A validação é realizada após a conclusão do desenvolvimento do método ou antes que um método que não tenha sido usado anteriormente, seja introduzido para análise de rotina (SANCO, 2013). Pode ser compreendida também, como um processo de confirmação que o método desenvolvido, é adequado para o uso pretendido e assegura confiabilidade às medidas experimentais do método, sendo esta tão extensa, quanto necessário para atender aos requisitos em relação a sua aplicação (EURACHEM, 2014; INMETRO, 2016). Guias de procedimentos para desenvolvimento e validação de métodos analíticos voltados para as classes de micotoxinas ainda são muito escassos na literatura. É possível encontrar guias com métodos de análise para determinadas classes de micotoxinas em algumas commodities, como o guia Europeu (UE, 2014), porém o mesmo nem sempre pode ser adaptado para outras classes de micotoxinas, além das estabelecidas no protocolo.
Para determinação de resíduos de outras classes como: agrotóxicos e fármacos, existem alguns guias para validação de procedimentos analíticos, os quais permitem ser adaptados para diversas classes de compostos, esses guias não especificam uma única classe de analito, tendo suas abordagens mais relacionadas as figuras de mérito necessárias para a validação, sendo possível adaptá-los inclusive para micotoxinas. Dentre esses guias é possível destacar: ANVISA (Guia para o Controle de Qualidade para a Análise de Resíduos de Agrotóxicos em Alimentos para os Laboratórios Integrantes do PARA), SANCO (Method Validation and Quality Control Procedures for Pesticide Residues Analysis in Food and Feed, e principalmente os guias desenvolvidos pelo INMETRO (Orientações sobre Validação de Métodos Analíticos - Instituto Nacional de Metrologia) e EURACHEM (The Fitness for Purpose of Analytical Methods - A Laboratory Guide to Method Validation and Related Topics).
1.7.1 Seletividade
Seletividade é o grau em que o método pode quantificar o analito na presença de outros compostos, matrizes ou de outro material potencialmente interferente (INMETRO, 2016; EURACHEM, 2014). Deve também produzir respostas para vários analitos, mas que possa distinguir a resposta de um composto da de outros, é chamado seletivo (FDA, 2018).
Experimentos para avaliação da seletividade descritos na literatura sobre validação de métodos analíticos envolvem ensaios com padrões ou materiais de referência, amostras com e sem o analito, além da avaliação da capacidade de identificação do analito de interesse na presença de interferentes (INMETRO, 2016).
1.7.2 Linearidade
Linearidade de um procedimento analítico é a sua habilidade (dentro de uma faixa de trabalho determinada) em obter resultados os quais são diretamente proporcionais à concentração do analito na amostra (EMEA, 2006).
É obtida pela resposta do sinal do detector em função da concentração do analito, sendo que, a faixa linear é definida como o intervalo no qual a sensibilidade pode ser considerada constante ou a resposta do detector é diretamente proporcional à concentração (INMETRO, 2016; NATA, 2018).
O método de superposição de matriz (“matrix-matched”) consiste na adição do padrão da substância em diversas concentrações em uma matriz similar à da amostra, isenta da substância, e construção da curva analítica relacionando as áreas obtidas com as concentrações dos padrões (SANCO, 2013). O método de superposição de matriz pode ser utilizado para calibração, tanto com a padronização interna, como com a padronização externa. Este método é usado para compensar o efeito da matriz ou de possíveis interferentes e é de suma importância em determinações quando a matriz pode interferir na pré-concentração, extração, separação ou detecção da substância de interesse (RIBANI et al., 2004).
1.7.3 Padronização interna
O método consiste em adicionar uma quantidade conhecida de uma substância (padrão interno) na amostra a ser analisada e relacionar as áreas dos padrões de interesse com as áreas do padrão interno adicionado. Idealmente, a substância usada como padrão interno deve ter estrutura similar à substância a ser quantificada, não fazer parte da amostra, ter concentração e tempo de retenção próximos a essa substância e ficar separada das demais substâncias presentes na amostra (SANCO, 2013; BS EN 15662, 2008). O método utilizando padrão interno é também menos sensível a erros de injeção e variações instrumentais (EURACHEM, 2014).
