Solubilização da PerR recombinante de Desulfovibrio vulgaris vulgaris Hildenborough a partir de Corpos de Inclusão
IV.1. Teste com vários agentes de solubilização
Com o objectivo de solubilizar a proteína, PerR recombinante de D. vulgaris Hildenborough, vários testes foram realizados. Tal como referido anteriormente, vários agentes foram utilizados, desde desnaturantes a redutores e até endonucleases bem como o recurso a detergentes. Assim, na primeira abordagem feita recorreu-se a DNAse e Benzonase®(Merck) estas duas enzimas são endonucleases sendo que a primeira é específica de ADN e a segunda hidrolisa ADN e ARN. Neste primeiro teste utilizaram-se também agentes caotrópicos, como a ureia e o hidrocloreto de guanidina, e β- mercaptoetanol, como agente redutor.
De forma a testar se a proteína sobre-expressa seria um agregado com ácidos nucleicos, realizou- se um gel de agarose contendo uma alíquota do sedimento contendo os corpos de inclusão, figura IV.1.
Figura IV.1 – Análise dos corpos de inclusão por electroforese em gel de agarose (0.8 %), tampão TAE 1 X, 100 V durante 50 minutos.
Na figura IV.1, podemos verificar a presença de ADN no poço de aplicação da amostra. Isto é indicativo de agregados proteína-ADN, os quais são demasiado grandes para migrar no gel. Assim, o uso de endonucleases como tentativa de solubilização parece de facto uma boa abordagem.
Sedimento com os corpos de inclusão
DNAse 90 minutos de incubação a 37 ºC 5 horas de incubação a 37 ºC 16 horas de incubação a 37 ºC Benzonase® 90 minutos de incubação a 37 ºC 5 horas de incubação a 37 ºC 16 horas de incubação a 37 ºC A
Figura IV.2 – Planeamento dos testes de solubilização com diferentes agentes. A – Solubilização recorrendo a endonucleases; B – Solubilização recorrendo a agentes desnaturantes e redutores
Sedimento com os Corpos de Inclusão Tampão β- mercaptoentanol β- mercaptoentanol Fe2+ β- mercaptoentanol Zn2+ β- mercaptoentanole Hidrocloreto de Guanidina Hidrocloreto de Guanidina β- mercaptoentanol e Ureia Ureia
Ciclo de Árgon e de Vácuo
Incubação durante cerca de 16 horas
Os sedimentos provenientes do homogeneizado celular, fracção designada por P1 anteriormente, contendo os corpos de inclusão foram usados para os testes de solubilização da PerR. Assim, os ensaios foram planeados como descrito na figura IV.2 e realizados tal como indicado no apêndice C.1.
No ensaio utilizando endonucleases (painel A da figura IV.2), a temperatura escolhida foi de 37 ºC. Esta escolha deve-se a ser a temperatura óptima de funcionamento das enzimas utilizadas. Retiraram-se alíquotas ao longo do tempo, de forma a avaliar qual o mais correcto para uma hidrólise eficaz dos ácidos nucleicos. Nos ensaios utilizando agentes químicos utilizaram-se também os metais que se sabem ter afinidade para o local quer estrutural (Zn2+), quer funcional (Fe2+) da PerR, concomitantemente com o uso do agente redutor. Isto porque se se estiverem a formar pontes de dissulfureto entre as cisteínas (que ligam o zinco) e essa for a causa da insolubilidade da proteína, com a adição do agente redutor e do metal é possível numa primeira fase reduzir as cisteínas e posteriormente possibilitar a entrada do metal no local e então permitir que a proteína adopte uma conformação correcta, resolvendo o problema da insolubilidade. Assim, como teste de solubilização química utilizaram-se agentes caotrópicos, um agente redutor e soluções contendo os metais, zinco e ferro de forma a verificar se ocorrem melhorias na solubilidade da proteína. Todas amostras foram centrifugadas e aplicadas num gel de SDS-PAGE como forma de avaliar o teor quer do sobrenadante quer do sedimento, figura IV.3.
Pela análise dos géis relativos ao teste de solubilização, figura IV.3, verifica-se que o uso de endonucleases, quer DNAse I quer Benzonase®, directamente no sedimento com os corpos de inclusão não se mostrou muito eficiente. Pois a razão entre o sobrenadante e o sedimento correspondente demonstra que a hidrólise dos ácidos nucleicos com ambas as endonucleases não permitiu uma eficaz solubilização da proteína excepto na incubação durante 16 horas com Benzonase®. No entanto, o tempo de incubação torna esta condição demasiado morosa. Relativamente às anteriores condições pouco eficientes podem ser devidas a uma forte ligação entre os ácidos nucleicos e a proteína tipo interacção ácidos nucleicos e histonas. Daí a hidrolise não ser efectiva, pois a enzima não consegue aceder ao ADN/ARN.
