funções e entre elas está o ajuste osmótico, uma vez que altas concentrações de sal tendem a diminuir o potencial da água na planta, induzindo a diminuição da absorção e, consequentemente, deficiência de água. Estes compostos são conhecidos como osmólitos compatíveis, ou osmoprotetores, e entre eles estão os aminoácidos prolina, a amina quaternária glicina betaína e o dissacarídeo sacarose, e suas funções e formas de ação estão apresentadas nos tópicos abaixo.
3.4.1. Prolina (Pro)
compartimentalizado no vacúolo e citoplasma. No caso do vacúolo, a água pode ser compartimentalizada pelo princípio da osmose de forma a evitar a perda de água da célula, e o mesmo ocorre nos meios extra e intracelulares. A planta sob estresse salino tende a produzir este aminoácido na tentativa de ajustar osmoticamente suas células. Além desta função muito conhecida da prolina, ainda há outras sendo estudadas e comprovadas, como de antioxidante na eliminação de espécies reativas de oxigênio (SHARMA; DIETZ, 2006; TUTEJA, 2007), proteção da membrana plasmática e integridade de macromoléculas (VANRENSBURG et al., 1993; SILVEIRA et al., 2003; SHARMA; DUBEY, 2005) como fonte de carbono e nitrogênio (GUPTA; HUANG, 2014) e auxiliando no potencial redox, de transferência de elétrons, das células sob estresse (TUTEJA, 2007). Em halófitas, a prolina age diretamente na pressão osmótica, enquanto em glicófitas, este osmólito atua tanto nesta função quanto na estabilização da estrutura terciária de proteínas (PLAZEK et al., 2013).
Este aminoácido é produzido a partir do ácido glutâmico pela ação das enzimas pirrolina-5-carboxilato sintetase (P5CS) e pirrolina-5-carboxilato redutase, P5CR (DELAUNEY; VERMA, 1993). Sob estresse, a produção de prolina é aumentada na tentativa de suprir a necessidade de ajuste osmótico das plantas, bem como realizar as funções citadas anteriormente. Porém, se a planta começa a se recuperar o catabolismo é ativado e acarretará na degradação de prolina (SZABADOS et al., 2011)
controle e o tratamento com deficiência de água. O estresse salino reduz o crescimento e aumenta o teor de prolina em plantas de milho (MOLAZEM; AZIMI, 2015).
O aumento no acúmulo de prolina está associado aos estresses abióticos, bem como a outras substâncias, e a ação deste osmólito será evidenciada dependendo da espécie e cultivar analisada.
3.4.2. Glicina betaína (GB)
O estresse salino desencadeia respostas fisiológicas nas plantas, como a produção do osmólito compatível glicina betaína (GB). A GB é produzida na tentativa de controlar, dentro de certo limite, os efeitos negativos nas células vegetais, como a perda de água. Este osmólito é conhecido pela sua função de regulador osmótico, aumentando a capacidade das células em reter água sob estresses, sem causar prejuízos às plantas (MARTINO et al., 2003). A maioria das plantas produzem GB quando submetidas a estresses abióticos, mas não todas. Alguns mutantes podem expressar genes de produção deste aminoácido conferindo maior tolerância da planta às adversidades, sendo sua produção por meio da colina, pela ação das enzimas colina mono-oxigenase e enzimas betaína aldeído desidrogenase (TUTEJA, 2007)
e equilíbrio iônico (TUTEJA, 2007). Plantas de tabaco, trigo, cevada, soja e feijão, demonstraram melhor crescimento e desenvolvimento sob seca quando doses de GB exógenas foram aplicadas (ASHRAF; FOOLAD, 2007).
Muitos benefícios da produção de GB têm sido evidenciados em diversas plantas como o ajuste osmótico. Além disso, esta amina atua na proteção de enzimas como a RuBisCO e como antioxidante. Algumas plantas podem minimizar o efeito prejudicial do sal na parte aérea devido à produção de GB nas raízes, uma vez que esta amina quaternária pode promover maior produção de vacúolos nas raízes, fazendo com que o Na+ se acumule e não seja transportado para a parte aérea (ASHRAF; FOOLAD, 2007). No entanto, foi observado que em alguns casos a alta concentração de GB pode inibir o acúmulo de prolina e causar danos nos tecidos de folhas sob altas concentrações de GB exógena (AHMAD et al., 2013). Em gramíneas, muitas evidências mostram correlação entre o aumento de GB e a tolerância ao sal (SAKAMOTO; MURATA, 2000). Em até 213,9 mM de NaCl, Patade et al. (2008) encontram incremento de GB conforme aumentaram-se as concentrações deste sal.
