Isolamento, caracterização e determinação de alcaloides triptoquialanina A e triptoquialanina C produzidos pelo fungo Penicillium digitatum durante infecção no hospedeiro citros

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE QUÍMICA

ÉDER DE VILHENA ARAÚJO

ISOLAMENTO, CARACTERIZAÇÃO E DETERMINAÇÃO DE ALCALOIDES TRIPTOQUIALANINA A E TRIPTOQUIALANINA C PRODUZIDOS PELO FUNGO

Penicillium digitatum DURANTE INFECÇÃO NO HOSPEDEIRO CITROS

CAMPINAS 2018

ÉDER DE VILHENA ARAÚJO

ISOLAMENTO, CARACTERIZAÇÃO E DETERMINAÇÃO DE ALCALOIDES TRIPTOQUIALANINA A E TRIPTOQUIALANINA C PRODUZIDOS PELO FUNGO

Penicillium digitatum DURANTE INFECÇÃO NO HOSPEDEIRO CITROS

Dissertação de Mestrado apresentada ao Instituto de Química da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestre em Química na área de Química analítica

Orientadora: Profa. Dra. Taicia Pacheco Fill

Coorientadora: Profa. Dra. Cassiana Carolina Montagner Raimundo

O arquivo digital corresponde à versão final da Dissertação defendida pelo aluno Éder de Vilhena Araújo e orientada pela Profa. Dra. Taicia Pacheco Fill.

CAMPINAS 2018

AGRADECIMENTOS

Gostaria de agradecer a todos aqueles que direta ou indiretamente, contribuíram de forma positiva para a realização deste trabalho.

A todos da minha família, que mesmo apesar da minha ausência sempre foram presença viva nos meus pensamentos em momentos felizes e de dificuldades. Obrigado por todo amor e gestos de compreensão.

À Universidade Estadual de Campinas, UNICAMP, em particular ao Instituto de Química, pela oportunidade de realizar o mestrado.

Ao Fundo de Apoio ao Ensino, à Pesquisa e à Extensão, FAEPEX- FUNCAMP, pela concessão da bolsa de estudos.

A todos os professores do Instituto de Química.

Em especial, à Profa. Dra. Taicia Pacheco Fill, pela oportunidade, incentivo, confiança, pelos ensinamentos transmitidos e pela dedicada orientação.

À Profa. Dra. Cassiana Carolina Montagner Raimundo, pela disponibilidade, contribuições, ensinamentos transmitidos e importantes sugestões para o desenvolvimento desse trabalho.

À Profa. Dra. Ljubica Tasic pela atenção especial durante a ausência da Profa. Dra. Taícia, por motivos acadêmicos.

Aos membros da banca pelas importantes contribuições.

Em especial, à Profa. Dra. Susanne Rath pelas suas valiosas e importantes colaborações.

A todos colegas do grupo do Laboratório de Química Ambiental, LQA, Cristiane Vidal, Raphael Acayaba e Diego Campaci e também colegas do Laboratório de Biologia Química Microbiana, LaBioQuiMi, Aline Guadalupe e João Guilherme, pelas contribuições, conselhos, paciência, pelos momentos de diversão, e além de tudo pela amizade.

RESUMO

Os fungos em geral, são responsáveis por grandes perdas no pós-colheita em diversas commodities. Em especial, o Penicillium digitatum, que é responsável por até 90% das perdas totais à citricultura brasileira no pós-colheita. Durante infecção no hospedeiro citros o fitopatógeno P.digitatum sintetiza os alcaloides do tipo triptoquialaninas A e C, in vivo, o que poderia representar um problema para a população mundial, uma vez que as micotoxinas produzidas por fungos em geral são notoriamente tóxicas. Os objetivos deste trabalho foram isolar, caracterizar e desenvolver e validar um método analítico para determinação das triptoquialaninas A e C durante infecção do fungo P.digitatum em laranja (camadas: epicarpo, mesocarpo e endocarpo), avaliando o grau de difusão dessas micotoxinas em diferentes estágios de infecção. A purificação dos padrões foi realizada através de técnicas cromatográficas e os compostos foram caracterizados por técnicas de RMN (1_H, 13_{C, HSQC, HMBC) e cromatografia líquida acoplada a espectrometria de}

massas de alta resolução (LC-HR-MS). Os padrões dos alcaloides purificados foram então utilizados para desenvolver e validar o método analítico o qual consistiu na extração dos analitos pelo procedimento QuEChERS modificado e otimizado com auxílio de planejamento experimental. A quantificação dos analitos foi realizada por cromatografia líquida acoplada a espectrômetro de massas em sequencial (LC-MS/MS). A linearidade obtida foi de 5 – 400 μg/kg com r > 0,99 para as triptoquialaninas A e C. Os limites de detecção (LD) e quantificação (LQ) obtidos foram 5 μg/kg e 10 μg/kg, com exceção para o composto TC no extrato do epicarpo, onde foi obtido o LQ de 25 μg/kg. A exatidão foi obtida por ensaios de recuperações na faixa de 58 a 101%, com desvios padrão relativo (RSDs) ≤ 12%. A presença dos analitos triptoquialaninas A e C na laranja, foi identificada em diferentes graus de infecção, mostrando que a difusão dos metabólitos só ocorre a partir do estágio intermediário da infecção. Além disso, a determinação dos compostos na camada do epicarpo (branco), o qual ficou em contato direto por 48 horas com laranja infectada, indicou a contaminação pelos alcaloides, após o período de exposição estudado. Os compostos triptoquialaninas A e C não demonstraram capacidades antiproliferativas e de citotoxicidade nos testes realizados (HeLa, HUVEC e K-562), o que nos sugere ausência das atividades para as células analisadas.

ABSTRACT

Fungi, are responsible for large post-harvest losses in various commodities. In particular, Penicillium digitatum, which is responsible for up to 90% of the total losses to the Brazilian citrus crop in the post-harvest period. During infection in the citrus host, the phytopathogen P.digitatum synthesizes tryptoquialanines A and C alkaloids in vivo, which could represent a problem for the world population, since mycotoxins produced by fungi in general are notoriously toxic. The objective of this project were to isolate, characterize and develop and validate an analytical method to determination of tryptoquialanines A and C during the infection of the fungus P.digitatum in orange (layers: epicarp, mesocarp and endocarp), evaluating the level of diffusion of these mycotoxins in different stages of infection. Purification of the standards was performed by chromatographic techniques and the compounds were characterized by NMR (1_H, 13_{C, HSQC, HMBC) and Liquid Chromatographic coupled}

to High Resolution Mass Spectrometry (LC-HR-MS) techniques. The purified alkaloid standards were then used to develop and validate the analytical method which employed the QuEChERS extraction method, modified with the aid of experimental planning and the quantification of the analytes was carried out by Liquid Chromatography coupled to Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS). The linearity obtained was 5 - 400 μg/kg with r > 0.99 for tryptoquialanines A and C. The limits of detection (LOD) and quantification (LOQ) were 5 μg/kg and 10 μg/kg, with the exception of the TC compound in the epicarp extract, where the LQ was 25 μg/kg. The recoveries between 58 and 101%, with relative standard deviations (RSDs) ≤ 12% showed the accuracy of the method. The presence of the tryptoquialanines A and C was observed in different levels of infection of the orange, showing the diffusion of the metabolites occurs only from the intermediate stage of the infection. In addition, the presence of the compounds in the epicarp layer (blank), which was in direct contact for 48 hours with infected orange, showed the contamination process among oranges by the alkaloids, after this exposure period. Tryptoquialanines compounds A and C did not demonstrate antiproliferative and cytotoxicity abilities in the tests performed (HeLa, HUVEC and K-562), which suggests absence of activities for the analyzed cells.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 - Camadas da laranja: epicarpo (casca do fruto), mesocarpo (pele

branca) e endocarpo (sumo do fruto).

22

Figura 2 - Composição química percentual dos constituintes da laranja: (1)

Água; (2) Açucares solúveis; (3) Fibras; (4) Ácidos orgânicos; (5) aminoácidos e proteínas; (6) Minerais; (7) Óleos e lipídeos.

23

Figura 3 - Aproveitamento industrial da laranja a partir de 1000 kg de

laranja.

24

Figura 4 - Percentual de aproveitamento industrial por laranja em sua

totalidade.

