De forma a se obter a estrutura da PerR de Desulfovibrio vulgaris vulgaris Hildenborough por modelação por homologia, começou-se por submeter a sequência em modelo FASTA na base de dados SwissModel3 de forma a se estabelecer o modelo mais adequado para a PerR. Assim, como
template utilizou-se a estrutura que apresenta maior score, ou seja maior grau de homologia na
sequência de aminoácidos, e menor E-value, expectation value. Este parâmetro reflecte o número de alinhamentos com scores equivalentes ou melhores, que são esperados que ocorram na pesquisa da base de dados ao acaso. Podemos dizer que quanto menor o parâmetro E-value, maior homologia. Então, obedecendo a estes parâmetros a proteína cuja estrutura é conhecida, que será utilizada como molde, e com maior grau de homologia é a PerR de Bacillus subtilis, figura VI.9.
Figura VI.8 – Representação por ordem crescente do score e decrescente do E-value de uma pesquisa nas bases de dados disponíveis no SwissModel, com a sequência de aminoácidos da PerR de Desulfovibrio vulgaris vulgaris
Hildenborough
Escolhido o molde com o qual se vai determinar a estrutura para a PerR de D. vulgaris, procedeu-se ao ajuste das sequências recorrendo ao programa Swiss-PdbViewer. Neste programa o primeiro passo foi então a sobreposição “primária” das duas estruturas. Estabeleceu-se como modelo a PerR de B. subtilis para que seja utilizada como referência para a cadeia polipeptídica, enquanto todos os outros moldes servirão apenas para aumentar a precisão da modelação das cadeias laterais. Seleccionado o molde e identificada a sequência para a qual se pretende obter uma estrutura submete-se o projecto ao Swiss Model.
AI A II A III
B I B II B III
Figura VI.9 - Estrutura da PerR (A) de D.vulgaris, obtida através do programa Swiss Model, usando como molde a estrutura da PerR de B .subtilis (com Zn2+ e Mn2+) (PDBid: 3f8n) (B). Nas figuras I, II e III encontram-se assinalados os resíduos de cisteína responsáveis pela ligação ao zinco, os resíduos responsáveis pela ligação ao ferro/manganês e a zona de ligação ao
ADN respectivamente (a rosa). A vermelho encontram-se as hélices alfa e a verde as folhas beta. Figuras manipuladas no programa USCF Chimera. CYS 85 CYS 124 CYS 121 CYS 82 ASP 90 HIS 77 HIS 79 HIS 23 ASP 71 CYS 139 CYS 136 CYS 96 CYS 99 ASP 104 HIS 91 HIS 93 HIS 37 ASP 85
Na figura VI.9 temos a comparação das estruturas da PerR de D. vulgaris (A) obtida por homologia a partir da estrutura conhecida para a mesma proteína mas de B. subtilis (B). Os resíduos responsáveis pela ligação do metal estrutural, zinco, encontram-se evidenciados nos painéis AI e BI e os responsáveis pela ligação ao ferro/manganês nos painéis AII e BII. Pela análise das estruturas na figura VI.9 pode-se verificar que a estrutura obtida para a proteína de D. vulgaris apresenta na sua estrutura secundária 4 hélices alfa e 4 folhas beta. Os resíduos responsáveis pela ligação ao zinco, sendo conservados, como já se sabia (ver figura VI.10), através da comparação das estruturas primárias, localizam-se sensivelmente na mesma zona da proteína. Tal facto verifica-se também no domínio regulatório representado em AII e BII, em que os ligandos do Fe2+/Mn2+, para além de serem conservados, mantêm um arranjo semelhante. Relativamente à região responsável pelo reconhecimento e ligação ao ADN (evidenciada a rosa em AIII e BIII) verifica-se que aparentemente também essa região se encontra sensivelmente no mesmo local quando comparada com a estrutura para B. subtilis. No entanto, apenas com esta figura nada se pode concluir quanto à sua conservação. Tendo esta que ser verificada através do alinhamento entre as sequências, figura VI.10.
No UniProt, base de dados de sequências de proteínas, procedeu-se à pesquisa das estruturas e respectivas sequências dadas com maior score durante o estudo de homologia.
- Bacillus subtilis (PDBid 2fe3; Uniprot Accession P71086)
- Mycobacterium tuberculosis (PDBid 2o03; Uniprot Accession o05839)
Após a selecção dos organismos cuja sequência era de interesse, procedeu-se ao alinhamento no UniProt, figura VI.10.
Figura VI.10 - Alinhamento múltiplo das sequências com maior homologia com a sequência da PerR de D.vulgaris (Accession number in uniprot: Q726L2) Assinalado a azul e a vermelho encontram-se os resíduos que coordenam a ligação de zinco (vermelho) e ferro/manganês (azul). A verde encontra-se a zona da proteína que responsável pela
ligação ao ADN
Na figura VI.10, após o alinhamento verifica-se existência de zonas cinzentas de diferente gradação, estas zonas correspondem a zonas conservadas em todas as sequências, sendo que a cor mais escura é relativa aos aminoácidos conservados e a cor mais clara corresponde a aminóacidos que são homólogos.
PerR de B. subtilis PerR de D. vulgaris PerR de M. tuberculosis PerR de B. subtilis PerR de D. vulgaris PerR de M. tuberculosis PerR de B. subtilis PerR de D. vulgaris PerR de M. tuberculosis
De acordo com a figura VI.10 pode-se verificar que a zona responsável pela ligação ao ADN é uma zona em que existe bastante homologia na PerR de D. vulgaris vulgaris Hildenborough. Relativamente aos resíduos responsáveis pela ligação ao metal estrutural (Zn2+) e ao metal regulatório (Fe2+/Mn2+), tal como já se tinha referido acima, estes são conservados nesta proteína quando comparada com a de B. subtilis.
Bibliografia
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