Por estes motivos, os efeitos de GB vão depender da concentração aplicada e da resposta de diferentes tipos de plantas ao seu acúmulo (AHMAD et al., 2013).
3.4.3. Sacarose (Sac)
Sob diversos tipos de estresses abióticos como deficiência hídrica, altas temperaturas e salinidade, as plantas desenvolvem mecanismos fisiológicos para amenizar os efeitos prejudiciais e entre eles está a produção de osmólitos compatíveis, como açúcares, que podem se acumular promovendo ajuste osmótico e preservação energética na planta (SIRINGAM et al., 2011). Em detalhada revisão, Ashraf e Harris (2004) encontraram respostas à salinidade de diversas espécies em relação ao aumento/diminuição de açúcares; em Vitis vinífera observaram
diminuição de sacarose, sem aumento ou diminuição significante nos níveis de glicose; em Zygophyllum album houve aumento nos teores de sacarose, bem como
de glicose e frutose; em Lepidium crassifolium, aumento na produção de açúcares
solúveis. Em plantas de alfafa, houve aumento de sacarose e pinitol nas folhas, enquanto que em raízes, o açúcar mais acumulado foi o amido, sob estresse salino (BERTRAND et al., 2015).
Os compostos que atuarão como osmólitos compatíveis mais abundantes nas células vegetais são a prolina, glicina betaína e a sacarose, dependendo da espécie (MUNNS, 2011). Além de plantas, alguns estudos apontam a figuração deste açúcar como osmólito compatível em outras células. A cianobactéria Synechococcus
6311 submetida ao estresse salino por NaCl demonstrou osmorregulação iônica após a concentração de sacarose ter alcançado valor máximo após 16 horas de estresse e, após 40 horas, o acúmulo de K+ alcançou equilíbrio (BLUMWALD et al., 1983).
A sacarose, assim como prolina e glicina betaína, podem ser utilizadas como um indicadores de estresse salino em plantas, uma vez que as células podem produzir estas substâncias na tentativa de ajuste osmótico. Jouve et al. (2004) evidenciaram esse fato ao estudarem o acúmulo de alguns compostos considerados osmólitos compatíveis em plantas de Populus tremula L. sob salinidade. Neste
estudo, os autores não observaram variação na quantidade de ácido malondialdeído (MDA), concluindo a não existência de peroxidação lipídica, porém, o fator que esteve mais relacionado à tolerância da planta ao estresse salino foi o aumento da produção de sacarose juntamente com prolina, manitol, espermina e rafinose, demonstrando o efeito destes compostos como osmoprotetores de plantas, podendo ser usados como marcadores de tolerância ao estresse.
3.5. Atividade da enzima redutase do nitrato (RN)
consequentemente, a fotossíntese. Por este motivo, a estimativa da atividade desta enzima tem sido utilizada como indicador de estresse em plantas cultivadas. Após o carbono, hidrogênio e oxigênio, o elemento mais abundante nos vegetais é o nitrogênio (N) que, depois do K+, é nutriente mais absorvido pela cana-de-açúcar (COLETI et al., 2006).
O N é o elemento constituinte de moléculas orgânicas como aminoácidos, sendo estrutura de proteínas, além de pigmentos, vitaminas e ácidos nucléicos (DONATO et al., 2004; EPSTEIN; BLOOM, 2006; MOROZKINA; ZVYAGILSKAYA, 2007; TAIZ; ZEIGER, 2010). Essas características fazem com que o N seja fundamental ao desenvolvimento de qualquer planta e, para a cana-de-açúcar, o N é um elemento crucial em todo o ciclo da cultura desde a formação, passando pelo perfilhamento até o corte (CONTIN, 2007). Uma das formas preferenciais de absorção de N pelas plantas é a de nitrato (NO3-) que quando absorvido pelas raízes
deve ser convertido a amônio (NH4+). Neste processo, o NO3- é convertido em NO2-.
Ao final, NH4+ é combinado com compostos orgânicos formando aminoácidos
(MEGURO; MAGALHÃES, 1987; LAM et al., 1996; MORIKAWA et al., 2004; EPSTEIN; BLOOM, 2006; MOROZKINA; ZVYAGILSKAYA, 2007).