Foi utilizado como padrão interno a ajmalicina fórmula molecular C21H24N2O3, Metil(1S,15R,20S)‐17‐oxa‐3,13diazapentaciclo henicosa 2(10),4,6,8,18‐
penteno‐19 carboxilato, massa molecular de 352,43 g.mol-1 e CAS Number 489-04-5
conforme Figura 9. A ajmalicina é um metabólito produzido na biossíntese de alcalóides indólicos (produção de serpentina); encontrado naturalmente em várias plantas, como Rauwolfia spp., Catharanthus roseus e Mitragyna speciosa (CONNOR, 2011; JALEEL et al., 2007).
Figura 9 - Estruturas dos compostos apresentadas na seguinte ordem:
triptoquialanina A (TA) C27H26N4O7, triptoquialanina C (TC) C27H26N4O6 e ajmalicina
(AJM) C21H24N2O3 (padrão interno), os três compostos fazem parte do grupo dos
alcaloides indólicos.
Fonte: Adaptado de ARIZA 2002; CONNOR, 2011.
TA
TC
AJM
1.7.4 Limite de detecção e quantificação
O limite de detecção (LD) de um procedimento analítico individual é a menor quantidade de analito na amostra que pode ser detectada, mas não necessariamente quantificada sob as condições estabelecidas para o ensaio (INMETRO, 2016; NATA, 2018). O limite de detecção para um procedimento analítico pode variar em função do tipo da amostra. É fundamental assegurar-se de que todas as etapas de processamento do método analítico sejam incluídas na determinação desse limite de detecção, também importante para ensaios qualitativos (SANCO, 2013).
O limite de quantificação (LQ) de um procedimento analítico individual é a menor quantidade do analito na amostra que pode ser quantitativamente determinada com precisão e exatidão aceitáveis (MILLER; MILLER, 2005).
Após determinação do (LQ), o mesmo deve ser testado com amostras independentes no mesmo nível de concentração/propriedade do (LQ), para averiguar se a recuperação/tendência e a precisão conseguidas são satisfatórias. O limite de quantificação é de grande importância para os métodos quantitativos. Dentre as diversas abordagens para se calcular o limite de detecção e quantificação, neste estudo optou-se pela relação sinal/ruído.
A relação sinal/ruído é determinada pela comparação dos sinais medidos de amostras com baixas concentrações conhecidas do analito e dos ruídos dos brancos de amostras, definindo-se a concentração mínima em que o analito pode ser detectado com confiança (INMETRO, 2016).
Uma relação sinal/ruído de 3:1 é geralmente considerada aceitável para estimativa do limite de detecção (NATA, 2018). E para a estimativa do limite de quantificação, é utilizada a relação sinal/ruído de 10:1.
1.7.5 Exatidão
A exatidão de um método analítico é a proximidade dos resultados obtidos pelo método em estudo em relação ao valor considerado verdadeiro ou teórico (INMETRO, 2016).
O processo utilizado para avaliar a exatidão foi baseado em ensaios de recuperação, no qual uma quantidade conhecida de analito é adicionada a amostra, e após extração é possível ser quantificada e comparada com o valor de referência/teórico (RIBANI et al., 2004)
1.7.6 Precisão
A precisão é a avaliação da proximidade dos resultados obtidos em uma série de medidas de uma amostragem múltipla de uma mesma amostra (RIBANI et al., 2004).
A repetibilidade foi adotada como forma de avaliar a precisão do método. Esta, pode ser expressa quantitativamente em termos da característica da dispersão dos resultados e pode ser determinada por meio da análise de padrões, material de referência ou adição do analito ao branco da amostra, em várias concentrações na faixa de trabalho (INMETRO, 2016).
2 OBJETIVOS
Este trabalho tem como objetivo geral isolar, caracterizar e determinar os compostos triptoquialanina A (TA) e triptoquialanina C (TC) nas três camadas da laranja (epicarpo, mesocarpo e endocarpo), durante os diferentes estágios de infecção do Penicillium digitatum no hospedeiro citros, utilizando cromatografia líquida acoplada ao espectrômetro de massas sequencial (LC-MS/MS).