3.1 - Escolha do meio de cultura
Com o objectivo de melhorar a produção de lacase de Phlebia rufa procedeu-se à comparação de quatro suplementos (trigo, malte, ácido ferúlico e sulfatos com concentração 10 vezes (10 x sulfatos) superior ao usado no meio de Eggert (Eggert et al., 1996)) de forma a concluir qual proporcionava a maior produção de lacase após 23 dias de incubação (28ºC e 120 rpm). Como se pode verificar na figura 6A, o meio com trigo proporcionou maior actividade de lacase, apresentando o valor máximo aos 20 dias (2,593 Uml-1 ± 0,198). Com o suplemento de ácido ferúlico o máximo de produção de lacase (0,010 Uml-1 ± 0,006), também, foi obtido ao fim de 20 dias. Pelo contrário, o meio com extracto de malte apresentou uma maior actividade ao fim de 7 dias (0,060 Uml-1 ± 0,012) e o meio com 10 x sulfatos apresentou actividade máxima ao fim de 13 dias (0,008 Uml-1 ± 0,009). Assim a actividade da lacase no meio suplementado com trigo foi 15 vezes superior ao suplementado com extracto de malte, 26 vezes superior ao suplementado com ácido ferúlico e 324 vezes superior ao suplementado com 10 x sulfatos. Concluindo-se que o trigo foi o melhor suplemento para a produção desta lacase.
O pH do meio também se alterou ao longo do tempo. Inicialmente partimos de um pH de 4,5 em todos os meio e ao fim de 23 dias o pH no meio de malte tinha diminuído para 4,10 ± 0,02 e o meio contendo 10 x sulfatos reduziu para 4,05 ± 0,10. O meio em que o pH diminuiu mais foi o meio contendo ácido ferúlico em que o pH reduziu para 3,69 ± 0,07. O único meio em que aumentou o pH foi o meio de trigo com um pH final de 5,10 ± 0,008.
50
Figura 6 - Actividade enzimática da lacase de P. rufa obtida durante 23 dias em meio basal de Eggert suplementado com malte (A), trigo (B), ácido ferúlico (C) e com sulfatos 10x (D).
Nos fungos da podridão branca a produção de enzimas esta relacionada com a disponibilidade de nutrientes como azoto e carbono (Kapdan et al., 2000). Neste estudo usou-se em todos os meios de cultura o meio basal de Eggert que contém além de outros nutrientes (c.f. 2.2), glucose como fonte de carbono e tartarato de amónio como fonte de azoto. No caso do meio suplementado com trigo e extracto de malte a quantidade de carbono e azoto é muito superior uma vez que estes suplementos são ricos em carbono e azoto. A quantidade de azoto (N) e carbono (C) foi quantificada por Fraga (2011) obtendo 408,5 mg kg-1 de C e 12,0 mg kg-1 de N para o extracto de malte e 560,9 mg L-1 de C e 21,49 mg L-1 de N para o extracto de trigo concluindo que o trigo é mais rico em carbono e azoto que o extracto de malte.
Segundo vários autores a produção de lacase é sensível a concentração de azoto e glucose no meio de cultura e geralmente obtêm-se maiores quantidades de lacase quando o fungo é cultivado em meios ricos em azoto (Gianfreda et al., 1999; Gochev e Krastanov, 2007; Brijwani
et al., 2010). Os nossos resultados estão de acordo com este facto uma vez que dos suplementos
testados o trigo é o mais rico em carbono e azoto e foi, também, o meio que produziu maior actividade de lacase. Resultados semelhantes foram obtidos com os fungos Lentinus edodes,
Phanerochaete chrysosporium e Rigidoporus lignous (Tekere et al., 2001) corroborando
igualmente que elevados níveis de lacase eram obtidos num meio com elevada concentração de azoto. Pelo contrário baixos níveis de azoto no meio permitiram o máximo de produção de lacase
0,000 0,020 0,040 0,060 0,080 7 9 13 16 20 23 U m l -1 Tempo (dias) A 0,000 0,800 1,600 2,400 3,200 7 9 13 16 20 23 U m l -1 Tempo (dias) B 0,000 0,005 0,010 0,015 0,020 7 9 13 16 20 23 U m l -1 Tempo (dias) C 0,000 0,004 0,008 0,012 0,016 0,020 7 9 13 16 20 23 U m l -1 Tempo (dias) D
51
com os fungos Pycnoporus cinnabarinus e P. radiata (Gianfreda et al., 1999). A eficiência na produção de lacase em algumas culturas com elevado quantidade de azoto está relacionada com o tipo específico de fonte de carbono (Gianfreda et al., 1999). Os fungos de Phlebia spp. degradam mais eficientemente e tem maior actividade da lacase na palha de trigo que na palha de arroz (Sharma e Arora, 2010). Tekere e colaboradores (2001) testaram a produção de lacase por vários fungos da podridão branca provenientes do Zimbabwe com diferentes concentrações de carbono, azoto e Mn2+ concluindo que a produção foi maior em altas condições de azoto e carbono e pouco influenciada pelos níveis de Mn2+.
