DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DO MÉTODO ANALÍTICO
2.1 OBJETIVO ESPECÍFICO
2.6.1 Obtenção de íons produto e separação cromatográfica para os compostos triptoquialaninas A e C
Foi estudada a fragmentação dos íons precursores das triptoquialaninas A e C por eletrospray (ESI+) e decomposição induzida por colisão (CID) e a partir desses dados, pode-se estabelecer os melhores experimentos para a detecção seletiva dos compostos de interesse. Pôde-se também monitorar as transições dos compostos no modo de aquisição SRM. Para cada analito foram então selecionadas três transições características, o que é possibilitado por um analisador de massas sequencial. A transição mais intensa foi escolhida para quantificação, enquanto a segunda e a terceira, para confirmação conforme Tabela 10. Mesmo utilizando um equipamento MS/MS através do modo SRM que permite quantificar substâncias que coeluem através do monitoramento das transições íon precursor-íon produto de cada composto, a separação cromatográfica ainda é muito importante, pois proporciona melhora na detectabilidade do analito.
A melhor condição de separação cromatográfica em LC-MS/MS, foi obtida através da eluição em modo isocrático, na composição de fase móvel: (A:B) 60:40 v/v em 6 minutos de corrida conforme Figura 26. Os parâmetros do espectrômetro de massas foram ajustados de forma univariada, os valores otimizados foram: voltagem do capilar + 4000V; temperatura do gás de dessolvatação 350 ºC; vazão do gás 9,0 L/min; pressão do nebulizador 40 psi.
Tabela 10 - Condições de fragmentação para determinação dos compostos triptoquialaninas A e C por LC-MS/MS.
Micotoxinas Massa Molar
(g/mol)
SRM (m/z)
Íon precursor Íon produto
Energia de colisão (eV) tr (min) TA 518,2 519,2 197,2 *Q 22 2,61 519,2 213,0 *C1 22 2,61 519,2 457,1 *C2 5 2,61 TC 502,2 503,2 243,2 *Q 26 1,56 503,2 413,5 *C1 20 1,56 503,2 271,0 *C2 22 1,56
Fonte: O próprio autor. *Q = Quantificação *C1= Confirmação 1
Figura 26 - Cromatograma referente ao monitoramento das reações selecionadas
(SRM) dos compostos triptoquialanina A (TA) e triptoquialanina C (TC) obtidos a partir de fortificação em acetonitrila, através de LC-MS/MS.
Fonte: O próprio autor.
2.6.2 Teste de eficiência de extração dos compostos triptoquialaninas A e C
utilizando o método QuEChERS original
Após teste de extração realizado utilizando o método QuEChERS original e análise por LC-MS/MS, conforme condições estabelecidas no item 2.4.1. Foi possível afirmar que as condições otimizadas para separação cromatográfica e SRM obtidas anteriormente através de fortificação em solvente (acetonitrila), não foram reprodutíveis nos ensaios de recuperação realizados com fortificação no extrato do epicarpo, nos sugerindo que à presença de constituintes no extrato da matriz influenciaram na ionização dos compostos triptoquialaninas A e C (Figura 27), impedindo a detecção instrumental correta dos mesmos (INMETRO, 2016; SANCO, 2013).
TA
TC
Figura 27 - Cromatograma referente ao teste de recuperação preliminar no extrato
do epicarpo, o qual foi fortificado com os compostos triptoquialanina A (TA) e triptoquialanina C (TC), utilizando o método QuEChERS original e determinação através de monitoramento das reações selecionadas (SRM) em LC-MS/MS.
Fonte: O próprio autor.
2.6.3 Avaliação de efeito matriz
Analisando as curvas analíticas (Figura 28 e 29) e o gráfico de efeito matriz apresentados na Figura 30, observa-se a presença de co-extrativos em todas as camadas da laranja (epicarpo, mesocarpo e endocarpo), uma vez que há diferença de inclinação entre as curvas obtidas com fortificação no solvente (padronização externa) e no extrato da matriz (superposição na matriz). Isto torna evidente a influência dos co-extrativos, na variação da resposta entre padrão adicionado ao solvente e padrão adicionado aos extratos oriundos das camadas da laranja, sugerindo com isso, que à presença de co-extrativos provocaram supressão do sinal dos compostos estudados TA e TC. Portanto, para quantificação dos analitos de interesse, se faz necessário utilizar curvas analíticas provenientes de soluções preparadas em extrato da matriz isenta dos mesmos, conhecidas como superposição na matriz (SANCO, 2013).
