2.1 - Fungo
Neste trabalho experimental foi usado o fungo basidiomiceta Phlebia rufa identificado com o número 156/UTAD que se encontra preservado em água destilada esterilizada a 4ºC no laboratório de Bioquímica da Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro.
2.2 - Meios de cultura
Para reactivar o fungo e obter inóculo, foi preparado um meio de PDA (Potato Dextrose Agar) (Difico) 39 g.L-1 que após esterilização em autoclave durante 15 minutos a 121ºC foi distribuído por placas de Petri. As placas foram inoculadas no centro com um quadrado de 1x1 cm2 da cultura de Phlebia rufa e incubadas a 28ºC durante 7 dias.
A produção de lacase por P. rufa em meio líquido foi testada em 4 meios de cultura diferentes baseados no meio mineral definido adaptado de Eggert et al. (1996) com a seguinte composição: A-Meio Basal Glucose (Hi-Media) 10,0 g.L-1 KH2Po4 (Panreack) 1,0 g L-1 NaH2Po4 (Panreack) 0,26 g.L-1 MgSo4.7H2O (Merck) 0,5 g.L-1
Tartarato de Amónio (Sigma) 2,2 g. L-1 Ácido 2,2-dimetilsuccinico (Aldrich) 2,9 g. L-1
B-Cloretos
CaCl2.2H2O 74 mg.L-1
40 C- Sulfatos
CuSo4.5H2O (Merck) 1,0 mg.L-1
ZnSo4.7H2O (Merck) 6,0 mg.L-1
FeSo4.7H2O (Merck) 5,0 mg.L-1
MnSo4.H2O (Merck) 5,0 mg.L-1
D-Vitaminas
Tiamina HCl 2,0 mg.L-1
Composição dos diferentes meios líquidos usados nos ensaios experimentais realizados em triplicado (quantidades por Erlenmeyer):
1) 100 ml de solução (A) + 0,4 g de malte (Merck);
2) 100 ml de solução (A) + 8 g (ou 4 g) de trigo (Triticum aestivum);
3) 100 ml de solução (A) + 1 ml de solução (B) + 1 ml de solução (C) + 1 ml de solução (D) + 1 ml de solução de ácido ferúlico (1,0 g.L-1) (Sigma);
4) 100 ml de solução (A) + 1 ml de solução (B) + 1 ml de solução (D) + 1 ml de solução de sulfatos (C) 10 x concentrada.
O meio basal (A) foi ajustado a pH 4,5 com NaOH (solução 2 M) e distribuído em porções de 100 ml por balões tipo Erlenmeyers de 250 ml. Aos Erlenmeyers correspondentes aos ensaios 1 e 2 foi-lhes adicionado malte e trigo (deixado durante a noite em água destilada), respectivamente. Os Erlenmeyers foram esterilizados em autoclave (ISM Mode 0.75-L) a 121ºC durante 15 minutos com pressão de 1 bar. Após a autoclavagem, os restantes constituintes foram adicionados em condições de assépsia com uma seringa munida de um filtro esterilizado e descartável (FP 30/0,2 CA-S, Whatman) com poro de diâmetro 0,2 µm.
Após 7 dias de crescimento do fungo P. rufa em PDA, retiraram-se da parte mais periférica das placas quatro porções circulares de micélio de 9 mm de diâmetro para inocular em assépsia cada Erlenmeyer. Os Erlenmeyers foram colocados numa incubadora (New Brunwick Scientifica) a 28ºC com agitação (100 rpm nos primeiros 3 dias e 120 rpm nos restantes 21 dias). Foram realizadas recolhas de 1 ml em assépsia em intervalos de 3 ou 4 dias. As amostras foram centrifugadas (Sigma 2K15) a 12700 x g durante 10 minutos a 4ºC, sendo o sobrenadante usado para as determinações analíticas subsequentes.
41 2.3 - Determinação da actividade da lacase
A actividade da lacase foi determinada de acordo com uma técnica colorimétrica adaptada de Bourbonnais et al. (1995) no qual se recorre à espectrofotometria e ao uso de um substrato não fenólico o 2,2´-azinobis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato) conhecido, também, pela abreviatura, ABTS (Dias et al., 2004).