Os indutores podem influenciar a produção de enzimas linhoceluloliticas dependendo da sua concentração e do seu tempo de adição (Tekere et al., 2001; Strong e Claus, 2011). A utilização de ácido ferúlico como indutor proporcionou bons resultados na produção de lacase de
V. volvacea, P. radiata, P. ostreatus, T. versicolor, Pycnoporus cinnabarinus, P. mutabilis
(Gianfreda et al., 1999; Mougin et al., 2002; Chen et al., 2003; Strong e Claus, 2011). No entanto, no presente estudo a comparação não é possível, uma vez que o malte e o trigo além de possuírem, possivelmente, um grande número de indutores proporcionam também uma fonte extra de carbono e azoto muito relevante.
3.2 - Produção de lacase
Após a conclusão de que o meio basal de Eggert suplementado com trigo era o meio que proporcionava maior actividade de lacase, realizou-se novo ensaio com o objectivo de produzir quantidade de actividade total de lacase que permitisse a sua posterior purificação e caracterização.
Este novo ensaio teve a duração de 24 dias. Ao longo da incubação a actividade foi determinada periodicamente usando-se ABTS como substrato. Verifica-se (Figura 7) a existência de dois picos aos 10 dias (1,061 ± 0,167 Uml-1) e 24 dias (3,144 ± 0,594 Uml-1). Nestes dois picos foi recolhido o extracto enzimático bruto para posterior purificação.
O meio de cultura apresentava, inicialmente um pH de 4,5, no entanto ao longo do tempo de incubação foi reduzindo o seu pH e ao fim de 10 dias o pH era de 4,19 ± 0,22 e ao fim de 14 dias o pH aumentou para 4,25 ± 0,11.
52
Figura 7 - Actividade enzimática da lacase de P. rufa obtida durante 24 dias em meio basal de Eggert suplementado com trigo.
A produção de lacase no meio suplementado com trigo resultou numa elevada actividade de lacase (3,144 Uml-1) comparada com o obtido por outros autores. Por exemplo, Peláez e colaboradores (1995) estudaram 90 culturas de fungos suplementadas com um meio sintético e a actividade da lacase foi detectada em cerca de 50% das espécies testadas sendo os maiores valores de lacase cerca de 0,200 Uml-1 foram os fungos Trametes versicolor, Phellinus torulosus,
Cerrena unicolor e Pleurotus eryngii. O fungo Agaricus blazei num meio complexo de sumo de
tomate com pH 5,0 apresentou um único pico máximo de lacase aos 17 dias (5000 Uml-1) seguido de um aumento drástico no pH para 7,0 (Ullrich et al., 2005). No presente trabalho o pico máximo ocorreu ao fim de 24 dias (Figura 7) e actividade obtida foi menor. No caso da lacase de Coriolus versicolor a produção de lacase num meio sintético atingiu o máximo (6590 Uml-1) no dia 9 (Arackiasamy et al., 2008). Dinis e colegas (2009) verificaram que o fungo P.
rufa em palha de trigo produziu actividade máxima de lacase ao fim de 7 dias (0,157 Uml-1) decrescendo em seguida, voltando a atingir um máximo ao fim de 21 dias.