Figura 28 - Curvas analíticas preparadas em extrato da matriz (epicarpo, mesocarpo
e endocarpo) e solvente para a triptoquialanina A. Fonte: O próprio autor.
Figura 29 - Curvas analíticas preparadas em extrato da matriz (epicarpo, mesocarpo
e endocarpo) e solvente para a triptoquialanina C. Fonte: O próprio autor.
Figura 30 - Gráfico para avaliação da influência do efeito matriz em cada camada da
laranja para os compostos triptoquialaninas A e C. Fonte: O próprio autor.
2.6.4 Otimização do método de extração QuEChERS através de planejamento fatorial 23
O planejamento fatorial 23, conforme item 2.4.5, foi utilizado para que todos os
fatores e suas interações fossem estudadas simultaneamente. A significância estatística dos fatores e as interações entre eles, foi avaliada a partir da porcentagem de recuperação de cada um dos compostos. Em base disso, foram calculados os efeitos e as estimativas dos erros padrão sendo considerados estatisticamente significativos com 95% de confiança, apenas os efeitos cujos valores do p-valor foram menores do que 0,05 ou α = 5 %, conforme Figuras 31 e 32.
Figura 31 - Gráfico de Pareto dos efeitos calculados no planejamento experimental
23 para otimização do método de extração QuEChERS original, considerando as
respostas (recuperações) e intervalos de confiança de 95% para avaliar a influência dos fatores em relação ao composto triptoquialanina A.
Fonte: O próprio autor.
Figura 32 - Gráfico de Pareto dos efeitos calculados no planejamento experimental
23 para otimização do método de extração QuEChERS original, considerando as
respostas (recuperações) e intervalos de confiança de 95% para avaliar a influência dos fatores em relação ao o composto triptoquialanina C.
Fonte: O próprio autor.
Efeitos
Observou-se que, o aumento da acidez do solvente de extração de 1% para 2% de ácido fórmico, não foi estatisticamente significativo a 95% de confiança, optou-se em mantê-lo em 1%.
O carvão ativado ao ter sua massa aumentada de 5 mg para 10 mg proporcionou efeito positivo para ambos os analitos e um extrato final mais limpo. A utilização de gelo seco em banho etanólico proporcionou o maior efeito de todos os fatores investigados. Ao analisar os ensaios que utilizaram gelo seco na etapa de partição líquido/líquido foi possível constatar que estes, foram os ensaios que obtiveram a maior recuperação para ambos os analitos, principalmente para triptoquialanina A, a qual foi obtida recuperação média 57 % maior conforme Tabela 11. Na Figura 33 (a) é possível observar precipitação de co-extrativos nos ensaios que utilizaram MgSO4 (Ensaios 1, 2, 3 e 4) em comparação aos ensaios que
utilizaram gelo seco (5, 6, 7 e 8) na Figura 33 (b). Pode ser confirmado também com 95% de confiança, que não há interações estatisticamente significativas entre os fatores, conforme Figuras 31 e 32. Após análises de todas as respostas, é possível inferir que as melhores condições para os ensaios de recuperação em ambos os analitos triptoquialaninas A e C, foram encontradas no ensaio 7 (adição de 1% de ácido fórmico ao solvente extrator, utilização de gelo seco na etapa de partição líquido/líquido e adição de 10 mg de carvão ativado na etapa de clean up).
Figura 33 - (a) extração realizada com o método QuEChERS utilizando MgSO4 na
etapa de partição e (b) extração realizada com utilização de gelo seco na etapa de partição.
Fonte: O próprio autor.
Tabela 11 - Resultados do planejamento fatorial 23 para avaliação simultânea dos
fatores.
