A renaturação é um processo que envolve a mudança de conformação de uma proteína de um estado desnaturado a um estado com uma conformação correcta. A solubilização dos corpos de inclusão só foi conseguida na presença de um agente desnaturante, no qual as proteínas perdem completamente a estrutura, figura IV.8. Com elevada concentração de agente desnaturante, as proteínas encontram-se num estado desnaturado, sem estrutura e flexíveis. Em tampão aquoso, as proteínas encontram-se estruturadas, rígidas e compactas. Idealmente, durante a transferência da proteína de um ambiente com elevada concentração de desnaturante para um ambiente apenas com tampão aquoso, deveria ocorrer a renaturação. Ou seja, a transferência da proteína de uma solução desnaturante para uma aquosa vai forçar a proteína a colapsar e formar uma estrutura compacta, figura IV.8, no entanto, este drástico processo normalmente não ocorre eficazmente. Uma vez agregadas ou mal estruturadas, na ausência de um agente desnaturante, as proteínas deixam de ter flexibilidade para desagregar e estruturar na conformação correcta.
Figura IV.8 – Esquema do processo inerente à solubilização e renaturação de proteínas. O grau de conformação encontra-se no eixo das ordenadas versus a concentração crescente de agente desnaturante, eixo das abcissas. Figura adaptada (6)
Estudos anteriores(6) demonstram que durante o processo de solubilização e renaturação forma- se um intermediário, figura IV.9, entre o estado da proteína desnaturada e o estado com a conformação correcta, na condição de concentração intermédia de agente desnaturante. Este intermediário é pouco estável e menos solúvel, tendo então maior tendência para se agregar ou atingir uma estrutura errada.
[Desnaturante] C o n fo rm aç ão Desnaturada Estruturada Rigida Compacta Flexível
Assim, o processo mais benéfico para uma eficiente renaturação é uma redução progressiva da concentração de desnaturante em detrimento da escolha de uma concentração intermédia.
Figura IV.9 – Esquema do processo de renaturação adaptado (6). Em que D, I e E indicam as condições de desnaturada, espécie intermédia e proteína com a conformação correcta, respectivamente
Vários processos de renaturação podem ser utilizados, desde diálises progressivas com vista à redução de desnaturante, à troca do agente desnaturante por tampão aquoso, recorrendo a uma filtração em gel, passando ainda pela diluição da proteína, partindo de uma com elevada concentração de desnaturante. Neste trabalho não se testaram todas as hipóteses possíveis. O processo testado corresponde ao protocolo mais usual e que nos pareceu ter melhores resultados reportados, ou seja, diálises progressivas para diminuir a concentração de desnaturante de 8 M para 6 M, 4 M, 2 M e finalmente 0 M de ureia. Na figura IV.1, apresenta-se um gel de agarose da amostra dos corpos de inclusão, onde é visível que esta contém ácidos nucleicos. Visto que, como foi verificado nos testes em pequena escala acima descritos, a acção da endonuclease por si só não é capaz de solubilizar a proteína, resolveu-se optar por um procedimento em que se combinou a acção de agentes desnaturantes e da
Benzonase®.
Tal como referido anteriormente, com o processo de desnaturação deixa de existir a agregação mas quando se reduz a concentração de desnaturante propicia-se a estruturação da proteína. Se em solução continuarem os ácidos nucleicos poderá ocorrer nova ligação da proteína ao ADN/ARN. Assim, com base nas características bioquímicas da enzima(7), Benzonase®, e com base na sua estabilidade na presença de ureia esta foi adicionada à solução com proteína solubilizada quando se procedeu à diálise para 4 M de ureia. A incubação foi feita a 37 ºC durante 1 hora, de acordo com a indicação do fabricante de temperatura óptima para a enzima, bem como a sua actividade na presença de ureia. Procedeu-se ao
Agregada Agregada / Mal estruturada
passo de renaturação tal como acima descrito, com a redução progressiva da concentração de agente desnaturante. Após a última diálise centrifugou-se a amostra de forma a separar a fracção solúvel da fracção que agregou novamente formando um sedimento. Os resultados foram seguidos através de SDS-PAGE e de electroforese em gel de agarose, figura IV.10.
Figura IV.10 – Análise do processo de renaturação através de diálises sucessivas com redução da concentração de agente desnaturante e adição de endonuclease.
A - Gel de SDS-PAGE 15% submetido a 150V durante 80minutos. M- marcador de massa molecular LMW NZYTech®. S – Sobrenadante relativo à centrifugação no fim das diálises; P – Sedimento relativo à centrifugação no fim das diálises, fracção insolúvel.
B - Electroforese em gel de agarose (0.8%), tampão TAE 1X, 100 V durante 50 minutos.) M – marcador de pesos moleculares Nzyladder III; S – Sobrenadante relativo à centrifugação no fim das diálises; P – Sedimento relativo à centrifugação no fim das diálises, fracção insolúvel.
Através dos géis da figura IV.10 pode-se verificar que após o processo de solubilização e de renaturação parte da proteína se encontra solúvel (fracção S da figura IV.10A), embora com o processo de diálise tenha ocorrido perda de grande parte proteína (fracção P da figura IV.10A). Tal poderá ser atribuído ao facto de que com a diminuição da concentração do agente desnaturante a proteína pode re-agregar e tornar-se novamente insolúvel. Com a figura V.10B pode-se verificar que a parte da proteína que se manteve solúvel encontra-se livre de ácidos nucleicos (fracção S da figura IV.10A) e que por outro lado a fracção que não está solúvel apresenta ácidos nucleicos na sua composição. Assim, pode-se inferir que a insolubilidade neste passo se poderá dever à presença de ácidos nucleicos que devido à diminuição da concentração de desnaturante se ligaram novamente à proteína formando novos agregados. Com a proteína já solubilizada e renaturada pode-se então proceder à sua purificação, bem como à sua caracterização bioquímica.
96 66 48 40 32 26 18,5 KDa M S P 10000 7500 6000 5000 4000 3000 2500 2000 1000 800 600 400 200 M S P A B
Bibliografia
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Expression and Purification 28, 1-8.
CAPITULO V
Purificação de PerR recombinante de Desulfovibrio vulgaris vulgaris
Hildenborough solubilizada