25

Figura 5 – Na figura 5 é possível destacar a visão ampliada dos conídeos e

conidiófaros de cor verde-oliva produzidos por P.digitatum durante infecção em hospedeiro citros.

26

Figura 6 – Mapa mundial referente aos países onde foram registradas as

ocorrências de Penicillium digitatum ao longo dos anos.

26

Figura 7 - Infecção provocada pelo P.digitatum em hospedeiro citros

estimulada através da ocorrência de pequenos ferimentos no fruto.

27

Figura 8 - Estruturas químicas dos metabólitos secundários triptoquialanina

A (TA) C27H26N4O7 e triptoquialanina C (TC) C27H26N4O6 produzidos pelo

fungo P.digitatum durante a infecção em seu hospedeiro citros.

28

Figura 9 – Estruturas químicas dos compostos apresentados na seguinte

ordem: triptoquialanina A (TA) C27H26N4O7, triptoquialanina C (TC)

C27H26N4O6 e ajmalicina (AJM) C21H24N2O3 (padrão interno), os três

compostos fazem parte dos alcaloides indólicos.

38

Figura 10 – Cromatograma referente ao monitoramento de íon selecionado

(SIM) para m/z 519, realizado para comparação entre o extrato controle (1) e o extrato infectado (2).

57

Figura 11 – Cromatograma referente ao monitoramento de íon selecionado

(SIM) para m/z 503 realizado para comparação entre o extrato controle (1) e o extrato infectado (2).

Figura 12 – Cromatograma referente ao monitoramento de íon selecionado

(SIM) para m/z 519 e m/z 503 realizado para comparação entre (1) TA extraída em acetonitrila suplementada com 1% de ácido fórmico; (2) TA extraída em acetato de etila; (3) TC extraída em acetonitrila suplementada com 1% de ácido fórmico; (4) TC extraída em acetato de etila.

59

Figura 13 – Cromatograma utilizado para comparação da eficiência dos

meios de cultura na produção dos compostos triptoquialaninas A e C, através da área média obtida para cada meio de cultura utilizado, com destaque aos meios BDA e BD.

60

Figura 14 – Condição cromatográfica otimizada para separação dos

compostos TC e TA em HPLC-DAD-analítico a partir do extrato obtido conforme item 1.4.11.

62

Figura 15 – Reprodução das condições cromatográficas otimizadas e

isolamento dos compostos TC (banda 19) e TA (banda 30) em HPLC-PDA-preparativo.

62

Figura 16 – (a) Estrutura química do composto TA; (b) Estrutura do

composto TA com os respectivos deslocamentos δ de 1_{H em ppm.}

63

Figura 17 - (a) Estrutura química do composto TA; (b) Estrutura do

composto TA com os respectivos deslocamentos δ de 13_{C em ppm.}

65

Figura 18 – (a) Estrutura química do composto TC; (b) Estrutura do

composto TC com os deslocamentos de 1_{H δ em ppm; (c) Estrutura do}

composto TC com os deslocamentos de 13_{C δ em ppm.}

69

Figura 19 - Espectro de massas de alta resolução (full scan) no modo

positivo referente a banda cromatográfica 30 obtida no HPLC-PDA-preparativo confirmando o isolamento do composto triptoquialanina A e sua fórmula molecular (C27H26N4O7).

72

Figura 20 - Espectro de massas de alta resolução (full scan) no modo

positivo referente a banda cromatográfica 19 obtida no HPLC-PDA-preparativo confirmando o isolamento do composto triptoquialanina C e sua fórmula molecular (C27H26N4O6).

73

Figura 21 - A esquerda espectro em 2D referente ao perfil cromatográfico do

metanol e a direita espectro em 3D onde é possível avaliar absorção em diferentes comprimentos de onda na faixa de λ = 200 a 800 nm.

Figura 22 - A esquerda espectro em 2D referente ao perfil cromatográfico da

TC onde é possível observar as áreas integradas, impurezas e pureza obtida do composto de 98,5% e a direita espectro em 3D onde é possível avaliar absorção em diferentes comprimentos de onda na faixa de λ = 200 a 800 nm.

74

Figura 23 - A esquerda espectro em 2D referente ao perfil cromatográfico da

TA onde é possível observar as áreas integradas, impurezas e pureza obtida do composto de 99,1% e a direita espectro em 3D onde é possível avaliar absorção em diferentes comprimentos de onda na faixa de λ = 200 a 800 nm.

75

Figura 24 – Preparo e obtenção das amostras de laranja (1) Epicarpo, (2)

Mesocarpo, (3) Endocarpo.

82

Figura 25 – Fluxograma do método de extração QuEChERS original,

utilizado como teste de recuperação preliminar dos compostos TA e TC.

83

Figura 26 – Cromatograma referente ao monitoramento das reações

selecionadas (SRM) dos compostos triptoquialanina A (TA) e triptoquialanina C (TC) obtidos a partir de fortificação em acetonitrila, através de LC-MS/MS.

91

Figura 27 – Cromatograma referente ao teste de recuperação preliminar no

extrato do epicarpo, o qual foi fortificado com os compostos triptoquialanina A (TA) e triptoquialanina C (TC), utilizando o método QuEChERS original e determinação através de monitoramento das reações selecionadas (SRM) em LC-MS/MS.

92

Figura 28 – Curvas analíticas preparadas em extrato da matriz (epicarpo,

mesocarpo e endocarpo) e solvente para triptoquialanina A.

93

Figura 29 – Curvas analíticas preparadas em extrato da matriz (epicarpo,

mesocarpo e endocarpo) e solvente para a triptoquialanina C.

93

Figura 30 – Gráfico para avaliação da influência do efeito matriz em cada

camada da laranja para os compostos triptoquialaninas A e C.

94

Figura 31 – Gráfico de pareto dos efeitos calculados no planejamento

experimental 23 _{para otimização do método de extração QuEChERS original,}

considerando as respostas(recuperações) e intervalos de confiança de 95% para avaliar a influência dos fatores em relação ao composto triptoquialanina A.

Figura 32 – Gráfico de Pareto dos efeitos calculados no planejamento

experimental 23 _{para otimização do método de extração QuEChERS original,}

considerando as respostas (recuperações) e intervalos de confiança de 95% para avaliar a influência dos fatores em relação ao composto triptoquialanina C.

95

Figura 33 – (a) Extração realizada com o método QuEChERS utilizando

MgSO4 na etapa de partição e (b) Extração realizada com utilização de gelo

seco na etapa de partição.

96

Figura 34 – Os cromatogramas dos extratos da matriz isentos dos analitos

estão à esquerda (a) e (b) epicarpo, (c) e (d) mesocarpo; (e) e (f) endocarpo. À direita se encontram os extratos fortificados na concentração de 37 µg/kg dos analitos triptoquialaninas A e C.

98

Figura 35 – Curvas analíticas preparadas em extrato da matriz (epicarpo,

mesocarpo e endocarpo), para os compostos triptoquialaninas A e C.

102

Figura 36 – Gráficos dos resíduos para os compostos triptoquialaninas A e

C nos extratos do epicarpo, mesocarpo e endocarpo.

103

Figura 37 – Separação cromatográfica e SRM dos compostos

triptoquialanina A (TA) e triptoquialanina C (TC) e padrão interno ajmalicina (AJM) otimizados.

104

Figura 38 – Curvas analíticas em superposição na matriz (extrato epicarpo)

para a TA e TC. À esquerda estão as curvas sem a utilização de padrão interno.

106

Figura 39 – Estágios de infecção do fungo P.digitatum inicial (formação do

micélio), intermediário (esporulação em aproximadamente 25% do fruto) e final (esporulação em aproximadamente 50% do fruto).

112

Figura 40 – Análise referente ao experimento 2, o qual utilizou o hemisfério

inferior ao da região infectada da laranja, durante o estágio inicial de infecção (formação do micélio branco).

114

Figura 41 – Análise referente ao experimento 3, o qual avaliou a laranja

branco após 48 horas de contato direto com a região da laranja infectada em estágio intermediário (esporulação em aproximadamente 25% do fruto).

114

Figura A1 - Espectro de RMN de 1_{H (500 MHz, CDCl3) triptoquialanina A. 137}

Figura A2 - Espectro de RMN de 1_{H (500 MHz, CDCl3) triptoquialanina A}

(espectro ampliado – deslocamento δ faixa 8,20 – 7,70 ppm).