3.3 - Purificação da lacase de P.rufa
Procedeu-se à purificação da lacase de Phlebia rufa presente no meio de cultura ao fim de 10 dias. A metodologia de purificação utilizada foi adaptada de Dias (2004) e Matos (2006). O extracto bruto foi recolhido após separação do micélio por filtração (cf. 2.5.1) e posteriormente sujeito a ultrafiltração com o objectivo de concentrar a proteína e equilibrar no tampão (tris-HCl 15mM, pH 7,0) usado na próxima etapa de purificação. Foi nesta etapa que ocorreu a maior perda de actividade enzimática total com um rendimento para 40% (Tabela 3). O extracto final
0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 4 7 10 13 18 24 U m l -1 Tempo (dias)
53
obtido foi posteriormente, sujeito a várias etapas de cromatografia com o objectivo de purificar a lacase (Figura 8).
Figura 8 - Diagrama de purificação da lacase de P. rufa
A cromatografia de troca aniónica com a coluna DEAE-Sepharose FF foi a primeira a ser realizada obtendo-se apenas um pico com actividade de lacase (Figura 9). A lacase foi eluida a 0,38 M de NaCl. O extracto enzimático após concentração por ultrafiltração (cf. 2.5.2.1) e equilibrado no novo tampão apresentou um rendimento de 19% e um factor de purificação de 1 (Tabela 3). Bonomo et al., (1998) purificaram duas isoenzimas (B e D) de Rigidoporus lignosus após usarem a coluna DEAE e obtiveram a isoenzima B com um factor de purificação de 8,7 e a isoenzima D com um factor de 8,1. Enquanto Matos (2006) eluiu a lacase de Ganoderma
applanatum com 0,28 M de NaCl obtendo um rendimento de 102% e um factor de purificação de
4,5. Dias (2004) purificou duas isoenzimas (Lac1 e Lac2) de um basidiomiceta denominado
Euc1 com a mesma coluna obtendo um rendimento para a Lac1 e Lac2 de 21,3% e 69,8%
54
Figura 9 - Cromatograma obtido por cromatografia de troca iónica DEAE-FF a pH 7,0 com gradiente linear de 0 a 1 M de NaCl e um caudal de 1 ml.min-1. Proteína: linha fina; actividade lacase: (-●-); gradiente de NaCl: (-).
Após a concentração das fracções com actividade de lacase, já referida, procedeu-se à sua purificação por cromatografia de troca iónica numa coluna Mono Q utilizando-se como eluente o tampão de histidina 20 mM, pH 5,5. As fracções com actividade de lacase foram eluídas a 0,30 M de NaCl (Figura 10). Observou-se apenas um pico com actividade lacase. Nesta etapa de purificação obteve-se um factor de purificação de 6 e um rendimento de 14% (Tabela 3).
Comparando purificações de diferentes lacases mas todas utilizando a mesma coluna Mono Q verifica-se diversidade de rendimentos e factores de purificação assim como concentração salina que permitiu a eluição da enzima. Assim, Bonomo et al., (1998) purificaram duas isoenzimas (B e D) de Rigidoporus lignosus obtendo um factor de purificação para a isoenzima B de 9,1 e para a isoenzima D de 11,8. Dias (2004), purificou uma lacase do basidiomiceta Euc1 obtendo um rendimento de 29,1% e um factor de purificação de 5,2 tendo a enzima sido eluída a 0,25 M de NaCl. Ullrich et al., (2005) purificou uma lacase de Agaricus
blazei obtendo um rendimento de 25% e um factor de purificação de 2,0. Matos (2006) purificou
a lacase de Ganoderma applanatum com um rendimento de 54% e um factor de purificação de 5,8 tendo sido eluída a 0,24 M de NaCl. Constata-se que a lacase de P. rufa foi eluída a uma concentração salina superior em comparação aos outros autores significando que esta lacase tem uma interacção mais forte com esta coluna.
0 . 0 0 2 0 . 0 0 4 0 . 0 0 6 0 . 0 0 8 0 . 0 0 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 0,000 1,000 2,000 3,000 4,000 5,000 6,000 7,000 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 La ca se (U m l -1) Tempo (min)
55
Figura 10 - Cromatograma obtido por cromatografia de troca iónica Mono Q a pH 5,5 e gradiente linear de 0 a 1 M de NaCl e um caudal de 0,8 ml.min-1. Proteína: linha fina; actividade lacase: (-●-); gradiente de NaCl: (-).