Sob estresses abióticos, como a salinidade, a enzima RN pode atuar como importante biomarcador da tolerância de plantas ao sal uma vez que sob estresse salino os vegetais tendem a diminuir a produção desta enzima, principalmente, pela baixa absorção de N (SINGH et al., 2015). Estes autores ainda encontraram que, sob este estresse, plantas de ervilha forrageira (Pisum sativum L.) apresentaram
3.6. Peroxidação lipídica
As espécies reativas de oxigênio (EROs) são produzidas pelas plantas em condições normais de crescimento e estão envolvidas na sinalização celular, porém, as plantas possuem mecanismos que mantém estas espécies sob controle (AHMAD et al., 2013). No entanto, sob estresse oxidativo, a produção aumenta e o controle das plantas passa ser insuficiente e as EROs a causarem danos. Alterações no sistema REDOX das células das plantas podem induzir a produção de compostos como o peróxido de hidrogênio (H2O2), ocasionando a peroxidação lipídica. O
estresse oxidativo está relacionado com todos os estresses abióticos que atingem as plantas, desenvolvendo-se a partir do acúmulo de EROS, o que acarretará em modificações químicas e fisiológicas (DEMIDCHIK, 2015) que alteram diversas biomoléculas, sendo os lipídios as mais prejudicadas. Os produtos da peroxidação lipídica são altamente reativos, podendo se ligar a biomoléculas como DNA e proteínas danificando-os irreversivelmente, causando prejuízos nas funcionalidades das células, tanto dentro quanto fora delas (DEL RIO et al., 2005). A oxidação lipídica origina diversos produtos secundários que agravam o dano oxidativo, entre eles o ácido malondialdeído (MDA), que é o principal e mais estudado produto da peroxidação lipídica (DEL RIO et al., 2005). O MDA é conhecido como um marcador molecular para designar peroxidação lipídica em células de plantas submetidas a diferentes estresses abióticos, entre eles, a salinidade (DAVEY et al., 2005). O H2O2
é produzido em plantas sob estresse oxidativo que pode ser causado por outros tipos de estresses, conduzindo a prejuízos na membrana plasmática das células, permitindo o extravasamento de eletrólitos (TUTEJA, 2007).
A produção de EROs pode acontecer nos cloroplastos, mitocôndrias e peroxissomas. Pode ocorrer formação de EROs nos cloroplastos uma vez que é local de produção de O2, molécula que pode receber elétrons e formar estas
H2O2 (GILL; TUTEJA, 2010). O H2O2 é um composto estável com relativa longa meia
vida e pode causar inativação de enzimas (GILL; TUTEJA, 2010) sendo, relativamente, pouco reativo quando comparado a outras EROs (GRATÃO et al., 2005). O estudo deste composto tem permitido o acesso a uma gama de informações para se entender o estresse oxidativo (DEMIDCHIK, 2015). A concentração deste elemento pode variar de 0,03 – 1µM (sem estresse) a 0.1 - 10µM (sob estresse), bem como a quantidade de dias que isso pode ocorrer, dependendo de uma série de variáveis (DEMIDCHIK, 2015).
A produção de EROs, além dos prejuízos às plantas citados anteriormente, também pode causar a morte celular programada de diferentes formas. A deficiência de K+, por exemplo, que pode ser causada e agravada em plantas sob salinidade, contribui para ativação de enzimas relacionadas a apoptose e interfere na atividade de enzimas que agem sobre o H2O2 (SHABALA; POTTOSIN, 2014). Nas plantas C4,
como a cana-de-açúcar, diferentemente das C3 que fotorrespiram e contribuem com a produção de EROS, a principal produção destas substâncias acontecerá na cadeia transportadora de elétrons dos cloroplastos (PETROV et al., 2015). E, no caso do estresse salino, o processo de morte celular pode estar associado ao desequilíbrio iônico pela alta de Na+ e diminuição de K+ (PETROV et al., 2015).
Khan et al. (2014) verificando os efeitos do estresse salino em plantas de
Vigna radiata L. observaram aumento de H2O2 em plantas submetidas a 100 mM de
NaCl. Karpe et al. (2012) encontraram incremento de MDA de até quase 60% em cana-de-açúcar, conforme aumentaram-se as concentrações de NaCl. Genótipos de cana-de-açúcar que mantém baixa peroxidação lipídica e alta estabilidade de membrana quando submetidos à salinidade podem ser considerados tolerantes (GOMATHI; RAKKIYAPAN, 2011).
3.7. Trocas gasosas
disso, os seres fotossintetizantes, em geral as plantas, algas e bactérias clorofiladas, retiram o CO2 da atmosfera transformando-o em alimento energético, a glicose, que
pode se acumular tanto na forma de amido como de sacarose em plantas de cana-de-açúcar. Muitos fatores controlam o processo fotossintético, entre eles a temperatura, luminosidade, quantidade de CO2 e disponibilidade de água.