A actividade da lacase foi medida em cuvetes com um volume final de 1500 µl dos quais 1300 µl de tampão citrato-fosfato 100 mM, pH 4,0; 100 µl de ABTS 30 mM e 100 µl do extracto enzimático. Sempre que necessário a enzima foi diluída ou os volumes de tampão e enzima ajustados em função da sua actividade. Após a adição de extracto enzimático a cuvete foi homogeneizada por inversão manual e colocada num espectrofotómetro a 25ºC com temperatura controlada (Thermo Electron Corporation Heλios γ, conectado ao programa informático Vision). A actividade da lacase foi determinada a 420 nm, pico máximo de absorção do catião ABTS+, produto da reacção (ε420=36 mM-1.cm-1).
2.5 - Purificação da lacase
2.5.1 - Extracto enzimático
Após 10 dias de incubação em meio líquido o conteúdo de cada Erlenmeyer foi filtrado para copos com funil de porcelana com um filtro Rundfilter MN de 15 cm de diâmetro de modo a separar o sobrenadante da biomassa. No sobrenadante foi medido o pH num potenciómetro (αlpha 500 pH Meter) e posteriormente foi centrifugado a 5000 x g durante 15 minutos em tubos Nalgene de 30 ml. Após centrifugação foi medido o volume e determinada a actividade da lacase. Posteriormente o volume de extracto enzimático foi reduzido numa célula de ultrafiltração (Amicon 8200) sujeita à pressão de azoto de 3,5 bar e agitação magnética, usando- se uma membrana YM-10 (Millipore) com limite de exclusão molecular de 10 kDa. Após a concentração do extracto enzimático procedeu-se à sua lavagem e equilíbrio com tampão tris- HCl 15 mM a pH 7 usando a mesma célula de ultrafiltração.
Foi realizado um teste rápido dos açúcares que consistia na adição de algumas gotas de 1% de floroglucinol a um tubo de ensaio contendo 2 ml do líquido do ultrafiltrado. Após agitação adicionou-se algumas gotas de ácido sulfúrico (Merck) deixando-o escorrer pelas
42
paredes do tubo de ensaio. A presença de açúcares permite observar a formação de uma cor castanho avermelhado na interface.
Após a não obtenção de açúcares no ultrafiltrado, o extracto enzimático equilibrado foi descorado com PVPP insolúvel (polivinilpolipirrolidona; Sigma) 20 gL-1 sob agitação durante 2 horas a 4ºC. Posteriormente foi centrifugado a 7000 x g durante 10 minutos.
2.5.2 - Cromatogafia de troca iónica
Neste trabalho as cromatografias foram realizadas recorrendo a um equipamento de baixa pressão FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) adaptado a um HPLC programável da Gilson constituído por um módulo manométrico modelo 805 Gilson, 2 bombas de pistão (A e B) modelo 306 Gilson, detector UV/Vis modelo 151 Gilson (com célula de leitura contínua com 0,5 cm de precursor óptico), colector de fracções programável da Gilson modelo FC203B e uma câmara de mistura de 1,5 ml com agitação, Gilson modelo 811C. Incorporado a este equipamento existe um injector manual (Omnifit) equipado com v rios “loops” de 0,5 ml a 20 ml através do qual se aplicou a proteína nas diversas colunas usadas. Para detectar a proteína eluída programou-se o comprimento de onda do detector UV/Vis a 280 nm. Todos os tampões usados foram filtrados num filtro Membranfilter NL 16 (Whatman) com 0,2 μm de poro e 50 mm de diâmetro. Os tampões quando guardados durante a noite eram desgaseificados antes de serem usados. Depois de cada cromatografia as fracções com actividade lacase foram reunidas e submetidas a uma operação de redução de volume, equilíbrio de pH e dessalinização numa célula de ultrafiltração Amicom 8200. Após a sua utilização as colunas foram lavadas com tampão, água destilada filtrada e desgaseificada e por fim conservadas em etanol a 20%.
2.5.2.1 - Cromatografia de troca aniónica DEAE-Sepharose FF
Para a realização desta cromatografia foram preparados 2 tampões de eluição, o tampão A (tris-HCl 15 mM, pH 7) e o tampão B (tris-HCl 15 mM, pH 7 com NaCl 1 M). Usou-se uma coluna Wright (10 X 150 mm) previamente empacotada segundo instruções do fabricante. Após ter sido montada no respectivo suporte a coluna foi devidamente equilibrada e depois de injectada a amostra esta foi lavada com aproximadamente 7 volumes de tampão de equilíbrio (A) para remover as proteínas não adsorvidas ao gel. As proteínas adsorvidas foram eluídas com o seguinte gradiente salino: 0 min, 0% B; 15 nim, 0% B; 83 min 60% B; 85 min, 100% B; 89 min,
43
100% B; 90 min, 0% B. O caudal usado foi de 1 ml.min-1, o volume de cada fracção foi de 3,20 ml por tubo.