138 139

Figura A3 - Espectro de RMN de 1_{H (500 MHz, CDCl}

3) triptoquialanina A

(espectro ampliado – deslocamento δ faixa 7,60 – 6,90 ppm).

140

Figura A4 - Espectro de RMN de 1_{H (500 MHz, CDCl}

3) triptoquialanina A

(espectro ampliado – deslocamento δ faixa 6,30 – 5,10 ppm).

141

Figura A5 - Espectro de RMN de 1_{H (500 MHz, CDCl}

3) triptoquialanina A

(espectro ampliado – deslocamento δ faixa 3,35 – 2,60 ppm).

142

Figura A6 - Espectro de RMN de 1_{H (500 MHz, CDCl}

3) triptoquialanina A

(espectro ampliado – deslocamento δ faixa 2,30 – 1,10 ppm).

143

Figura B1 - Espectro de RMN de 13_{C (125 MHz, CDCl}

3) triptoquialanina A. 144

Figura B2 - Espectro de RMN de 13_{C (125 MHz, CDCl}

3) triptoquialanina A

(espectro ampliado – deslocamento δ faixa 180 – 138 ppm).

145

Figura B3 - Espectro de RMN de 13_{C (125 MHz, CDCl}

3) triptoquialanina A

(espectro ampliado – deslocamento δ faixa 136 – 115 ppm).

146

Figura B4 - Espectro de RMN de 13_{C (125 MHz, CDCl}

3) triptoquialanina A

(espectro ampliado – deslocamento δ faixa 90 – 0 ppm).

147

Figura C1 - Espectro de RMN de 1_{H (500 MHz, CDCl}

3) triptoquialanina C. 148

Figura C2 - Espectro de RMN de 1_{H (500 MHz, CDCl}

3) triptoquialanina C

(espectro ampliado – deslocamento δ faixa 8,50 – 7,75 ppm).

149

Figura C3 - Espectro de RMN de 1_{H (500 MHz, CDCl}

3) triptoquialanina C

(espectro ampliado – deslocamento δ faixa 7,70 – 7,35 ppm).

150

Figura C4 - Espectro de RMN de 1_{H (500 MHz, CDCl}

3) triptoquialanina C

(espectro ampliado – deslocamento δ faixa 6,35 – 5,10 ppm).

151

Figura C5 - Espectro de RMN de 1_{H (500 MHz, CDCl}

3) triptoquialanina C

(espectro ampliado – deslocamento δ faixa 3,30 – 2,90 ppm).

152

Figura C6 - Espectro de RMN de 1_{H (500 MHz, CDCl}

3) triptoquialanina C

(espectro ampliado – deslocamento δ faixa 2,30 – 1,40 ppm).

153

Figura D1 - Mapa de contorno de RMN 2D (500 MHz, CDCl3) de correlações

1_{H e} 13_{C HSQC para a triptoquialanina C.}

154

Figura D2 - Mapa de contorno de RMN 2D (500 MHz, CDCl3) de correlações

1_{H e} 13_{C HMBC para a triptoquialanina C.}

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Parâmetros físico-químicos da molécula triptoquialanina A (TA). 29

Tabela 2 - Parâmetros físico-químicos da molécula triptoquialanina C (TC). 29

Tabela 3 - Visão geral da legislação para micotoxinas no mundo. 31

Tabela 4 - Atribuição dos deslocamentos químicos experimentais δ de 1_H

através de comparação com dados na literatura para o composto triptoquialanina A (500 MHz, CDCl3).

64

Tabela 5 - Atribuição dos deslocamentos químicos experimentais δ de 13_C

através de comparação com dados na literatura para o composto triptoquialanina A (125 MHz, CDCl3).

66

Tabela 6 - Atribuição dos deslocamentos químicos experimentais através de

correlação de 1_{H e} 13_{C para δ o composto triptoquialanina C (500 MHz,}

CDCl3), através de HSQC e HMBC.

70

Tabela 7 - Condições do espectrômetro de massas LC-MS/MS em modo de

ionização positivo (ESI+_).

81

Tabela 8 - Planejamento fatorial 23 _{para otimização do método de extração}

QuEChERS.

85

Tabela 9 - Otimização de separação cromatográfica para os compostos TA,

TC e AJM utilizando LC-MS/MS.

87

Tabela 10 - Condições de fragmentação para determinação dos compostos

triptoquialaninas A e C por LC-MS/MS.

90

Tabela 11 – Resultados do planejamento fatorial 23 _{para avaliação}

simultânea dos fatores.

97

Tabela 12 – Resultados para o teste F (95%) unicaudal, para análise da

variância para os compostos TA e TC.

100

Tabela 13 – Parâmetros obtidos na validação do método para detecção das

triptoquialaninas A e C nas camadas da laranja.

100

Tabela 14 – Parâmetros obtidos dos ensaios de recuperação das

triptoquialaninas A e C nas camadas da laranja.

101

Tabela 15 – Eluição gradiente otimizada para separação cromatográfica dos

compostos triptoquialanina A (TA) e triptoquialanina C (TC) e padrão interno ajmalicina (AJM).

Tabela 16 – Condições de fragmentação otimizadas para determinação dos

compostos triptoquialanina A (TA) e triptoquialanina C (TC) e padrão interno (AJM) por LC-MS/MS.

105

Tabela 17 – Parâmetros obtidos através de curvas analíticas com e sem a

presença de padrão interno (AJM).

108

Tabela 18 – Parâmetros obtidos através de análises em amostras infectadas

com e sem a presença de padrão interno (AJM).

108

Tabela 19 – Concentração das triptoquialaninas A e C durante os estágios

de infecção: inicial, intermediário e final.

116

Tabela 20 - Detecção das triptoquialaninas A e C durante análise nos

experimentos 1,2 e 3.

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AJM – ajmalicina

ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária

BCRP – Proteína Resistente ao Câncer de Mama (Breast Cancer Resistentance Protein)

BD – Batata-dextrose

BDA – Batata-dextrose ágar

BD (est) – Batata-dextrose em condição estacionária

BOD – Demanda Bioquímica de Oxigênio (Biochemical Oxygen Demand) CABI – Centro Internacional para Agricultura e Biociências (Centre for Agriculture and Biosciences International)

CEASA – Central Estadual de Abastecimento de Sociedade Anônima DMSO – Dimetil-sulfóxido

CC50 – Concentração Citotóxica necessária para causar morte em 50% das

células

ESI – Ionização por eletrospray (Eletrospray Ionization) EU – União Europeia (European Union)

FAO – Organização para alimentação das Nações Unidas (Food and Agriculture Organization)

FDA – Administração de Alimentos e Drogas dos Estados Unidos (Food and Drug Administration)

GI50 – Inibição de 50% do crescimento celular (Growth Inhibition)

Ha - Hipótese alternativa

HeLa – Linhagem de células epiteliais de carcinoma de colo de útero humano (Human epithelial

HMBC – Coerência Heteronuclear através de múltiplas ligações (Heteronuclear Multiple Bond Coherence)

Ho - Hipótese nula

HPLC – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (High Performance Liquid Chromatography)

HSQC - Correlação Heteronuclear simples-Quântica (Heteronuclear Single Quantum Correlation)

HUVEC – Células endoteliais da veia umbilical humana (Human Umbilical Vein Endothelial Cell)

LaBioQuiMi - Laboratório de Biologia Química Microbiana

LC-HR-MS - Cromatografia Líquida Acoplada a Espectrometria de Massas de Alta Resolução (Liquid Chromatography Coupled to High Resolution Mass Spectrometry)

LC-MS/MS – Cromatografia Líquida Acoplada a Espectrometria de Massas Sequencial (Liquid Chromatography Coupled to Tandem Mass Spectrometry)

LD – Limite de Detecção LQ – Limite de Quantificação

MQR – Média Quadrática da regressão

MQr -Média Quadrática dos resíduos

SRM (monitoramento de reação selecionada para múltiplos íons produtos provenientes de um ou mais íons precursores)

NMT – Níveis Máximos Toleráveis OE – Óleos essenciais

OECD – Organização para Cooperação Econômica e Desenvolvimento (Organization for Economic Cooperation and Development)

PSA - Amina Primária e Secundária (Primary-Secondary Amine) PTFE – Politetrafluoretileno

QuEChERS - Rápido, Fácil, Barato, Efetivo, Robusto e Seguro (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe)