Figura 11 - Cromatograma obtido por cromatografia de exclusão molecular Superdex 200 a pH 7,0 e caudal de 0,5 ml.min-1. Proteína: linha fina; actividade lacase: (-●-).
Seguidamente reuniu-se as fracções contendo lacase e usou-se uma cromatografia de exclusão molecular usando para tal uma coluna Superdex 200 10/300 GL (Figura 11) eluindo a lacase com tampão fosfato citrato 50 mM a pH 7,0 com 150 mM de NaCl. Na tabela 3 apresentamos um resumo das etapas de purificação.
56 Tabela 3 - Resumo da purificação da lacase.
No final destas etapas de purificação obteve-se a enzima purificada 8 vezes com um rendimento de 6%, a actividade total foi de 149 U e a proteína total foi de 0,9 mg. Comparando os valores da Tabela 3 com os obtidos para diferentes autores (Tabela 4) constatamos que há rendimentos e factores de purificação superiores mas também há valores inferiores aos apresentados. Rogalski e colegas (1995) obtiveram resultados semelhantes na purificação de uma lacase de Phlebia radiata obtendo um rendimento de 1,49% e um factor de purificação de 6,85. Resultados semelhantes foram obtidos por Obara e colaboradores (2005) obtiveram um rendimento de 0,5% e um factor de purificação de 1,8 na purificação de uma lacase de
Botryosphaeria rhodina. Ullrich e colegas (2005) purificaram uma lacase de Agaricus blazei
obtendo no final um rendimento de 18% e um factor de purificação de 3,1. Dias (2004), obteve no final da purificação do fungo Euc1 duas isoenzimas (Lac1 e Lac 2.3) a Lac1 foi purificada cerca de 4,5 vezes com um rendimento de 14,7% e uma actividade total de 183,3 U, a Lac 2.3 foi purificada cerca de 5,2 vezes com um rendimento de 29,1% e uma actividade total de 362,7 U. Enquanto Matos (2006), usando as mesmas técnicas de purificação usadas neste trabalho purificou a lacase de Ganoderma applanatum obtendo uma actividade final de 72 U, um rendimento de 37% e um factor de purificação de 6. Na tabela 4 apresentamos o rendimento e factor de purificação de várias lacases.
Etapas de Purificação Volume Final (ml) Actividade Total (U) Proteína Total (mg) Actividade Especifica (Umg-1) Rendimento (%) Factor de Purificação Extracto Bruto 720 2327,8 102,3 23 100 1 Ultrafiltração 25 924,0 55,4 17 40 1 DEAE-FF 28 442,6 23,0 19 19 1 Mono Q 20 315,6 2,2 16 14 6 Superdex 200 25 149,2 0,9 6 6 8
57
Tabela 4 - Rendimento e factor de purificação obtido da purificação de várias lacases.
