Olympus Fluoview FV-1200

As VBGs foram analisadas utilizando um microsc´opio confocal marca Olympus modelo Fluoview FV-1200 no Centro Multiusu´ario de Caracterizac¸˜ao de Materiais – CMCM na UTFPR campus Curitiba. E um microsc´opio biol´ogico confocal que permite analisar´ amostras orgˆanicas e inorgˆanicas por longos per´ıodos utilizando baixa fluorescˆencia. Os lasers dispon´ıveis s˜ao combinados empregando um combinador de fibra ´otica. Os feixes s˜ao

refletidos para a objetiva localizada abaixo da amostra, que converge a radiac¸˜ao num ponto focal. O sistema ´e montado com base no microsc´opio invertido IX83 com est´agio de translac¸˜ao motorizado e possui 5 objetivas com ampliac¸˜ao entre 10× e 60×, sendo que duas delas, as de 50× e 60×, possuem acoplamento a ´oleo.

Figura 25: Diagrama do caminho ´otico do microsc´opio confocal Olympus Fluoview FV-1200 dispon´ıvel no CMCM na UTFPR – Campus Curitiba.

Fonte: Manual do fabricante.

Um combinador de fibra ´otica permite a emiss˜ao laser nos comprimentos de onda do laser diodo que emite em 405, 440, 473, 559, e 635 nm, que provoca a foto estimulac¸˜ao. Um laser argˆonio multilinhas tamb´em est´a dispon´ıvel com os comprimentos de onda de 458, 488 e 515 nm, assim como um laser de He-Ne(G) em 543 nm. Os comprimentos de onda dispon´ıveis no programa para serem selecionados s˜ao em 405, 458, 488, 515, 543 e 635 nm. Um detector captura a fluorescˆencia e luz refletida da amostra para monitoramento. O feixe transmitido ´e capturado por outro detector, que gera a imagem de transmiss˜ao, a qual n˜ao ´e confocal. Os detalhes da disposic¸˜ao dos principais dispositivos no microsc´opio podem ser vistos na Figura 25.

A luz, que pode ser proveniente tanto dos lasers (oriundos dos pontos nomeados como Laser, VIS, UV e IR na Figura 25) quanto da lˆampada de Merc´urio, e ap´os passar por uma s´erie

de espelhos e lentes, incide sobre o primeiro espelho dicroico (DM – na Figura 25 indicada como DMp) de excitac¸˜ao na montagem, que permite passar somente determinadas combinac¸˜oes

de comprimentos de onda de absorc¸˜ao proveniente dos lasers. Este feixe atravessa uma ´ıris cuja abertura pode ser modificada conforme necessidade, e possui a func¸˜ao de eliminar os feixes de outras regi˜oes focais. O feixe chega ent˜ao na regi˜ao do primeiro canal, onde ´e poss´ıvel observar fluorescˆencias na regi˜ao do azul.

Para isso, h´a uma segunda regi˜ao de espelhos dicroicos (DM1), onde podem ser selecionados os DM’s em 560, 510 e 490 nm. No mesmo disco h´a tamb´em a opc¸˜ao de selecionar um espelho, de forma a refletir ≈ 100% de toda a luz para o canal 1. No lugar de DM1 tamb´em pode ser selecionada uma lˆamina de vidro, caso n˜ao queira usar o canal. Desta forma os DM’s em DM1 refletem os comprimentos de onda abaixo de 500 nm para dentro do canal 1 e permitem passar comprimentos acima desta regi˜ao para o canal 2 (CH2). Ap´os o DM1 se encontra a rede de detecc¸˜ao espectral (Rede 1), que ´e um filtro de barreira (BF) que permite passar faixas mais estreitas e difrata a energia (entre 505-525, 480-495 e 430-470 nm). Para visualizar a fluorescˆencia ´e necess´ario selecionar um fluor´oforo.

Os comprimentos de onda na regi˜ao do amarelo e verde podem ser visualizados utilizando o canal 2. A luz incide sobre a regi˜ao de DM2, que possui disposic¸˜ao semelhante `a DM1, e permite entrar no canal 2 os comprimentos de onda abaixo de 640 ou 560 nm. Tamb´em podem ser selecionados lˆamina de vidro ou espelho totalmente refletor. Os BF dispon´ıveis s˜ao entre 505-605, 560-620, 535-565 e 505-525 nm. A fluorescˆencia tamb´em necessita de um fluor´oforo para ser visualizada.