RMN – Ressonância Magnética Nuclear

SIM - Monitoramento do Íon Selecionado (Selected Ion Monitoring) TA – triptoquialanina A

TC – triptoquialanina C

TIC - Cromatograma de Íon Total (Total Ion Chromatogram) TMS – Tetra-metil-silano

UHPLC – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (High Performance Liquid Chromatography)

USDA – Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (United States Department of Agriculture)

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 21

1.1 CITRICULTURA NO BRASIL 21

1.2 CAMADAS DA LARANJA (EPICARPO, MESOCARPO E ENDOCARPO) 22

1.3 COMPOSIÇÃO QUÍMICA DA LARANJA 23

1.4 Penicillium digitatum 25

1.5 MICOTOXINAS 29

1.6 TÉCNICAS ANALÍTICAS PARA DETERMINAÇÃO DE MICOTOXINAS EM ALIMENTOS

33 1.6.1 Técnica de preparo de amostras QuEChERS versão original 34 1.6.2 Técnicas cromatográficas para determinação de micotoxinas em

alimentos

35

1.7 VALIDAÇÃO DO MÉTODO ANALÍTICO 36

1.7.1 Seletividade 37

1.7.2 Linearidade 37

1.7.3 Padronização interna 38

1.7.4 Limite de detecção e quantificação 39

1.7.5 Exatidão 39

1.7.6 Precisão 40

2 OBJETIVOS 41

2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 41

CAPÍTULO 1 – OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DOS COMPOSTOS TRIPTOQUIALANINAS A E C

44

1 INTRODUÇÃO 45

1.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 45

1.2 EQUIPAMENTOS E CONDIÇÕES DE ANÁLISE 46

1.3 MATERIAIS E REAGENTES 48

1.4 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 49

1.4.1 Cultivo do fungo Penicillium digitatum in vitro 49 1.4.2 Preparo da suspensão de esporos do Penicillium digitatum 49

1.4.3 Contagem do número de conídeos em placa 49

1.4.4 Inoculação do fungo Penicillium digitatum in vivo e análise dos extratos por UPLC-MS

1.4.5 Avaliação da efetividade dos solventes de extração acetonitrila e acetato de etila para obtenção dos compostos TA e TC a partir de laranjas infectadas

50

1.4.6 Cultivo do fungo Penicillium digitatum in vitro 51 1.4.6.1 Inoculação do fungo P.digitatum em BDA (batata-dextrose-agar) e

Czapeck com NH4Cl (meios sólidos)

51

1.4.6.2 Inoculação do fungo P.digitatum em BD (batata-dextrose) e Czapeck, NH4Cl com levedura (meios líquidos)

52

1.4.7 Extração dos compostos de interesse 52

1.4.7.1 Extração dos meios de cultura sólidos BDA e Czapeck com NH4Cl 52

1.4.7.2 Extração e análise dos meios de cultura líquidos BD (batata-dextrose) e Czapeck e NH4Cl com levedura

53

1.4.8 Cultivo do fungo Penicillium digitatum em larga escala visando a produção de padrões analíticos

53

1.4.9 Isolamento das triptoquialaninas A e C 54

1.4.10 Caracterização dos compostos triptoquialaninas A e C 55

1.4.11 Pureza dos compostos 55

1.5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 57

1.5.1 Detecção dos compostos triptoquialaninas A e C produzidos por P.digitatum in vivo

57

1.5.2 Avaliação da efetividade dos solventes de extração acetonitrila e acetato de etila para obtenção dos compostos TA e TC a partir de laranjas infectadas

58

1.5.3 Seleção do meio de cultura mais eficiente para produção dos compostos TA e TC

59

1.5.4 Isolamento das triptoquialaninas A e C produzidas pelo fungo Penicillium digitatum

60

1.5.5 Caraterização dos compostos TA e TC 63

1.5.5.1 Caracterização por Ressonância Magnética Nuclear do composto TA 63 1.5.5.2 Caracterização por Ressonância Magnética Nuclear do composto TC 68 1.5.6 Caracterização por espectrometria de massas de alta resolução dos

compostos triptoquialaninas A e C

72

CAPÍTULO 2 – DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DO MÉTODO ANALÍTICO

76

2 INTRODUÇÃO 77

2.1 OBJETIVO ESPECÍFICO 77

2.2 EQUIPAMENTOS E CONDIÇÕES DE ANÁLISE 78

2.3 MATERIAIS E REAGENTES 79

2.4 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 80

2.4.1 Determinação de condições para análises dos compostos triptoquialaninas A e C por LC-MS/MS

80

2.4.1.1 Preparo de soluções-padrão 80

2.4.1.2 Parâmetros de fragmentação e seleção de transições 80

2.4.1.3 Condições cromatográficas de separação 81

2.4.1.4 Otimização dos parâmetros do espectrômetro de massas 81 2.4.2 Preparo das amostras do (Epicarpo, Mesocarpo e Endocarpo) 82 2.4.3 Teste de eficiência de extração dos compostos triptoquialaninas A e C

utilizando o método QuEChERS original

83

2.4.4 Avaliação do efeito matriz 84

2.4.5 Otimização do método de extração QuEChERS através de planejamento fatorial 23

84

2.5 VALIDAÇÃO DO MÉTODO ANALÍTICO 85

2.5.1 Seletividade 86

2.5.2 Linearidade 86

2.5.3 Padronização interna 86

2.5.4 Limite de detecção e quantificação 88

2.5.5 Exatidão 88

2.5.6 Precisão 88

2.6 RESULTADOS E DISCUSSÃO 89

2.6.1 Obtenção de íons produto e separação cromatográfica para os compostos triptoquialaninas A e C

89

2.6.2 Teste de eficiência de extração dos compostos triptoquialaninas A e C utilizando o método QuEChERS original

91

2.6.4 Otimização do método de extração QuEChERS através de planejamento fatorial 23

94

2.7 VALIDAÇÃO DO MÉTODO ANALÍTICO 97

CAPÍTULO 3 – ANÁLISE DE AMOSTRAS INFECTADAS 109

3 INTRODUÇÃO 110

3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 110

3.2 EQUIPAMENTOS E CONDIÇÕES DE ANÁLISE 111

3.3 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 112

3.3.1 Análise de laranjas infectadas 112

3.4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 115

3.4.1 Análise de laranjas infectadas 115

CAPÍTULO 4 – AVALIAÇÃO DE CITOTOXICIDADE 120

4 INTRODUÇÃO 121

4.1 OBJETIVO ESPECÍFICO 121

4.2 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 122

4.2.1 Avaliação de citotoxicidade 122

4.2.2 Ensaios antiproliferativos e citotóxicos e condições de cultivo para células 123 4.2.3 Ensaios antiproliferativos 123 4.2.4 Ensaio citotóxico 123 4.2.5 Método de avaliação 124 4.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO 125 5 CONCLUSÃO 126 6 REFERÊNCIAS 128 7 ANEXO 137

1 INTRODUÇÃO

1.1 CITRICULTURA NO BRASIL

A citricultura é um setor de grande importância no agronegócio brasileiro. Com a expansão e consolidação da indústria de suco de laranja concentrado na década de 70, a citricultura passou a ter um papel de destaque na economia brasileira. Isto fez com que o Brasil chegasse à primeira posição mundial entre os produtores de laranja e sucos cítricos em 1982 (MAIA, 1996). Atualmente, o Brasil detém mais de 34% da produção mundial de laranja, exporta 98% do que produz e detém 75% de participação no mercado mundial de suco de laranja (USDA, 2018).A Europa se destaca como o principal destino das exportações do suco de laranja brasileiro. Na safra 2017/18, 67% da quantidade exportada teve como porta de entrada os Países Baixos, re-exportadores para os demais países europeus. Os Estados Unidos mesmo sendo o segundo maior produtor mundial de laranja, ainda é o segundo mercado importador, destino de 21% da produção nacional. Além disso, a Ásia tem um grande potencial de aumento de consumo para a commoditie e atualmente o Japão importa 5% e a China, mesmo sendo responsável por 16% da produção de laranja no mundo, importa 3% do suco de laranja brasileiro (NEVES et al., 2017). Nos últimos anos, além do suco de laranja outros derivados como os óleos essenciais (OE) e líquidos aromáticos provenientes do processamento industrial da laranja, como o D-limoneno, os terpenos cítricos ganharam importância no mercado externo (BIZZO et al., 2009).