Nd - não determinado
Após todas estas etapas de purificação procedeu-se a caracterização da lacase relativamente ao pH óptimo, temperatura óptima, termoestabilidade, massa molecular e especificidade. Fungo Rendimento (%) Factor de purificação Autor
Abortiporus biennis 18,2 86,6 Zhang et al., 2011
Agaricus blazei 18 3,1 Ullrich et al., 2005
Basidiomiceta C30 50 25,4 Klonowska et al., 2002
Cladosporium cladosporioides
17,46 40,79 Halaburgi et al., 2011
Euc 1 (Lac1 e Lac 2.3) 14,7 e 29,1 4,5 e 5,2 Dias, 2004 Fomes sclerodermeus (lac1
e lac2)
49 e 27 Nd Papinutti e Martínez 2006
Galerina sp. 21 64 Ibrahim et al., 2011
Ganoderma applanatum 37 6 Matos, 2006
Ganoderma lucidum 20,2 25,4 Wang e Ng, 2006
Guaeumannomyces graminis
4,6 120 Edens et al., 1999
Magnoporthe grisea 11,92 282 Iyer e Chatoo 2003 Melanocarpus albomyces 17 292 Kiiskinen et al., 2002 Monocillium indicum 21,1 1,9 Thakker et al., 1992 Odontermes formosanus 6,16 16,83 Zhou et al., 2010 Ophiostoma novo-ulmi 2,9 33,3 Binz e Canevascini, 1997 Paraconiothyrium variabile 4,4 21,6 Forooftanfar et al., 2011
Phlebia radiata 1,49 6,85 Rogalski et al., 1995
Pleurotus florida 54 14,2 Palvannan e Sathishkumar,
2010 Pleurotus ostreatus
(POXA1)
23 85 Palmieri et al., 1997
Pleurotus sajor-caju 14 4113 Zucca et al., 2011 Pycnoporus cinnabarinus 47 36 Eggert et al., 1996 (a) Pycnoporus cinnabarinus 45,8 45,3 Schliephake et al., 2000 Rigidoporus lignosus (B e
D)
24 e 4,1 Nd Bonomo et al., 1998
Scytalidium thermophilum 30 7,9 Younes e Saydi, 2011 Trichoderma atroviride 47,8 42,1 Chakroun et al., 2010 Trichoderma harzianum 0,39 151,7 Sadhasivan et al., 2007
58 3.4 - Determinação da massa molecular
A massa molecular relativa foi determinada pela técnica de cromatografia de exclusão molecular e por SDS-PAGE. A coluna de exclusão molecular Superdex 200 10/300 GL foi usada para determinar a massa molecular da lacase em condições não desnaturantes recorrendo a uma equação da recta (Figura 12) obtida com as proteínas β-amilase, ADH (Hormona Antidiurética), BSA (Albumina de Soro Bovino), anidrase carbónica e citocromo C com massas moleculares entre 12,4 e 200 kDa. O volume excluído (Ve) necessário para eluir a lacase foi de 15 ml e o volume vazio (V0) determinado com azul de dextrano foi de 8,0 ml. A massa molecular determinada através deste método foi de 54,9 kDa.
Figura 12 - Determinação da massa molecular com a coluna Superdex 200 10/30 GL. V0 = 8,0 ml e Ve = 15,0 ml. Recta padrão: Log (Mr) = - 1,5737 x Ve/V0+7,6905. r2 = 0,9889.
O outro processo usado para determinar a massa molecular foi a electroforese em condições desnaturantes (SDS-PAGE) usando como padr es β-galactosidase, fosforilase B, albumina bovina, albumina de ovo e anidrase carbónica com massas moleculares entre 29 e 205 kDa (Figura14). No gel foram aplicadas 3 amostras de diferentes fases de purificação (ultrafiltração, Mono Q e Superdex). Como se pode verificar na figura 13 a lacase purificada apresenta uma única banda que corresponde a uma massa molecular de 63,0 kDa. Dos resultados obtidos com os dois processos obtivemos um valor médio de massa molecular de 59,0 kDa.
3,8 4,3 4,8 5,3 5,8 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 Log ( M r) Ve/V0
59
Figura 13 - Determinação da massa molecular da lacase por SDS-PAGE e corado com Comassie blue. Coluna: 1- padrões, 2- lacase sem purificar (ultrafiltração), 3- lacase purificada com a coluna Mono Q HR 5/5 e 4- lacase purificada com a coluna Superdex 200 10/300 GL
Figura 14 - Recta padrão obtida na determinação da massa molecular por electroforese desnaturante. Log (Mr) = -1,4215 x Rf + 5,1718. r 2 = 0,9785 4,20 4,40 4,60 4,80 5,00 5,20 0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60 L o g ( M r ) Rf (mobilidade relativa) 1 2 3 4 kDa 66,0 250,0 29,0 116,0 97,4 45,0
60