Ensaios Triptoquialanina A Triptoquialanina C
Recuperação(%) CV(%) Recuperação(%) CV(%) 1 33 6 53 1 2 31 3 54 1 3 38 1 54 2 4 34 2 53 2 5 62 3 59 1 6 54 12 58 1 7 63 1 62 1 8 64 1 59 4
Fonte: O próprio autor.
2.7 VALIDAÇÃO DO MÉTODO ANALÍTICO
Foi possível observar que não existem picos cromatográficos nos mesmos tempos de retenção dos analitos triptoquialanina A e triptoquialanina C, ao comparar os extratos brancos (epicarpo, mesocarpo e endocarpo) com os extratos fortificados na concentração de 37 µg/kg (Figura 34).
Nos sugerindo que o método é seletivo. Segundo recomenda o guia de validação de métodos analíticos da comissão europeia SANCO, um método é considerado seletivo mesmo contendo substâncias interferentes com até 30% da concentração de LQ (SANCO, 2013).
(a) TA (b) TC (c) TA (d) TC (e) TA (f) TC
Figura 34 - Os cromatogramas dos extratos da matriz isentos dos analitos estão à
esquerda, (a) e (b) epicarpo; (c) e (d) mesocarpo; (e) e (f) endocarpo. Á direita se encontram os extratos fortificados na concentração de 37 µg/kg dos analitos triptoquialanina A e C. Fonte: O próprio autor.
As curvas analíticas em superposição na matriz foram construídas a partir da injeção dos extratos (epicarpo, mesocarpo e endocarpo), obtidos de amostras fortificadas em sete níveis de concentração dos analitos triptoquialanina A e C, na faixa de 5 a 400 µg/kg. A linearidade das curvas analíticas foram avaliadas por meio do coeficiente de correlação (r), coeficiente de determinação (R2), análise de
variância (ANOVA) e na estimativa da distribuição aleatória dos resíduos (SANCO, 2013).
Os parâmetros da ANOVA foram avaliados pelo teste F, com 95% de confiança (INMETRO, 2016). Foram obtidos coeficientes de correlação e determinação maiores que 0,998 para os analitos triptoquialanina A e C em todas as camadas da laranja, caracterizando um ajuste adequado do modelo. A análise da regressão mostrou valores de F calculado bem superior ao F tabelado, para os analitos em todas as camadas da laranja, sugerindo que há boa adequação da equação para os valores obtidos conforme Tabela 12 (ALMEIDA et al., 2002). A análise dos resíduos indicou distribuição aleatória através da linha dos resíduos com desvios na faixa de ± 20%, estabelecida conforme (SANCO, 2013), demonstrando a linearidade do método para os analitos em todas as camadas da laranja (epicarpo, mesocarpo e endocarpo) conforme Figuras 35 e 36.
Os valores de LD e LQ para os compostos triptoquialaninas A e C nas três camadas da laranja (epicarpo, mesocarpo e endocarpo) foram obtidos conforme Tabela 13. Os ensaios realizados obtiveram recuperações satisfatórias na faixa de 57 a 100% e coeficientes de variação ≤ 12% para os analitos nas três camadas da laranja estudadas. Com os dados obtidos, de acordo com a Tabela 14, é possível inferir a exatidão e a precisão do método.
Tabela 12 - Resultados para o teste F (95%) unicaudal, para análise da variância para os compostos TA e TC.
Triptoquialanina A Triptoquialanina C
Camadas da
laranja Parâmetro
Valores obtidos
F calculado F tabelado Parâmetro
Valores obtidos
F calculado F tabelado
Epicarpo MQR/MQr 10943,33 F1;28;95% = 4,20 MQR/MQr 6418,34 F1;25;95% = 4,24
Mesocarpo MQR/MQr 33128,80 F1;28;95% = 4,20 MQR/MQr 19902,95 F1;25;95% = 4,24
Endocarpo MQR/MQr 9610,86 F1;28;95% = 4,20 MQR/MQr 7782,62 F1;25;95% = 4,24
Fonte: O próprio autor
Tabela 13 - Parâmetros obtidos na validação do método para detecção das triptoquialaninas A e C nas camadas da laranja.