O Brasil tem lugar de destaque na produção de OE, ao lado da Índia, China e Indonésia, que são considerados os quatro grandes produtores mundiais (BIZZO, 2013). A posição do Brasil deve-se aos OE de cítricos, que são subprodutos da indústria de sucos. Segundo dados do ATLAS OF ECONOMY, (2016), o Brasil exportou para a comunidade europeia 51% do óleo essencial de citros, 27% para os EUA e 22% para outros países. Outro derivado com destaque é o farelo de polpa, com alto teor energético, um subproduto industrial de expressivo valor econômico, utilizado principalmente como complemento para a ração animal, em especial rebanhos bovinos de leite e corte (ARAMI et al., 2005 e CUTRALE, 2016). O PIB do setor citrícola é de aproximadamente US$ 6,5 bilhões de dólares (2017), e gera aproximadamente 230 mil empregos diretos e indiretos. Toda a cadeia arrecada

cerca de US$189 milhões de dólares em impostos para o estado brasileiro (NEVES et al., 2017).

1.2 CAMADAS DA LARANJA (EPICARPO MESOCARPO E ENDOCARPO)

A laranja pode ser dividida em três camadas, epicarpo, mesocarpo e endocarpo. O epicarpo é a camada que corresponde a porção exterior do fruto (casca do fruto), possui um revestimento de cera que funciona como uma barreira para proteção da fruta em seu ambiente natural (Figura 1). Esta camada do fruto possui também glândulas de óleo que servem como repositórios metabólicos para os terpenos e óleos essenciais aromáticos que caracterizam o aroma e sabor de cada tipo de fruta (TETRA PAK, 2017 e BRADDOCK, 1999). O mesocarpo (parte branca da pele), possui textura mais esponjosa do que o epicarpo, permitindo absorção de água e óleo. Algumas dessas glândulas de óleo podem se estender do epicarpo até o mesocarpo (BRADDOCK, 1999). O mesocarpo é também a porção da fruta mais rica na fonte de pectina, polímeros de carboidratos e glicosídeos de flavonona. O endocarpo (sumo) é constituído de uma membrana carpelar que por sua vez, é constituída por vesículas de suco e essas, possuem algumas organelas celulares, enzimas e óleos essenciais. O componente final da fruta é a semente com as propriedades comuns de sementes oleaginosas como lipídios, proteínas e carboidratos (TETRA PAK, 2017).

Epicarpo Mesocarpo Endocarpo

Figura 1 - Camadas da laranja: epicarpo (casca do fruto), mesocarpo (pele branca)

e endocarpo (sumo do fruto). Fonte: O próprio autor.

1.3 COMPOSIÇÃO QUÍMICA DA LARANJA

A composição química geral presente nas camadas da fruta (Figuras 1 e 2), são especificadas na ordem da perspectiva de processamento das frutas cítricas como um todo sendo constituídas de 85% de água e os outros compostos que representam 15% do total da fruta são: açucares solúveis (10%), fibras (2%), ácidos orgânicos (1%), aminoácidos e proteínas (1%), minerais (0,7%) óleos e lipídios (0,3%) (BRADDOCK, 1999). Os açucares solúveis são os constituintes primários da pele e polpa. Nessas frações, glucose e frutose são aproximadamente iguais a quantidade de sacarose contida no fruto.

Em sucos de fruta os açucares solúveis glucose, frutose e sacarose predominam. Açucares totais em suco de laranja são aproximadamente 3% de glucose, 3% de frutose e 4% de sucrose. O suco de laranja contém aminoácidos livres, e sua composição é utilizada para detectar a adulteração e ou pureza do suco (TETRA PAK, 2017). Algumas fibras de carboidratos insolúveis também estão presentes como: pectina, hemicelulose, celulose e um pouco de lignina. Os ácidos orgânicos presentes são: cítrico, málico e oxálico os quais, são os ácidos dominantes na fração do epicarpo (casca). A pele da laranja é também a fonte de maior porção de óleos essenciais na fruta. O constituinte primário desses óleos é o terpeno D-limoneno (TETRA PAK, 2017 e BIZZO, 2013).

Figura 2 - Composição química percentual dos constituintes da laranja: (1) Água; (2)

Açucares solúveis; (3) Fibras; (4) Ácidos orgânicos; (5) Aminoácidos e proteínas; (6) Minerais; (7) Óleos e lipídeos.

Fonte: Adaptado de BRADDOCK, 1999 e TETRA PAK, 2017.

% Co

mpos

iç

A polpa e as camadas do epicarpo e mesocarpo são também a principal fonte de flavonoides como a hesperidina. Após processamento industrial da laranja para obtenção do suco, são obtidos subprodutos (Figuras 3 e 4) os quais, atualmente apresentam altos valores aos mercados internos e externos de vários seguimentos como óleos essenciais: obtidos principalmente através da camada do epicarpo da laranja, muito utilizados na indústria de alimentos, bebidas alcóolicas, cosméticos e perfumes; Pellets: após a extração do suco e dos óleos essenciais, o bagaço da laranja é moído, prensado e “pelletizado”. Usa-se o “pellet” como componente na fabricação de ração animal, destinada principalmente ao mercado externo; O D-limoneno é obtido no processo de produção do “pellet” onde extrai-se esse solvente orgânico que será empregado na fabricação de tintas e vernizes; Essências aromáticas: Durante o processo de concentração do suco, são obtidas essências aromáticas, consumidas por indústrias de alimentos, bebidas, cosméticos e perfumes; Polpa cítrica congelada: Aproveitada na indústria alimentícia; Álcool: Á partir do melaço extraído do bagaço da laranja, obtém-se o álcool combustível hidratado e industrial anidro, (TETRA PAK, 2017).

Figura 3 - Aproveitamento industrial da laranja a partir de 1000 kg de laranja.

Figura 4 - Percentual de aproveitamento industrial por laranja em sua totalidade.

Fonte: Adaptado de BRADDOCK, 1999 e TETRA PAK, 2017.

1.4 Penicillium digitatum

A citricultura não diferente de outras commodities, é afetada por doenças no pós-colheita que reduzem a quantidade e a qualidade de frutos comerciáveis (CASSIANO et al., 2003). Os fungos são responsáveis por grandes perdas no pós-colheita, em especial o fungo Penicillium digitatum que é responsável por severos danos à citricultura brasileira, sendo responsável por até 90% das perdas totais, e causando grandes prejuízos ao setor (ARIZA et al., 2002). Atualmente no Brasil, para evitar a degradação de frutas cítricas por microrganismos é realizada aplicação de fungicidas e agroquímicos. Importadores de frutas, principalmente os europeus, que consomem cerca de 64% das frutas exportadas pelo país, já sinalizam que em breve não aceitarão frutas contendo nenhum pesticida (TERAO, 2015). Até o hipoclorito de sódio, usado para se controlar microrganismos presentes na casca das frutas, está no foco do mercado europeu e pode entrar para a lista de componentes banidos pelo continente (TERAO, 2015).

Um mercado cada vez mais exigente, faz com que citricultores brasileiros procurem novas formas de conter os microrganismos, tornando mais importante o entendimento da interação entre estes e as frutas cítricas. O fungo fitopatógeno Penicillium digitatum apresenta conídios de cor verde-oliva e a sua espécie cresce pouco em meios com baixa disponibilidade de água e em temperatura alta. É também a única espécie no subgênero Penicillium que cresce mal em meio de

cultura ágar Czapek (FRISVAD et al., 2004). A espécie é comumente encontrada em frutas cítricas, principalmente no pós-colheita, conforme apresentado na Figura 5.

Figura 5 - Na figura 5 é possível destacar a visão ampliada dos conídeos e

conidiófaros de cor verde-oliva produzidos por P.digitatum durante infecção em hospedeiro citros.

Fonte: O próprio autor.

O Penicillium digitatum é considerado a principal doença pós-colheita do citros, principalmente em regiões de climas quentes. No Brasil há registros da doença em todas as regiões produtoras (CABI, 2017). Na Figura 6, é possível observar a ocorrência do P. digitatum em praticamente todos os países produtores de laranja no mundo (CABI, 2017).

Figura 6 – Mapa mundial referente aos países onde foram registrados a

ocorrência de Penicillium digitatum ao longo dos anos. Fonte: Adaptado de CABI, 2017.

