Otimização do método de extração QuEChERS através de planejamento fatorial 2

Antes de iniciar o planejamento experimental foram realizadas modificações na quantidade de massa da amostra, passando a complementar o total de massa com água ultrapura. Para amostras que contém menos de 80% de água, como é o caso das camadas da laranja epicarpo e mesocarpo que contém 75% de água, é recomendado complementar a massa para 100% com água ultrapura gelada (BS EN 15662, 2008). Em base nessas informações, a amostra do epicarpo foi pesada com 7,5 g de amostra com adição de 2,5 g de H2O ultrapura gelada,

totalizando 10 g de amostra. A partir dessa alteração, a técnica de extração QuEChERS foi otimizada por meio de um planejamento fatorial 23_{, para que fosse}

avaliado a influência dos fatores: A acidez do solvente de extração (F1), foi avaliada com intuito de verificar se o aumento na porcentagem de ácido fórmico adicionado afetava a extração das triptoquialaninas A e C, para isso foram realizados testes em dois níveis (-1) 1% de ácido fórmico e (+1) 2% de ácido fórmico (UCT, 2014); A massa de carvão ativado (F2), foi avaliada em dois níveis (-1) 5 mg de carvão

ativado e (+1) 10 mg de carvão ativado, para verificar se o aumento em massa promovia diminuição dos co-extrativos da matriz nos extratos pós etapa de clean up (ANASTASSIADES et al., 2007); Utilização de gelo seco em banho etanólico (F3), em substituição ao MgSO4 na etapa de partição líquido/líquido, teve como intuito a

separação das fases aquosa e orgânica e a remoção de co-extrativos da matriz com baixa solubilidade em acetonitrila (LEE et al., 2011). O experimento foi realizado com três fatores e com dois níveis cada um, a execução do planejamento foi realizada em oito ensaios, com todas as possíveis combinações dos níveis inferior (-) e superior (+) conforme descrito na Tabela 8.

Foram realizados ensaios em duplicata, as injeções em triplicata e as porcentagens de recuperação média dos compostos TA e TC, obtidas nos experimentos, foram utilizadas para avaliar os efeitos de cada fator. As amostras foram fortificadas com mix dos compostos TA e TC na concentração de 500 µg/kg.

Tabela 8 - Planejamento fatorial 23 _{para otimização do método de extração}

QuEChERS.

VALORES CODIFICADOS VALORES REAIS

Ensaios X1 X2 X3 ACN + HCOOH Carvão Ativado Gelo Seco 1 -1 -1 -1 1% 5mg Sem 2 1 -1 -1 2% 5mg Sem 3 -1 1 -1 1% 10mg Sem 4 1 1 -1 2% 10mg Sem 5 -1 -1 1 1% 5mg Com 6 1 -1 1 2% 5mg Com 7 -1 1 1 1% 10mg Com 8 1 1 1 2% 10mg Com

Fonte: O próprio autor.

2.5 VALIDAÇÃO DO MÉTODO ANALÍTICO

O método para a determinação de micotoxinas em laranja, foi validado de acordo com as orientações analíticas dos guias SANCO (SANCO, 2013); INMETRO (INMETRO, 2016); e EURACHEM (EURACHEM, 2014). Sendo os seguintes parâmetros avaliados: seletividade, linearidade, limites de detecção e quantificação, exatidão e precisão.

Para validação do método analítico, foi adquirido um lote de 10 kg de laranja lima, sendo que 4 kg foram processados conforme procedimento estabelecido no item 2.4.2, para utilização de branco, para curvas analíticas e ensaios de recuperação. Os 6 kg restantes, foram utilizados para inoculação do fungo Penicillium digitatum in vivo, visando estudos para os diferentes estágios de infecção.

2.5.1 Seletividade

A seletividade foi avaliada por comparação dos cromatogramas obtidos através do LC-MS/MS, após injeção na matriz isenta dos analitos (branco), e do extrato da matriz fortificado com as triptoquialaninas A e C, com a concentração de 37 µg/kg. A eluição da fase móvel (A) água suplementada com 0,1% de ácido fórmico e (B) acetonitrila, foi realizada em modo gradiente na proporção inicial (A:B) 40:20 v/v 5 minutos, (80:40) por 5 minutos e (20:80) (A:B) por 5 minutos, totalizando 15 minutos de corrida.