Camadas da laranja Micotoxinas Faixa linear (µg/kg) Linearidade r R2 Equação da reta LD (µg/kg) LQ (µg/kg) Epicarpo TA 5 - 400 0,9996 0,9992 y = 3739,96x + 7212,65 5 10 Epicarpo TC 5 - 400 0,9993 0,9986 y = 404,11x + 335,48 5 25 Mesocarpo TA 5 - 400 0,9985 0,9970 y = 4086,62x – 7898,44 5 10 Mesocarpo TC 5 - 400 0,9983 0,9966 y = 964,51x – 3479,11 5 10 Endocarpo TA 5 - 400 0,9991 0,9982 y = 3892,92x + 1141,88 5 10 Endocarpo TC 5 - 400 0,9989 0,9978 y = 1168,37x - 8803,96 5 10
Tabela 14 - Parâmetros obtidos dos ensaios de recuperação das triptoquialaninas A e C nas camadas da laranja. Camadas da laranja Micotoxinas Exatidão (n=5) Precisão (n=5) Recuperação (%) CV (%)
Baixo Médio Alto Baixo Médio Alto
Epicarpo TA 66 62 58 8 7 4 Epicarpo TC 72 59 57 7 4 7 Mesocarpo TA 96 92 92 4 3 3 Mesocarpo TC 100 98 88 5 2 4 Endocarpo TA 96 96 84 5 8 9 Endocarpo TC 94 96 81 3 7 12
Figura 35 - Curvas analíticas preparadas em extrato da matriz (epicarpo, mesocarpo
e endocarpo), para os compostos triptoquialaninas A e C. Fonte: O próprio autor.
Figura 36 - Gráficos dos resíduos para os compostos triptoquialaninas A e C nos
extratos do epicarpo, mesocarpo e endocarpo. Fonte: O próprio autor.
A melhor condição de separação cromatográfica com utilização de padrão interno, foi obtida a partir do teste 3 e pode ser visualizada na Figura 37. A eluição da fase móvel foi realizada em modo gradiente, com água suplementada com 0,1% de ácido fórmico (A) e acetonitrila (B) conforme Tabela 15. Os parâmetros instrumentais de análise otimizados no espectrômetro de massas são apresentados na Tabela 16.
Tabela 15 - Eluição gradiente otimizada para separação cromatográfica dos
compostos triptoquialanina A (TA) e triptoquialanina C (TC) e padrão interno ajmalicina (AJM). Teste-3 Tempo (min) B (%) 0 10 1 10 2 60 3 60 10 10
Fonte: O próprio autor.
Figura 37 - Separação cromatográfica e SRM dos compostos triptoquialanina A (TA)
e triptoquialanina C (TC) e padrão interno ajmalicina (AJM) otimizados. Fonte: O próprio autor.
5 x10 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 1,1 1,2 1,3
+ESI MRM Frag=100,0V CF=0,000 DF=0,000 CID@55,0 (353,1000 -> 210,1000) 150ppb FLV-r001.d
1 Tempo (min) 0,2 0,6 1 1,4 1,8 2,2 2,6 3 3,4 3,8 4,2 4,6 5 5,4 5,8 6,2 6,6 7 7,4 7,8 8,2 8,6 9 9,4 9,8 TA TC AJM
Tabela 16 - Condições de fragmentação otimizadas para determinação dos compostos triptoquialanina A (TA) e triptoquialanina C
(TC) e padrão interno ajmalicina (AJM) por LC-MS/MS.
Compostos Massa Molar
(g/mol)
SRM (m/z)
Íon precursor Íon produto
Energia de colisão (eV)
tr (min) TA 518,19 519,3 197,2 *Q 22 5,66 519,3 213,0 *C1 22 5,66 519,3 457,1 *C2 5 5,66 TC 502,19 503,2 243,2 *Q 26 5,28 503,2 413,5 *C1 20 5,28 503,2 271,0 *C2 22 5,28 AJM 352,43 353,1 144,1 *Q 30 4,59 353,1 117,0 *C1 55 4,59 353,1 210,1 *C2 20 4,59
Fonte: O próprio autor. *Q = Quantificação *C1= Confirmação 1
Foram construídas curvas analíticas através de superposição na matriz com e sem a utilização de padrão interno, conforme apresentado na Figura 38. As curvas obtidas com padrão interno para a TA e TC foram construídas a partir da razão das áreas (Padrão/Padrão interno). As curvas analíticas obtidas sem padrão interno para a TA e TC foram construídas de acordo com a área de cada composto. É possível observar que as curvas que utilizaram padrão interno apresentaram valores de coeficiente de correlação ligeiramente maiores frente as curvas que não utilizaram, nos sugerindo um bom ajuste do modelo para ambas. Os demais parâmetros obtidos para as duas curvas analíticas são apresentados na Tabela 17.