Sob estresse salino, as plantas tendem ao desenvolvimento lento da área foliar, bem como a redução da condutividade estomática, limitando a taxa fotossintética (MUNNS, 2011). Além disso, estresses abióticos estão relacionados com mudanças na cinética da emissão na fluorescência da clorofila sendo que o conhecimento dessa resposta aliado ao conhecimento sobre a eficiência do fotossistema II (FSII) e assimilação de CO2 pelas plantas configura fonte de
informações acerca da tolerância das plantas aos estresses abióticos (BAKER & ROSENQVIST, 2004). A resposta fotossintética das plantas sob estresse é altamente complexa e a fotossíntese é um dos primeiros processos fisiológicos a ser alterado, porém, os diferentes tipos de plantas podem responder de diferentes formas, considerando-se o tempo de submissão ao estresse e a intensidade. Estas respostas podem acontecer de modo a diminuir o crescimento foliar e disparar o mecanismo de fechamento estomático na tentativa de diminuir a perda de água, com consequente diminuição na assimilação de CO2, e/ou produzindo osmólitos
compatíveis para o ajuste na absorção de água, transporte e acúmulo de íons (CHAVES et al., 2009).
Plantas C3 e C4 provavelmente respondem de formas distintas ao estresse salino uma vez que possuem mecanismos diferenciados de fotossíntese, principalmente, pela maior adaptação das plantas C4 em locais com condições adversas de desenvolvimento. Stepien e Klobus (2005) encontraram menor eficiência do PSII e na cadeia transportadora de elétrons em plantas de trigo e milho sob estresse salino. Porém, plantas de trigo foram mais prejudicadas que as de milho nesses parâmetros estudados. Em plantas jovens de mamoma (Ricinus communis L), submetidas ao estresse salino (30mM de NaCl), Pinheiro et al. (2008)
recuperados. Willadino et al. (2011) observaram relação entre a produção de massa seca, fluorescência e clorofilas com o aumento na concentração de sais no solo em cultivares de cana-de-açúcar; quanto maior a concentração dos sais menor produção de massa seca, maior fluorescência da clorofila a e diminuição no teor de
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CAPÍTULO 2 – OSMÓLITOS COMPATÍVEIS, PEROXIDAÇÃO LIPÍDICA E CRESCIMENTO EM PLANTAS JOVENS DE
CANA-DE-AÇÚCAR SOB ESTRESSE SALINO
RESUMO – Este trabalho objetivou verificar os efeitos do NaCl sobre o desenvolvimento de plantas jovens de cana-de-açúcar, das cultivares SP 81-3250 e IAC 87-3396, mediante o estudo de variáveis fisiológicas-bioquímicas: (i) os osmólitos compatíveis prolina, glicina betaína e sacarose; (ii) peroxidação lipídica; (iii) crescimento da parte aérea e das raízes. Para tanto, foram utilizadas quatro concentrações de NaCl (0, 40, 80 e 160 mM) e realizadas as seguintes avaliações: teores de Na+ e K+ nas folhas e raízes, potencial hídrico foliar, clorofilas totais, Fv/Fm, crescimento de parte aérea e raiz, os osmóltios compatíveis prolina, glicina betaína e sacarose e a peroxidação lipídica, em dois períodos de desenvolvimento (15 e 30 dias após aplicação do estresse). De acordo com os resultados, verificou-se maior acúmulo de Na+ em plantas da cv. IAC 87-3396, bem como maior relação Na+/K+. Ambas as cultivares apresentaram acúmulo de prolina sob estresse, porém,
plantas de SP 81-3250 apresentam, além de mais rápido acúmulo desse aminoácido, menor peroxidação lipídica e crescimento superior. As plantas da cv. IAC 87-3396 apresentam maior suscetibilidade ao estresse salino.
Palavras-chave: NaCl, Saccharum spp., salinidade, osmólitos compatíves,
CHAPTER 2 – COMPATIBLE OSMOLYTES, LIPID PEROXIDATION AND GROWTH IN YOUNG SUGARCANE PLANTS UNDER SALT STRESS
ABSTRACT – This study aimed to verify the effects of NaCl on the development of young sugarcane plants, SP 81-3250 and IAC 87-3396 cultivars, through of the study of physiological-biochemical variables: (i) compatible osmolytes Pro, GB and Sac as mitigating of salt stress; (ii) lipid peroxidation; (iii) shoot and root growth. For that, were used four concentrations of NaCl (0, 40, 80 and 160 mM) and made the following assessments: levels of Na+ and K+ in the leaves and roots, water potential, total chlorophyll, Fv/Fm, shoot and root growth, compatible osmóltios: proline, glycine betaine and sucrose, and lipid peroxidation in two periods of development (15 and 30 days under salt stress). The results showed higher accumulation of Na+ in the cv. IAC 87-3396 as well as higher Na+/K+ ratio. According to results there was proline accumulation under stress in both cultivars, however, SP 81-3250 plants have, in addition to faster accumulation of this amino acid, reduced lipid peroxidation and higher growth. IAC 87-3396 plants are more susceptible to salt stress.