2.5.2.2 - Cromatografia de troca aniónica MONO Q HR 5/5
Nesta cromatografia foi usada uma coluna de alta resolução Mono Q (Amersham Pharmacia Biotech) com 1 ml de gel. Foram preparados dois tampões, o tampão A (histidina 20 mM, pH 5,5) e o tampão B (histidina 20 mM, pH 5,5 com NaCl 1 M). As fracções com actividade lacase provenientes da eluição com gradiente salino na coluna DEAE-Sepharose foram reunidas, dessalinizadas e equilibradas em tampão A numa célula de ultrafiltração (Amicon 8200). A proteína equilibrada foi filtrada (filtros descartáveis Millex GV, Millipore com poro de 0,22 µm) e injectada de seguida na coluna. Após o equilíbrio e lavagem da coluna com tampão A iniciou-se a eluição com o seguinte gradiente salino: 0 min, 0% B; 13 min, 0% B; 38 min, 50% B; 42 min, 100% B; 44 min, 100% B; 54 min, 0% B. O caudal usado foi de 0,8 ml.min-1 e o volume de cada fracção foi de 1,6 ml por tubo.
2.5.3 - Cromartografia de exclusão molecular
As fracções com actividade lacase provenientes da eluição com gradiente salino na coluna Mono Q foram reunidas e equilibradas em tampão fosfato 50 mM, pH 7 numa célula de ultrafiltração (Amicon 8200). A fracção equilibrada de seguida foi filtrada com filtros descartáveis Millex GV (Millipore) com poro de 0,22 µm. Esta fracção foi injectada numa coluna de filtração em gel (exclusão molecular) de alta resolução Superdex 200 10/300 GL (Tricorn; Amersham Pharma Biotech). Seguidamente, a amostra foi eluída em condições isocráticas usando-se um tampão de fosfato 50 mM, pH 7,0 com NaCl 150 mM. A coluna foi eluída com este tampão durante 50 minutos, o caudal usado foi de 0,5 ml.min-1 e o volume de cada fracção foi de 1,5 ml por tubo. As fracções contendo lacase foram reunidas, dessalinizadas e equilibradas em tampão fosfato 25 mM, pH 6,9 numa célula de ultrafiltração (Amicon 8200). A calibração da coluna foi realizada nas condições referidas, injectando 0,5 ml de cada padrão (kit de padrões MW-GF-200, Sigma): citocromo c (Mr 12 400); anidrase carbónica (Mr 29 000);
albumina de soro bovino (BSA) (Mr 66 000); álcool desidrogenase (Mr 50 000) e β-amilase (Mr
200 000). O azul de dextrano (Mr 2 000 000) foi usado para determinar o volume vazio da coluna
44 2.6 - Determinação da temperatura óptima
Foi estudado o efeito da temperatura num intervalo de 15 a 70ºC na lacase purificada usando um banho (Tectron 3573100) incorporado ao espectrofotómetro. Os ensaios foram realizados em triplicado numa cuvete de vidro usando como substrato ABTS, conforme descrito em 2.3.
2.7 - Determinação da estabilidade térmica
A estabilidade térmica da lacase foi testada em triplicado a 50, 60 e 65ºC. Foi também testada a actividade da enzima a 60ºC quando incubada com uma solução de BSA (Sigma) 1 mg.ml-1 em tampão fosfato 25 mM a pH 6,9. Após a incubação da enzima a diferentes períodos de tempo (0 a 20 h) e diferentes tratamentos térmicos num banho-maria (Precision, GCA Corporation) determinou-se a actividade da lacase pelo método descrito em 2.3 usando o ABTS como substrato.