Figura 38 - Curvas analíticas em superposição na matriz (extrato epicarpo) para a
TA e TC. A esquerda estão as curvas obtidas com utilização de padrão interno e a direita estão as curvas sem a utilização de padrão interno. Fonte: O próprio autor.
r=0,9993
r=0,9981
r=0,9982
Para comparação das concentrações médias obtidas dos ensaios realizados com e sem utilização de padrão interno nas amostras do epicarpo, inicialmente foi necessário verificar se as variâncias eram equivalentes. Para tal, foi realizado teste de hipótese F unicaudal com 95% de significância, onde aceita-se a hipótese nula, Ho: (σ12 = σ22), ou seja, não existe diferença significativa entre as
variâncias e a hipótese alternativa, Ha: (σ12 ≠ σ22) existe diferença significativa entre
as variâncias. O valor do F(5,5; 95%)crítico= 5,05 foi obtido conforme tabelas (MILLER;
MILLER, 2005), em seguida foram encontrados os valores de Fcalculado= 2,48 para a
triptoquialanina A e Fcalculado= 0,11 para a triptoquialanina C. Como o valor do Fcrítico >
Fcalculado para ambos os compostos a hipótese nula, Ho foi aceita e as variâncias
puderam ser combinadas.
Após combinação das variâncias, foi então formulada a hipótese seguinte, onde se levou em conta o teste t bicaudal de comparação entre as concentrações médias obtidas dos dois métodos com 95% de significância. As hipóteses formuladas foram: hipótese nula, Ho: (µ = µo), não existe diferença significativa entre as médias, hipótese alternativa, Ha: (µ ≠ µo), existe diferença significativa entre as médias com t(10; 95%)crítico= 2,23 conforme (MILLER; MILLER, 2005), e o valor
calculado foi de tcalculado= 0 para TA e TC. Com base nos dados obtidos é possível
inferir que não existe diferenças significativas entre as concentrações médias obtidas dos ensaios com e sem a utilização de padrão interno a um nível de 95% de significância (Tabela 18). O que nos sugere que os valores referentes as curvas, recuperações e concentrações obtidas de amostras infectadas sem a utilização do padrão interno também são confiáveis.
Os valores obtidos a partir dessas análises, tem como intuito sugerir a confiabilidade dos dados gerados através da validação do método sem utilização de padrão interno. E em hipótese alguma, deixando de expressar a importância da utilização do mesmo para o desenvolvimento e validação de um método analítico, principalmente por tornar o método menos sensível a erros de injeção e variações instrumentais.
Tabela 17 - Parâmetros obtidos através de curvas analíticas com e sem a presença de padrão interno (AJM).
Camada da laranja
Padrão interno
(AJM) Micotoxinas Faixa linear (µg/kg) Linearidade (r) Equação da reta
Epicarpo Com TA 1-300 0,9993 y=0,212 * x - 0,023
Epicarpo Com TC 1-300 0,9981 y=0,013 * x - 0,003
Epicarpo Sem TA 1-300 0,9982 y=507,43 * x - 2306,14
Epicarpo Sem TC 1-300 0,9954 y=308,29 * x - 2308,33
Fonte: O próprio autor.
Tabela 18 - Parâmetros obtidos através de análises em amostras infectadas com e sem a presença de padrão interno (AJM).
Camadas da
laranja Micotoxinas
Com padrão interno Sem padrão interno
(n=6) (n=6) Concentração média (µg/kg) CV(%) Concentração média (µg/kg) CV(%) Epicarpo TA 19 11 19 7 Epicarpo TC 30 15 26 6