O canal 3 no equipamento dispon´ıvel n˜ao possui DM na sua entrada em DM3, somente um espelho que reflete os comprimentos de onda restantes para o BF, que transmite a banda de comprimentos de onda fluorescentes, entre 655-755 e 560-660 nm, bloqueando outros comprimentos de onda de excitac¸˜ao residual, permitindo a fluorescˆencia da regi˜ao do vermelho e infravermelho, utilizando um fluor´oforo (FLUOVIEW; MICROSCOPY, 2011).

Existem um equivalente de 74 fluor´oforos dispon´ıveis, com emiss˜ao entre 300 e 700 nm, que podem ser selecionados no programa. Os fluor´oforos s˜ao catalogados de acordo com sua banda de absorc¸˜ao e fluorescˆencia, com os perfis espectrais, comprimentos de onda de m´axima absorc¸˜ao e emiss˜ao, entre outros. As bandas de absorc¸˜ao devem ser consideradas para realizar imagens em amostras biol´ogicas, por´em, para o presente trabalho somente as bandas de emiss˜ao s˜ao consideradas, utilizando os fluor´oforos como filtros ´oticos que permitem passar o comprimento de onda desejado, bloqueando os demais. A lista com os comprimentos de onda de absorc¸˜ao e emiss˜ao se encontra na p´agina do fabricante, em Fluoview e Microscopy (2011).

O quarto canal dispon´ıvel no microsc´opio produz imagens de transmiss˜ao, que permite ver os detalhes da superf´ıcie da amostra, como riscos, defeitos do cristal, e regi˜oes onde houve variac¸˜ao do ´ındice de refrac¸˜ao. Sendo assim, os trˆes canais de fluorescˆencia mais o canal de transmiss˜ao podem ser sobrepostos para obter informac¸˜oes diversas da mesma regi˜ao da amostra. Todas as condic¸˜oes de posicionamento e iluminac¸˜ao podem ser mensuradas e salvas, permitindo reproduc¸˜ao das condic¸˜oes utilizadas.

Figura 26: Espectros de transmiss˜ao em excitac¸˜ao e emiss˜ao para os filtros no sistema do CLSM presente na UTFPR. Em (a) referente ao CC F+₃, e m (b) referente ao CC F2.

Fonte: Autoria Pr´opria

Nas imagens realizadas para este trabalho foram utilizados o laser de argˆonio multilinha nos comprimentos de onda de 458 nm e 488 nm, e o laser de He-Ne laranja em 543 nm, ambos com intensidade limitada em 5,0% (1,5 mW) pelo software do microsc´opio. Os filtros fluor´oforos utilizados para transmitir os comprimentos de onda nas regi˜oes do verde e vermelho, s˜ao respectivamente o AlexaFluor 488 (AF488) e o AlexaFluor 594 (AF594), que s˜ao apresentados em detalhes na Figura 26, apresentando os gr´aficos em transmiss˜ao para as bandas de excitac¸˜ao e emiss˜ao de cada fluor´oforo utilizado. O fluor´oforo AF488 ´e aplicado para visualizac¸˜ao dos CCs F2, possui 80% de transmiss˜ao entre 510 nm e 530 nm. O

fluor´oforo AF594 para o CC F₃+transmite 80% das intensidades entre 607 nm e 633 nm. Esses fluor´oforos s˜ao utilizados principalmente em an´alises biol´ogicas, por´em, podem ser empregados com sucesso para os objetivos deste trabalho.

Para reduzir o ru´ıdo nas imagens, foram utilizadas duas integrac¸˜oes no tempo com aplicac¸˜ao de um Filtro Kalman, o qual opera realizando uma leitura que retira a m´edia e subtrai a contagem de f´otons fora dessa m´edia. As imagens foram realizadas utilizando uma varredura na profundidade e no tempo. O passo entre cada leitura ao longo da profundidade das gravac¸˜oes

foi cerca de 24,7 µm, com um total de 82 passos, um total de 2,02 mm. Todas as imagens foram feitas com objetiva de 10 X com abertura num´erica (NA) de 0,40 e distˆancia focal de 3,1 mm e mesma profundidade no eixo Z.