Conídeos

A infecção ocasionada pelo patógeno Penicillium digitatum (Figura 7), ocorre por meio de ferimentos onde os nutrientes que estão disponíveis estimulam a germinação dos esporos depositados na superfície do fruto (FISCHER et al., 2013).

Figura 7 – Infecção provocada pelo P.digitatum em hospedeiro citros estimulada

através da ocorrência de pequenos ferimentos no fruto. Fonte: O próprio autor.

Recente levantamento bibliográfico indicou o pouco conhecimento relacionado ao seu metabolismo secundário e suas respectivas toxicidades (TURNER et al., 2015a). As micotoxinas produzidas pelo P.digitatum fazem parte do grupo das micotoxinas tremorgênicas, que com base nas suas características estruturais, podem ser divididas em duas categorias: diterpenóides indólicos (por exemplo, penitrems e paspalitrems), e as dicetopiperazinas indólicas preniladas (por exemplo, fumitremorginas e verruculogeninas) (SANITARIANS, 1981). Nesta última classe, estão inseridas as triptoquialaninas, alcalóides indólicos produzidos pelo fungo P. digitatum. O mecanismo de ação destes alcaloides tremorgênicos não é bem compreendido, embora relatos indiquem que estes compostos parecem interferir com a liberação de neurotransmissores em animais vertebrados induzindo-os a tremores intermitentes ou persistentes (SANITARIANS, 1981).

Ariza e colaboradores (2002), demonstraram que durante a infecção no hospedeiro citros, o fitopatógeno P. digitatum sintetiza os alcaloides do tipo triptoquialanina A (TA), C27H26N4O7

1-{3-[(4'R,9S,9aS)-1-hydroxi-2,2-dimetil-3,5'- dioxo-1,2,3,9a-tetrahidrospiro[imidazo[1,2-a]indol-9,2'-oxolano]-4'-yl]-4-oxo-3,4-dihidroquinazolin-2-il}acetato de etila e triptoquialanina C (TC), C27H26N4O6

1-{3-[(4'R,9S,9aR)-2,2-dimetil-3,5'-dioxo1,2,3,9a tetrahidrospiro[imidazo[1,2-a]indol-9,2'-oxolano]-4'-il]-4-oxo-3,4-dihidroquinazolin-2-il}acetato de etila, in vivo conforme Figura 8 e Tabelas 1 e 2.

TA

TC

Figura 8 - Estruturas químicas dos metabólitos secundários triptoquialanina A (TA)

C27H26N4O7 e triptoquialanina C (TC) C27H26N4O6 produzidos pelo fungo Penicillium

digitatum durante a infecção em seu hospedeiro citros. Fonte: Adaptado de ARIZA 2002

Tabela 1 - Parâmetros físico-químicos da molécula triptoquialanina A (TA).

Classe da micotoxina Tremorgênica

Fórmula molecular C27H26N4O7

Massa molar 518,19 g.mol-1

(Log S) Solubilidade em água (25 °C) Baixa < 0,01 mg/mL

Polaridade Intermediária

Log P (Coeficiente de partição) 1,83 (Hidrofóbico)

Fonte: Adaptado de Pubchem, 2018.

Tabela 2 - Parâmetros físico-químicos da molécula triptoquialanina C (TC).

Classe da micotoxina Tremorgênica

Fórmula molecular C27H26N4O6

Massa molar 502,19 g.mol-1

(Log S) Solubilidade em água (25 °C) Baixa < 0,01 mg/mL

Polaridade Intermediária

Log P (Coeficiente de partição) 2,22 (Hidrofóbico)

Fonte: Software de predição Marvin Sketch 4.0, 2018.

1.5 MICOTOXINAS

A contaminação de alimentos por micotoxinas está ligada, principalmente, ao manejo incorreto das plantações e as condições de umidade e temperatura de armazenagem do alimento (ANVISA, 2016). As micotoxinas produzidas por fungos em geral são notoriamente tóxicas, são estáveis termicamente e demonstram altos níveis de bioacumulação (ARIZA et al., 2002). Trabalhos a respeito de possíveis efeitos deletérios a humanos são escassos, e segundo a ANVISA a ingestão de micotoxinas de forma exagerada pode causar grandes danos à saúde humana, os quais podem incluir cirrose hepática, necrose aguda e até surgimento de câncer (ANVISA, 2016). Apesar do risco que as micotoxinas representam para a saúde humana, é impossível impor um banimento total para estes contaminantes uma vez que esses ocorrem naturalmente (FAO, 2004).

Diversas agências no mundo, como CODEX ALIMENTARIUS, FDA (Food and Drug Administration), estabelecem valores regulatórios para micotoxinas.

Essas agências reguladoras estabelecem limites máximos toleráveis (µg/kg), podendo variar de acordo com a commoditie e/ou micotoxina, conforme legislação vigente de cada país ou bloco comercial. No Brasil, o órgão responsável por adotar esses limites é a ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária), a qual estabelece através da resolução RDC 138/2017 os limites máximos toleráveis (LMT) de exposição as micotoxinas (ANVISA, 2017). Os alimentos comercializados no Brasil deverão respeitar um limite máximo para a presença de micotoxinas encontradas principalmente em grãos. Dentro dos limites estabelecidos pela regulamentação da ANVISA, o consumo dessas substâncias é considerado seguro.

Nos últimos anos, tem sido estabelecido no mundo inteiro limites máximos de exposição para os membros mais prevalentes e tóxicos do grupo em algumas commodities, que são mais propensas a proliferações de fungos conforme Tabela 3 (ANFOSSI et al., 2016). No entanto, nenhuma regulamentação vigente determina os níveis máximos de exposição de micotoxinas para a commoditie de laranja e em seus derivados. O que de certa forma poderia representar riscos a população mundial. Principalmente, se levarmos em conta o alto consumo de suco de laranja no mundo, que nos últimos anos foi de 20,4 bilhões de litros (NEVES et al., 2017).

Tabela 3 - Visão geral da legislação para micotoxinas no mundo.

Micotoxinas Commodities Países

Limites máximos toleráveis Limitesa _(µg/kg)

Aflatoxinas Sementes oleoginosas, frutas secas, Cereais, temperos

EU 4–15a _(2–12a _{for AFB1)}

Austrália, Canadá, GCC, (15 for AFB1) Nigéria, Nova Zelândia,

África do Sul

EUA, MERCOSUL 20

Índia 30

Aflatoxina M1 Leite e fórmula infantil UE, Turquia, África do Sul 0.25–0.05a

China, GCC, 0.5

Índia, Quênia, México, Uruguai, EUA

MERCOSUL 0.5–5a

Desoxinivalenol Cereais, produtos de panificação EU 500–1750a

Brasil 750–3000a

Rússia 700–1000

Canadá, China, Índia, 1000 Japão, EUAb

Fumonisinas Milho UE, Turquia, Noruega, 800–4000a

Suíça

EUAb _2000–4000a

Brasil 2000–5000a

a _{Depende da commodite (menor ou maior - Limites Máximos Toleráveis (LMT)).}

b

Limite Recomendado

Ocratoxinas Cereais, frutas secas, café, UE, Egito 2–10a

cacau, vinho, cerveja, suco de uva, China, GCC, Quênia,

5

Ocratoxinas

temperos, alcaçuz, produtos

derivados de sangue Nigéria, Rússia 5

Índia 20

Brasil 2–30a

Uruguai 50

Patulina

Suco de frutas, produtos derivados

da Maçã Brasil, China, UE, GCC, 50

Índia, Japão, Quênia,

Nigéria, Rússia, África do Sul, EUA Fusario toxinasT-2 e

HT-2 Cereais UE Não permitido

Rússia 50–100a

Zearalenona

Cereais, produtos de panificação,

Óleo de Milho UE 75–400a

Brasil 200–1000a

China, Rússia, Chile 200.000

Tabela 3 - Visão geral da legislação para micotoxinas no mundo.

Conclusão Fonte: Adaptado de ANFOSSI et al., 2016.

a _{Depende da commodite (menor ou maior Limites Máximos toleráveis (LMT)).}

Os metabólitos secundários produzidos por algumas espécies fúngicas, representam, nos últimos anos, uma das maiores áreas de interesse científico, tanto do ponto de vista social, pelos seus efeitos tóxicos, quanto econômico, por dificultar a exportação e diminuir a produtividade de insumos agrícolas (PRADO et al., 1999).