Figura IV.3 - Géis de SDS-PAGE 15% submetidos a 150V durante 70minutos. Géis de solubilização da proteína. Dentro de cada chaveta encontram-se as diferentes fracções, S – sobrenadante, P – sedimento. M- marcador de massa molecular LMW
NZYTech® A1 – amostra inicial.
Nos ensaios envolvendo agentes desnaturantes, os resultados foram mais promissores, uma vez que a relação entre o sobrenadante e o sedimento correspondente demonstra que grande parte da proteína existente nos corpos de inclusão se encontra na fracção solúvel, sobrenadante. A amostra designada por Tampão corresponde à alíquota contendo os corpos de inclusão ressuspendida em tampão (20 mM Tris-HCl pH 7, 100mM NaCl), esta amostra funciona então como controlo. Da amostra apenas com β-mercaptoetanol pode-se concluir que o uso apenas do agente redutor não foi eficaz dado que se pode verificar a existência de muita proteína ainda retida no sedimento. Nos poços posteriores, contendo β-mercaptoetanol e ferro/zinco, pode-se verificar se a redução das cisteínas e posterior incorporação do metal permitem re-construir o centro metálico estrutural, favorecendo a estruturação correcta e consequentemente tornar a proteína solúvel. Assim, em ambos os casos, tanto usando zinco como ferro, a solubilização não é eficaz pois a maior quantidade da proteína encontra-se no sedimento
96 66 48 40 32 26 18,5 DNAse KDa M A 1 S P S P S P
90 min 5 horas 16 horas 90 min 5 horas 16 horasBenzonase® A 1 M S P S P S P 96 66 48 40 32 26 18,5 KDa M A 1 S P S P S P S P S M P S P S P S P
e não no sobrenadante. Por outro lado o recurso a agentes desnaturantes, 8M de ureia e 6M de hidrocloreto de guanidina, demonstram que independentemente do uso de β-mercaptoetanol a proteína fica maioritariamente na fracção solúvel. Embora, tal como explicado anteriormente, a presença de um ambiente redutor seja vital para a manutenção das cisteínas em estado reduzido prevenindo assim ligações que potenciem a agregação. Assim, considerando que ambos os agentes desnaturantes apresentam bons resultados resolveu-se prosseguir com a ureia para estudos posteriores dado que é mais economicamente viável, tendo em conta a elevada concentração requerida para cada ensaio.
Embora se tenham obtido bons resultados recorrendo a agentes desnaturantes, resolveu-se testar a solubilização recorrendo a detergentes, com um protocolo optimizado para corpos de inclusão contendo uma proteína com função semelhante à PerR, a BosR (5). Esse protocolo utiliza dois tipos de detergente, o deoxicolato de sódio e o lauril sarcosinato de sódio(5), figura IV.4, tal como descrito no apêndice C.3.
Figura IV.4 – Esquema representativo(5) do protocolo de solubilização seguido para a rPerR de D. vulgaris. Sedimento contendo os corpos de inclusão
Ditiotreitol Deoxicolato de sódio
Centrifugação com recolha do sedimento Ditiotreitol (DTT)
Lauril sarcosinato de sódio
Centrifugação com recolha do sobrenadante
Diálise do sobrenadante
incubação
Figura IV.5 - Gel de SDS-PAGE 15% submetido a 150V durante 70minutos. Gel de solubilização da proteína segundo o protocolo presente no apêndice C.3. M- marcador de massa molecular LMW NZYTech®; A1 – amostra contendo corpos de
inclusão; SI – sobrenandante da primeira centrifugação e rejeitado; PI – sedimento da primeira centrifugação e posteriormente tratado com lauril sarcosinato de sódio; P II – sedimento da segunda centrifugação e rejeitado; SII–
sobrenadante da segunda centrifugação após diálise
Contrariamente ao esperado, com o protocolo optimizado para uma proteína semelhante à PerR não se conseguiu obter uma eficaz solubilização da proteína. A fracção de interesse corresponde ao poço S II da figura IV.5 (fracção solúvel após o tratamento com os detergentes). Observando o poço PII, correspondente ao sedimento relativo ao SII, verifica-se que de facto a proteína não foi solubilizada encontrando-se maioritariamente no sedimento e não no sobrenadante. De todos os testes realizados conclui-se que a melhor metodologia para obter a rPerR de D. vulgaris numa forma solúvel é recorrendo a ureia em conjunto com um agente redutor.