2.5.2 Linearidade

Neste trabalho as curvas analíticas foram construídas através de superposição na matriz, a partir dos extratos das camadas da laranja: epicarpo, mesocarpo e endocarpo. As curvas foram preparadas a partir da solução estoque de 1000 mg/kg (item 2.4.1.1) para cada um dos compostos TA e TC em 7 níveis de fortificação (5; 10; 25; 75; 150; 250; 400 µg/kg), após obtenção de cada um dos extratos (Trufelli et al., 2010). Estes níveis de fortificação foram utilizados para avaliar a linearidade, através do coeficiente correlação (r), coeficiente de determinação (R2_{), análise da variância (ANOVA) e na estimativa da distribuição}

aleatória dos resíduos.

2.5.3 Padronização interna

Durante o desenvolvimento e validação do método analítico, não foi possível utilizar o padrão interno (ajmalicina) devido a sua indisponibilidade comercial. Após obtenção do mesmo, foram realizados ensaios com e sem a

utilização da ajmalicina, no intuito de avaliar as curvas analíticas e as concentrações que foram obtidas sem a utilização de padronização interna.

Inicialmente, foram otimizados os parâmetros do espectrômetro de massas, onde foram realizadas injeções de solução-padrão (ajmalicina) com concentração de 500 µg/kg preparada conforme item 2.4.1.1.

Em seguida, foram realizados três testes de separação cromatográfica para os compostos triptoquialanina A, C e ajmalicina com concentração de 150 µg/kg. Os testes de eluição foram realizados em modo gradiente, (A) água suplementada com 0,1% de ácido fórmico e (B) acetonitrila, (A:B) v/v, conforme Tabela 9.

Tabela 9 - Otimização de separação cromatográfica para os compostos TA, TC e

AJM utilizando LC-MS/MS.

Teste - 1 Teste -2 Teste-3

Tempo (min) B (%) Tempo (min) B (%) Tempo (min) B (%)

0 20 0 10 0 10

6 40 3 10 1 10

11 40 4 60 2 60

15 20 5 60 3 60

15 10 10 10

Fonte: O próprio autor.

As curvas analíticas para os compostos triptoquialaninas A e C foram construídas com um total de sete níveis de concentração, 1; 5; 10; 25; 75; 150; 300 µg/kg, em superposição na matriz apenas para o extrato obtido do epicarpo da laranja. A padronização interna foi empregada, utilizando a ajmalicina com concentração de 25 µg/kg, com concentração constante para todos os pontos da curva analítica e fortificação nas amostras. Devido à baixa disponibilidade de massa dos padrões obtidos TA e TC, não foi possível realizar ensaios de recuperação e as fortificações com padrão interno tiveram que ser realizadas apenas em amostras infectadas do epicarpo. Para execução das análises, as amostras foram divididas em dois grupos em seis replicatas cada. Em um grupo, foi realizada a fortificação com o padrão interno as amostras no início da extração conforme (BS EN 15662,

2008; ANASTASSIADES et al., 2003). E no outro grupo também em seis replicatas as análises foram realizadas sem adição de padrão interno.

As concentrações médias obtidas com e sem a utilização de padrão interno, foram analisadas através do teste t-student bicaudal para comparação de duas médias.

2.5.4 Limite de detecção e quantificação

Para determinar o LD e o LQ do método foram realizadas injeções de concentrações decrescentes dos compostos triptoquialaninas A e C até que a razão sinal/ruído atingisse valores estabelecidos na literatura, de 3 e 10 vezes, respectivamente (SANCO, 2013).

2.5.5 Exatidão

Para a avaliação da exatidão foram realizados ensaios de recuperação, nos quais as amostras da laranja (epicarpo, mesocarpo e endocarpo), foram fortificadas em três níveis de concentração, baixo, médio e alto (37; 75 e 350 µg/kg) e em cinco replicatas cada uma. Foi estimada a exatidão do método através de ensaios de recuperação obtidas pelas respectivas curvas analíticas e utilizando a Equação 5.

𝑹𝒆𝒄𝒖𝒑𝒆𝒓𝒂çã𝒐 (%) = (

Concentração adicionada ao extrato

) 𝑥 100

(Eq. 5)

2.5.6 Precisão

Para avaliar a precisão em termos de repetibilidade, foram determinados os coeficientes de variação, CV (%), referentes às recuperações dos analitos que foram preparados, injetados e analisados no mesmo dia, conforme ensaios do item 2.5.6.

2.6 RESULTADOS E DISCUSSÃO

2.6.1 Obtenção de íons produto e separação cromatográfica para os