De forma análoga, devido as suas propriedades biológicas esses metabólitos secundários também demonstram potencial para serem utilizados no tratamento de doenças, agricultura entre outros. Recentemente, um grande número de alcaloides foram descobertos a partir de fungos endofíticos em plantas, que exibiram excelentes propriedades biológicas (TURNER et al., 2015). É possível citar por exemplo, micotoxinas tremorgênicas produzidas por fungos durante infecção em seu hospedeiro, as quais agem como uma espécie de defesa química fúngica e os insetos são um grupo de organismos que podem ser o alvo dessas defesas, o que sugere ação inseticida dos compostos (DOWN ET al., 1988; GAO et al., 2011). Em outro exemplo, a micotoxina fumitremorgina C age com um potente e específico inibidor da proteína BCRP (do inglês “Breast Cancer Resistentance Protein”) causadora de câncer de mama (SARGENT et al., 2001).

Atualmente as indústrias farmacêuticas e químicas em geral, tem aumentado seu interesse a respeito desses compostos, visto que metabólitos secundários produzidos por esses fungos endofíticos têm demonstrado potencial promissor em questões de saúde humana (STROBEL G, 2003; KAUL et al., 2012).

1.6 TÉCNICAS ANALÍTICAS PARA DETERMINAÇÃO DE MICOTOXINAS EM ALIMENTOS

Nos últimos anos, a análise de micotoxinas vem demonstrando ser bem desafiadora devido ao grande número de compostos a serem detectados e às amplas propriedades físico-químicas que os mesmos possuem (UCT, 2014). Além disso, as matrizes típicas de produtos alimentícios são de natureza complexa (UCT, 2014). Métodos de preparação de amostras para análise de micotoxinas incluem extração sólido-líquido, extração líquido-líquido, dispersão de fase sólida de matriz, QuEChERS, cromatografia de imunoafinidade e extração de fase sólida (SPE) (TURNER et al., 2015).

Devido à dificuldade de realizar a remoção de coextrativos nas amostras de vegetais, os extratos obtidos ainda podem conter grandes quantidades de componentes da matriz que podem afetar negativamente o sistema de detecção dependendo do método de extração adotado (LIU et al., 2014). Para superar algumas das limitações dos métodos existentes, há uma necessidade de desenvolver métodos de extração e limpeza para a determinação simultânea de várias micotoxinas com altas recuperações e minimizando os efeitos da matriz de amostras (HACKBART et al., 2012).

1.6.1 Técnica de preparo de amostras QuEChERS versão original

Anastassíades e colaboradores em 2003, introduziram um método de preparo de amostra descrito como rápido, fácil, de baixo custo, efetivo, robusto e seguro, denominado QuEChERS, o qual inicialmente foi destinado à análise de resíduos de pesticidas em frutas e vegetais (QUEIROZ et al., 2012). Devido a sua versatilidade, o método foi adaptado para diferentes classes de micotoxinas conforme (HACKBART et al., 2012 e LIU et al., 2014). Mostrando-se promissor para extração em diversas matrizes. O procedimento envolve a extração inicial com 10 mL de acetonitrila para 10 g de amostra, seguido de partição líquido-líquido formada por adição de 4 g de MgSO4 anidro e 1 g de NaCl. A remoção de água residual e a

limpeza são realizadas simultaneamente usando um procedimento rápido chamado extração em fase sólida dispersiva (SPE dispersiva), para tal retira-se uma alíquota de 1 mL da fase sobrenadante (acetonitrila), adiciona-se 150 mg de MgSO4 e 25 mg

do adsorvente amina primária e secundária (PSA). O SPE dispersivo com PSA remove efetivamente muitos componentes da matriz polar, como ácidos orgânicos, certos pigmentos polares e açúcares, até certo ponto dos extratos alimentares (ANASTASSIADES et al., 2003).

1.6.2 Técnicas cromatográficas para determinação de micotoxinas em alimentos

As técnicas cromatográficas têm sido muito importantes para análises de micotoxinas nos últimos 50 anos (CIRLINE et al., 2012). Com o avanço obtido através do advento de detectores sensíveis (fluorescência, espectrometria de massa), permitindo com isso uma rápida expansão das análises, fazendo com que pelo menos 50 % de todos os trabalhos publicados dependessem de algum método cromatográfico (CIRLINE et al., 2012). Comumente a cromatografia líquida (HPLC ou UHPLC) é a mais empregada para essa classe de compostos, as análises utilizando TLC e GC são frequentemente consideradas menos práticas ou com sensibilidade insuficiente em comparação com os métodos de cromatografia líquida (PEREIRA et al., 2014).

A cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa em sequencial (LC‐MS/MS) é o sistema de detecção mais recomendado para análise de micotoxinas nos últimos anos (CIRLINE et al., 2012; PEREIRA et al., 2014). A utilização de LC‐MS/MS proporciona um aumento da seletividade e detectabilidade, o que pode possibilitar a determinação de baixas concentrações de várias classes de micotoxinas pertencentes a diferentes grupos químicos em matrizes complexas em uma única análise (PEREIRA et al., 2014). O desenvolvimento das técnicas de ionização a pressão atmosférica permitiu o acoplamento da cromatografia líquida de alta eficiência, operada em pressões elevadas, à espectrometria de massas. A interface à pressão atmosférica mais comumente empregada na determinação de micotoxinas é a (ESI) electrospray (VÉKEY, 2001; NIESSEN et al., 2006).

O aumento de seletividade ao se empregar a espectrometria de massas sequencial é garantido através de aquisição tanto no modo de monitoramento de reações selecionadas (SRM), utilizado para determinação multirresíduo. Neste caso, é possível quantificar compostos que coeluem através do monitoramento das transições íon precursor – íon produto de cada substância. Assim, a LC-MS/MS assegura a identificação com maior exatidão do que quando ela é realizada somente com base nas características de retenção dos compostos, como ocorrem nas outras técnicas de detecção cromatográficas (VÉKEY, 2001; NIESSEN et al., 2006).

1.7 VALIDAÇÃO DO MÉTODO ANALÍTICO

A validação é realizada após a conclusão do desenvolvimento do método ou antes que um método que não tenha sido usado anteriormente, seja introduzido para análise de rotina (SANCO, 2013). Pode ser compreendida também, como um processo de confirmação que o método desenvolvido, é adequado para o uso pretendido e assegura confiabilidade às medidas experimentais do método, sendo esta tão extensa, quanto necessário para atender aos requisitos em relação a sua aplicação (EURACHEM, 2014; INMETRO, 2016). Guias de procedimentos para desenvolvimento e validação de métodos analíticos voltados para as classes de micotoxinas ainda são muito escassos na literatura. É possível encontrar guias com métodos de análise para determinadas classes de micotoxinas em algumas commodities, como o guia Europeu (UE, 2014), porém o mesmo nem sempre pode ser adaptado para outras classes de micotoxinas, além das estabelecidas no protocolo.

Para determinação de resíduos de outras classes como: agrotóxicos e fármacos, existem alguns guias para validação de procedimentos analíticos, os quais permitem ser adaptados para diversas classes de compostos, esses guias não especificam uma única classe de analito, tendo suas abordagens mais relacionadas as figuras de mérito necessárias para a validação, sendo possível adaptá-los inclusive para micotoxinas. Dentre esses guias é possível destacar: ANVISA (Guia para o Controle de Qualidade para a Análise de Resíduos de Agrotóxicos em Alimentos para os Laboratórios Integrantes do PARA), SANCO (Method Validation and Quality Control Procedures for Pesticide Residues Analysis in Food and Feed, e principalmente os guias desenvolvidos pelo INMETRO (Orientações sobre Validação de Métodos Analíticos - Instituto Nacional de Metrologia) e EURACHEM (The Fitness for Purpose of Analytical Methods - A Laboratory Guide to Method Validation and Related Topics).

1.7.1 Seletividade

Seletividade é o grau em que o método pode quantificar o analito na presença de outros compostos, matrizes ou de outro material potencialmente interferente (INMETRO, 2016; EURACHEM, 2014). Deve também produzir respostas para vários analitos, mas que possa distinguir a resposta de um composto da de outros, é chamado seletivo (FDA, 2018).

Experimentos para avaliação da seletividade descritos na literatura sobre validação de métodos analíticos envolvem ensaios com padrões ou materiais de referência, amostras com e sem o analito, além da avaliação da capacidade de identificação do analito de interesse na presença de interferentes (INMETRO, 2016).