2.8 - Determinação do pH óptimo
A influência do pH na actividade da lacase foi determinada em triplicado por espectrofotometria usando tampão citrato fosfato 100 mM num intervalo de pH 3,0 a pH 7,0. As concentrações no volume de reacção e os substratos testados foram 2 mM de ABTS, 4 mM de 2,6-dimetoxifenol (DMP) e 0,02 mM de siringaldazina (SGZ). As leituras de absorvância foram realizadas a 420 nm para o ABTS (ε 420 = 36 mM-1 cm-1), 470 nm para o DMP (ε 470 = 24,8 mM-1
cm-1) e 525 nm para SGZ (ε 525 = 65 mM-1 cm-1)
2.9 - Determinação da proteína
Para determinar a proteína solúvel existente no sobrenadante das culturas de P. rufa e nas fracções com actividade lacase recorreu-se ao método de Bradford (1976) usando como padrão a Albumina de Soro Bovino (BSA).
45
Reagente de Bradford (para 1 L): 0,1 g de comassie blue (Merck) dissolvido em 50 ml de etanol a 95%, 100 ml de ácido fosfórico a 85% perfazendo-se 1L com água destilada. A solução foi filtrada (Rundfilter MN).
Foram preparados 5 padrões de BSA com 5, 10, 20, 30 e 40 µg.ml-1 a partir de uma solução mãe de 0,1 g.L-1 de BSA. As medições foram realizadas num espectrofotómetro (Thermo Electron Corporation Heλios γ) ao comprimento de onda de 590 nm. O volume total usado foi de 1600 µl do qual 1200 µl eram de solução de Bradford e 400 µl de amostra ou de padrão BSA, para leitura do branco foi usada água destilada em vez de amostra. As medições foram realizadas após agitação e incubação a temperatura ambiente durante 5 minutos. A proteína solúvel foi determinada usando-se a seguinte recta padrão (Figura 5).
Figura 5 - Recta padrão usada para determinar a proteína solúvel. Equação da recta: proteína (µg ml-1) = 0,0158 x A590+ 0,019; R
2
= 0,9877. Intervalo de validade: 5 a 40 µg.ml-1 de proteína.
2.10 - Electroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)
A massa molecular relativa foi determinada por electroforese em gel de poliacrilamida em condições desnaturantes na presença do detergente aniónico dodecil sulfato de sódio (SDS). No laboratório foram preparados os géis de poliacrilamida (18 x 15 cm com 2 mm de espessura) a 10% num o sistema JoeyTM Gel Casting (Owl Scientifc Inc.) segundo o método descontínuo de Laemmli (1970). O gel de concentração tinha uma altura de 2 cm e a seguinte composição: 3% (p/v) de acrilamida, 0,125 M de tris-HCl pH 6,7 e 0,1% (p/v) de SDS. O gel de separação era constituído por 10% (p/v) de acrilamida, 0,375 M de tris-HCl pH 8,9 e 0,1% (p/v) de SDS. O
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0 10 20 30 40 50 A b so r v . (5 9 0 n m ) BSA (µg mL-1)
46
tampão dos eléctrodos consistiu numa solução com 0,129 M de Glicina (Merck), 0,025 M de Tris-HCl pH 8,3 e 3% (p/v) de SDS.
Foi usado como padr es de massa molecular relativa um kit “Stock nºSDS-6H” (Sigma) que contém: β-galactosidade (E. coli) (Mr 116 000), fosforilase B (músculo de rato) (Mr 97 400),
albumina bovina (Mr 66 000), albumina de ovo (Mr 45 000) e anidrase carbónica (eritrócitos de
bovino) (Mr 29 000).
Os marcadores moleculares e a amostra antes de serem aplicados foram diluídos 2:1 e 1:1 respectivamente numa solução contendo 0,0625 M de Tris-HCl pH 6,7; 10% (p/v) glicerol (Merck); 2% (p/v) de SDS, 5% (v/v) de 2-mercaptoetanol, 0,01% (p/v) de azul de bromofenol (Sigma). As amostras foram aplicadas no gel de concentração em função da quantidade (10 µl ou 100 µl) de proteína presente, do padrão foram aplicados 10 µl em cada extremidade do gel.
As electroforeses foram realizadas numa câmara Penguin Dual-Gel Electroforesis Sytem P9DS (Owl Scientifc Inc.) com um sistema de arrefecimento através da recirculação de água fria (7ºC). Usou-se uma fonte de tensão (Apelex PS 3002) com o objectivo de proporcionar uma corrente constante de 60 mA. O tempo de corrida foi de aproximadamente 3,30 h. Após a corrida o gel foi fixado em solução contendo 40% (v/v) de metanol (Pronolab), 7% (v/v) de ácido glacial acético (Pronolab) e 53% (v/v) de água durante pelo menos 10h, foi posteriormente corado com uma solução 0,25% (p/v) de comassie blue pelo menos 3 h e descorado novamente com a solução de fixação pelo menos 15 h. O gel foi guardado em ácido glacial acético a 7%.