A lacase purificada apresenta um valor típico da maior parte das lacases. Segundo vários autores a maioria das lacases apresenta uma massa molecular entre 50-130 kDa (Baldrian, 2006; Gochev e Krastanov, 2007; Giardina et al., 2010) predominando os valores de cerca de 60 kDa. Verifica-se também uma diferença na determinação da massa molecular por SDS-PAGE (63 kDa) e cromatografia de exclusão (55 kDa) o mesmo ocorreu com vários autores como se pode verificar na Tabela 5. O facto de termos obtido uma massa molecular maior por electroforese também é comum e foi verificado para vários fungos como Euc-1, Ganoderma applanatum,
Ophiostoma novo-ulmi, Pleurotus ostreatus, Rigidoporus lignosus, Trametes trogii (Binz e
Canevascini, 1997; Palmieri et al., 1997 e Garzillo et al., 2001; Dias, 2004; Matos, 2006). No entanto como os valores das diferentes determinações estão próximos o que indica que a enzima é monomérica pois se fosse dimérica com duas subunidades iguais a electroforese realizada, como é desnaturante, indicaria um valor que seria metade do valor obtido por cromatografia (metodologia não desnaturante). Segundo Matos (2006) a determinação da massa molecular por diferentes métodos resulta em diferentes valores de massa molecular determinada para a proteína e pode-se explicar pelo facto das lacases serem glicoproteínas. Segundo este autor os hidratos de carbono presentes na superfície destas glicoproteinas pode interferir com a ligação do dodecil sulfato de sódio (SDS) à proteína levando a uma diminuição da mobilidade electroforetica e consequente erro na determinação da massa molecular. A determinação da massa molecular por cromatografia de exclusão pode estar sujeita a erros quando as proteínas possuem glícidos devido a interferências entre a matriz do gel e os hidratos de carbono da proteína que contribuem para um aumento do tempo de retenção na coluna e consequentemente numa menor massa molecular.
61
Tabela 5 - Massa molecular de diferentes lacases determinada por SDS-PAGE e filtração em gel.
Fungo SDS-PAGE (kDa)
Filtração em gel (KDa)
Autor
Abortiporus biennis 56 56 Zhang et al., 2011
Agaricus bisporus 65 Nd Perry et al., 1993
Agaricus blazei 66 Nd Ullrich et al., 2005
Basidiomiceta C30 (Lac2) 65 Nd Klonowska et al., 2002
Cerrena máxima 57 Nd Koroleva et al., 2002
Cladosporium cladosporioides
71,2 Nd Halaburgi et al., 2011
Euc-1 (Lac1 e Lac 2.3) 65,7 e 65,7 59,0 e 59,7 Dias, 2004
Fomes sclerodermeus 67 Nd Papinutti e Martínez, 2006
Ganoderma sp. KULac 1 a 5
50 - 71 Nd Teerapatsakul et al., 2007
Ganoderma applanatum 65,5 55,1 Matos, 2006
Ganoderna lucidum 43 Nd Zilly et al., 2011
Magnoporthe grisea 70 Nd Iyer e Chatoo, 2003
Melanocarpus albomyces 80 Nd Kiiskinen et al., 2002
Monocillium indicum 72 Nd Thakker et al., 1992
Ophiostoma novo-ulmi 79 70 Binz e Canevascini, 1997
Paraconiothyrium variabile
84 Nd Forootanfar et al., 2011
Phlebia radiata 64 Nd Niku-Paavola et al., 1988
Pleurotus ostreatus POXAC e POXA1b 59 e 61 59 e 56 Garzillo et al., 2001 Pleurotus ostreatus POXA1 e POXA2 61 e 67 54 e 59 Palmieri et al., 1997
Pleurotus sajor-caju 61 Nd Zucca et al., 2011
Pycnoporus cinnabarinus 76,5 81 Eggert et al., 1996
Pycnoporus cinnabarinus 63 Nd Schliephake et al., 2000
Rigidoporus lignosus B e D 55 e 60 Nd Bonomo et al., 1998 Rigidoporus lignosus POXB e POXD 55 e 60 59 e 51 Garzillo et al., 2001
Scytalidium thermophilum 28 82 Younes e Sayadi, 2011
Trametes hirsuta 38 e 61 Nd Schroeder et al., 2008
Trametes trogii POXL3 60 53 Garzillo et al., 2001
Trichoderma atraviride 80 100 Chakroun et al., 2010
Trichophyton rubrum 65 Nd Jung et al., 2001
62 3.5 - Determinação do pH óptimo
A influência do pH na actividade enzimática foi determinada com um substrato não fenólico (ABTS) e 2 substratos fenólicos (DMP e SGZ). O intervalo de pH estudado foi de pH 3,0 a 7,0. Na figura 15 pode-se observar que o valor do pH óptimo depende do substrato utilizado (ABTS, SGZ e DMP).