1.7.2 Linearidade

Linearidade de um procedimento analítico é a sua habilidade (dentro de uma faixa de trabalho determinada) em obter resultados os quais são diretamente proporcionais à concentração do analito na amostra (EMEA, 2006).

É obtida pela resposta do sinal do detector em função da concentração do analito, sendo que, a faixa linear é definida como o intervalo no qual a sensibilidade pode ser considerada constante ou a resposta do detector é diretamente proporcional à concentração (INMETRO, 2016; NATA, 2018).

O método de superposição de matriz (“matrix-matched”) consiste na adição do padrão da substância em diversas concentrações em uma matriz similar à da amostra, isenta da substância, e construção da curva analítica relacionando as áreas obtidas com as concentrações dos padrões (SANCO, 2013). O método de superposição de matriz pode ser utilizado para calibração, tanto com a padronização interna, como com a padronização externa. Este método é usado para compensar o efeito da matriz ou de possíveis interferentes e é de suma importância em determinações quando a matriz pode interferir na pré-concentração, extração, separação ou detecção da substância de interesse (RIBANI et al., 2004).

1.7.3 Padronização interna

O método consiste em adicionar uma quantidade conhecida de uma substância (padrão interno) na amostra a ser analisada e relacionar as áreas dos padrões de interesse com as áreas do padrão interno adicionado. Idealmente, a substância usada como padrão interno deve ter estrutura similar à substância a ser quantificada, não fazer parte da amostra, ter concentração e tempo de retenção próximos a essa substância e ficar separada das demais substâncias presentes na amostra (SANCO, 2013; BS EN 15662, 2008). O método utilizando padrão interno é também menos sensível a erros de injeção e variações instrumentais (EURACHEM, 2014).

Foi utilizado como padrão interno a ajmalicina fórmula molecular C21H24N2O3, Metil(1S,15R,20S)‐17‐oxa‐3,13diazapentaciclo henicosa 2(10),4,6,8,18‐

penteno‐19 carboxilato, massa molecular de 352,43 g.mol-1 _{e CAS Number 489-04-5}

conforme Figura 9. A ajmalicina é um metabólito produzido na biossíntese de alcalóides indólicos (produção de serpentina); encontrado naturalmente em várias plantas, como Rauwolfia spp., Catharanthus roseus e Mitragyna speciosa (CONNOR, 2011; JALEEL et al., 2007).

Figura 9 - Estruturas dos compostos apresentadas na seguinte ordem:

triptoquialanina A (TA) C27H26N4O7, triptoquialanina C (TC) C27H26N4O6 e ajmalicina

(AJM) C21H24N2O3 (padrão interno), os três compostos fazem parte do grupo dos

alcaloides indólicos.

Fonte: Adaptado de ARIZA 2002; CONNOR, 2011.

TA

_TC

_AJM

1.7.4 Limite de detecção e quantificação

O limite de detecção (LD) de um procedimento analítico individual é a menor quantidade de analito na amostra que pode ser detectada, mas não necessariamente quantificada sob as condições estabelecidas para o ensaio (INMETRO, 2016; NATA, 2018). O limite de detecção para um procedimento analítico pode variar em função do tipo da amostra. É fundamental assegurar-se de que todas as etapas de processamento do método analítico sejam incluídas na determinação desse limite de detecção, também importante para ensaios qualitativos (SANCO, 2013).

O limite de quantificação (LQ) de um procedimento analítico individual é a menor quantidade do analito na amostra que pode ser quantitativamente determinada com precisão e exatidão aceitáveis (MILLER; MILLER, 2005).

Após determinação do (LQ), o mesmo deve ser testado com amostras independentes no mesmo nível de concentração/propriedade do (LQ), para averiguar se a recuperação/tendência e a precisão conseguidas são satisfatórias. O limite de quantificação é de grande importância para os métodos quantitativos. Dentre as diversas abordagens para se calcular o limite de detecção e quantificação, neste estudo optou-se pela relação sinal/ruído.

A relação sinal/ruído é determinada pela comparação dos sinais medidos de amostras com baixas concentrações conhecidas do analito e dos ruídos dos brancos de amostras, definindo-se a concentração mínima em que o analito pode ser detectado com confiança (INMETRO, 2016).

Uma relação sinal/ruído de 3:1 é geralmente considerada aceitável para estimativa do limite de detecção (NATA, 2018). E para a estimativa do limite de quantificação, é utilizada a relação sinal/ruído de 10:1.

1.7.5 Exatidão

A exatidão de um método analítico é a proximidade dos resultados obtidos pelo método em estudo em relação ao valor considerado verdadeiro ou teórico (INMETRO, 2016).

O processo utilizado para avaliar a exatidão foi baseado em ensaios de recuperação, no qual uma quantidade conhecida de analito é adicionada a amostra, e após extração é possível ser quantificada e comparada com o valor de referência/teórico (RIBANI et al., 2004)

1.7.6 Precisão

A precisão é a avaliação da proximidade dos resultados obtidos em uma série de medidas de uma amostragem múltipla de uma mesma amostra (RIBANI et al., 2004).

A repetibilidade foi adotada como forma de avaliar a precisão do método. Esta, pode ser expressa quantitativamente em termos da característica da dispersão dos resultados e pode ser determinada por meio da análise de padrões, material de referência ou adição do analito ao branco da amostra, em várias concentrações na faixa de trabalho (INMETRO, 2016).

2 OBJETIVOS

Este trabalho tem como objetivo geral isolar, caracterizar e determinar os compostos triptoquialanina A (TA) e triptoquialanina C (TC) nas três camadas da laranja (epicarpo, mesocarpo e endocarpo), durante os diferentes estágios de infecção do Penicillium digitatum no hospedeiro citros, utilizando cromatografia líquida acoplada ao espectrômetro de massas sequencial (LC-MS/MS).

2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

➢ Determinação das condições ótimas de cultivo e fermentação do fungo P.digitatum para produção dos compostos triptoquialaninas A e C para serem

utilizados como padrões analíticos.

➢ Isolamento e purificação das triptoquialaninas A e C através de técnicas cromatográficas.

➢ Caracterização dos compostos triptoquialaninas A e C, através de técnicas de ressonância magnética nuclear (RMN) 1_{H e} 13_{C e cromatografia líquida acoplada}

a espectrometria de massas de alta resolução (LC-HR-MS).

➢ Desenvolver e validar um método analítico para a determinação das triptoquialaninas A e C em laranjas através do método de extração QuEChERS e

cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas sequencial (LC-MS/MS).

➢ Avaliar os níveis de produção das triptoquialaninas A e C durante os primeiros estágios de infecção do fungo P. digitatum nas diferentes camadas da laranja (epicarpo, mesocarpo e endocarpo).

➢ Avaliar níveis de infecção em laranjas sem sinais de infecção, após 48 horas de inóculo.

➢ Avaliar ocorrência de contaminação entre laranjas, através de contato direto por 48 horas entre laranjas infectadas em grau de infecção intermediário com laranjas sadias.

➢ Avaliar ocorrência dos compostos triptoquialaninas A e C no hemisfério inferior da laranja (epicarpo) após estágio de infecção inicial.

➢ Avaliar os riscos relacionados ao consumo da fruta contaminada por triptoquialaninas A e C através de ensaios de citotoxicidade.

A parte experimental deste projeto foi dividida em quatro etapas: (i) a primeira, referiu-se à produção, purificação e caracterização dos padrões analíticos triptoquialanina A (TA) e triptoquialanina C (TC) a partir da fermentação do fungo P.digitatum; (ii) a segunda, consistiu no desenvolvimento e validação do método

analítico para a determinação de TA e TC nas diferentes camadas da laranja (epicarpo, mesocarpo e endocarpo); (iii) a terceira, foram realizadas análises em laranjas em diferentes estágios de infecção; (iiii) a quarta, referiu-se à ensaios de citotoxicidade e antiproliferação celular.

Com a finalidade de apresentar os resultados obtidos no projeto de forma mais didática, cada uma das quatro etapas será apresentada com a parte experimental seguida dos resultados em quatro diferentes capítulos: (1) Obtenção e caracterização dos compostos TA e TC; (2) Desenvolvimento e validação de método analítico para a determinação de TA e TC em laranja; (3) análise de amostras de laranjas infectadas; (4) Ensaios de citotoxicidade.