2.11 - Eléctrodo de oxigénio
Para determinar o consumo de oxigénio recorreu-se a sistema Oxygraph (Hansatech Instruments Ldt.) acoplado a um software “oxygraph plus”. O eléctrodo de oxigénio foi calibrado com ditionito de sódio (hidrosulfito de sódio). O consumo de oxigénio foi determinado numa câmara termoestatizada de volume regulável e sob agitação magnética. À câmara adicionou-se 850 µl de tampão citrato fosfato 100 mM, pH 4,5; 50 µl de enzima purificada e 100 µl de substrato. Foram testados 11 substratos (Tabela 2) para avaliar a capacidade oxidativa da enzima purificada.
47
Tabela 2 - Substratos e concentrações usadas para avaliar a capacidade oxidativa da enzima purificada
Substrato Concentração
ABTS (Sigma) 2 mM
Ácido cafeico (Aldrich) 1 mM
Ácido ferúlico (Sigma) 1 mM
Ácido gálico (Sigma) 2 mM
Ácido p-cumárico (Sigma) 1 mM Ácido protocatequico (Sigma) 1 mM
Catecol (Aldrich) 4 mM DMP (Aldrich) 4 mM Guaiacol (Aldrich) 4 mM Hidroquinona (Aldrich) 4 mM Pirogalhol (Aldrich) 4 mM SGZ (Sigma) 0,02 mM
2.11 - Determinação das constantes cinéticas e efeito dos inibidores
Os ensaios espectrofotométricos foram realizados em triplicado a 25ºC em cuvetes de plástico com um volume final de 1500 µl dos quais 1300 µl de tampão citrato-fosfato 100 mM, 100 µl de enzima e 100 µl de cada substrato às concentrações e pH seguintes: ABTS (0,005; 0,01; 0,02; 0,05; 0,2; 1,0; 2,0; 4,0 mM a pH 4), DMP (0,125; 0,25; 0,50; 1,0; 2,0; 4,0; 8,0 mM a pH 3,5) e SGZ (0,52; 1,56; 3,13; 6,25; 12,5; 20,8; 25,0 µM a pH 5,0). O estudo da inibição foi realizado com os seguintes inibidores: NaN3 (0; 2; 4 µM); NaF (0; 0,01; 0,03 mM) e NaCl (0;
25; 50 mM na presença de ABTS e 0; 5; 10 mM na presença de DMP). Os comprimentos de onda para as leituras de absorvância e coeficientes de extinção molar para determinar a concentração de produto formado para cada substrato foram os seguintes: 420 nm para o ABTS (ε420 = 36 mM-1 cm-1), 470 nm para o DMP (ε470 = 24,8 mM-1 cm-1) e 525 nm para a SGZ (ε525 =
65 mM-1 cm-1).
Para determinar as constantes cinéticas Km e Vmax, o tipo de inibição e as constantes de inibição usou-se a regressão não linear dos dados experimentais ajustados às equações de Michaelis-Menten (sem e com inibições lineares) através dos programas Solver e GraphPad 5 Demo. A constante catalítica (kcat) foi calculada a partir da expressão: kcat = Vmax / [lacase]. Também foi determinado o grau de inibição expresso pelo parâmetro IC50 que significa a
concentração de efector que inibe 50% da actividade enzimática. Este parâmetro foi determinado pelo método espectrofotométrico a 25 ºC com tampão citrato-fosfato 100 mM a pH 4 usando como substrato ABTS (2 mM) e a pH 3,5 usando como substrato o DMP (4 mM). Os inibidores usados para esta determinação foram o NaN3 (0,09; 0,9; 9,0; 90 µM); NaF (0,001; 0,01; 0,1; 1,0
48
mM) e NaCl (37,5; 75,0; 150 mM). A enzima foi previamente incubada durante 5 minutos com os inibidores.
2.12 - Análise estatística e tratamento de dados
Neste trabalho experimental os valores obtidos são os valores médios de 3 repetições, excepto indicação do contrário.
Os dados foram transferidos para folhas de cálculo (Microsoft Excel) e determinada a média, desvio padrão e elaborados os gráficos.
49