Figura 15 - Influência do pH na actividade da lacase com diferentes substratos: (
•
) ABTS, (■) SGZ e (▲) DMP.No caso do ABTS a actividade máxima ocorre a pH 3,0 e decresce monotonicamente em função do aumento de pH este comportamento é semelhante ao observado frequentemente noutras lacases (Gianfreda et al., 1999). No caso da SGZ obtivemos um perfil em forma de sino com um pico no valor de pH 5,0 que é típico deste substrato. Para o DMP verificou-se que a actividade da lacase aumenta ligeiramente no início atingindo o máximo a pH 3,5 e decresce a partir daí. Para todos os substratos verificamos que a pH 7 a actividade catalítica é nula. A lacase apresenta actividade catalítica superior a 25% no intervalo de pH de 3,0 a 5,0 para o ABTS, pH 3,0 a 5,0 para o DMP e pH de 3,0 a 5,5 para a SGZ. Estes valores são considerados os normais para lacases de basidiomicetas.
Resultados semelhantes foram obtidos por Matos (2006), com uma lacase de Ganoderma
applanatum que obteve um pH óptimo para o ABTS de 3,0 para a SGZ de 5,0 e para o DMP de
3,5 observando também actividade catalítica nula a pH 7,0. Dias (2004), com o fungo Euc1 também obteve valores de pH semelhantes aos nossos para a Lac 1 e Lac 2.3 com a SGZ 4,5 e 5,0 respectivamente, e pH 3,5 para as duas lacases na presença de DMP e 3,0 na presença de ABTS. A pH 7 a actividade catalítica também foi nula. Bonomo e colegas (1998) purificaram
0 20 40 60 80 100 2 3 4 5 6 7 8 A ct ivi d ad e r el at iva (%) pH
63
lacases de Rigidoporus lignosus e obtiveram um pH óptimo de 3,0 para o ABTS e de 6,2 para a SGZ enquanto Jung e colaboradores 2002 purificaram uma lacase de Trichophyton rubrum com um pH óptimo de 3,0 com ABTS. Ullrich e colegas (2005) purificaram a lacase de Agaricus
blazei obtendo a máxima actividade de lacase para a oxidação do ABTS a pH 2,3 e decresceu
constantemente até zero a pH 7. A SGZ e DMP mostraram actividade máxima a pH 5,5 e decresceu até zero a pH 8,0. De todos os fungos aqui apresentados apenas este apresentou actividade a pH alcalino. Iyer e Chattoo (2003) purificaram a lacase de Magnoporthe grisea e obtiveram um pH óptimo para a SGZ de 6, enquanto Halaburgi e colaboradores (2011) obtiveram um pH óptimo de 3,5 para a lacase de Cladosporium cladosporioides determinada com ABTS. A lacase da bactéria Bacillus sp. tem um pH óptimo de 4 usando DMP como substrato (Telke et al., 2011), diferindo do pH óptimo dos fungos. A SGZ apresenta em geral valores mais altos em relação aos outros dois substratos sendo o R. lignosus o que apresenta o valor mais elevado (pH 6,2). Durante a oxidação de substratos dadores de electrões como o ABTS a actividade da lacase diminui constantemente à medida que aumenta o pH. Isto ocorre porque os protões não estão envolvidos na oxidação deste substrato e a influência do pH no potencial redox deste composto é mínima. Neste caso a diminuição da actividade enzimática esta associada á ligação do ião hidroxilo com o centro T2/T3 da enzima (Morozova et al., 2007b).
3.6 - Temperatura óptima
A influência da temperatura na actividade enzimática foi estudada no intervalo de 15ºC a 70ºC usando ABTS como substrato. A figura 16 mostra que a actividade máxima da lacase ocorre a 65ºC (temperatura óptima), obtendo-se uma capacidade catalítica superior a 50% no intervalo de 40ºC a 70ºC. No intervalo de 55ºC a 70ºC a actividade catalítica varia pouco e tem