As lâminas contendo cortes de olhos de camundongos infectados e não infectados foram submetidos à reação de TUNEL. Na retina dos animais não infectados não houve marcação (FIG 11).
FIGURA 11 – Retina de animais não infectados submetida à reação de TUNEL (contracoloração com verde de metila).
A marcação de células esparsas pela reação de TUNEL pode ser notada em todas as camadas da retina neurossensorial de camundongos infectados como pode ser observado nas figuras 12 A, B, C, D, E e F.
FIGURA 12 – Retina de animais infectados marcada por TUNEL:
Podemos observar focos de retinite (A, D e F), migração de células pigmentadas (B e F), células no corpo vítreo e interface vitreorretiniana, além de células marcadas (setas vermelhas) pela reação de TUNEL nas diversas camadas da retina, no vítreo e na interface vitreorretiniana (contracoloração com verde de metila).
No entanto, houve marcação de células em maior quantidade no corpo vítreo, na interface vitreorretiniana e região perivascular, coincidindo com o local onde são encontradas as células inflamatórias, sugerindo serem estas as células preferencialmente atingidas pela apoptose induzida pela infecção.
As células marcadas pelo TUNEL também mostraram as alterações morfológicas características da apoptose, tais como tamanho reduzido, densidade aumentada e algumas já se mostravam fragmentadas.
No presente trabalho estudamos a toxoplasmose ocular experimental considerando a infecção com cistos de T. gondii através da via de inoculação intraperitoneal em camundongos fêmeas adultas.
Como a intenção do trabalho foi o estudo na fase crônica da doença, utilizamos animais no 60º dia de infecção, pois segundo TEDESCO et al. (2004) os animais infectados por via i.p. mostram títulos semelhantes de anticorpos anti- toxoplasma IgM e IgG no 15º dia de infecção, havendo a queda dos títulos para IgM a partir do 30º ao 60º dia, com elevação dos títulos para IgG indicativo da cronificação da doença.
A via de inoculação utilizada no presente estudo mostrou-se eficiente, como já demonstrado anteriormente por TEDESCO et al.(2004). As vias intraperitoneal e oral (gavagem) são comumente empregadas por outros autores (DUTTON et al., 1986; GAZZINELLI et al., 1994; PEREIRA et al., 1999). A via intravítrea é menos utilizada devido às alterações provocadas pelo trauma de inoculação no olho e quando empregada geralmente é em animais de maior porte (YOSHIZUMI, 1976; GARWEG, 1998; HU et al., 1999).
Durante os nossos experimentos observamos infiltrado inflamatório mononuclear no vítreo, na interface vitreorretiniana, e nas camadas internas da retina especialmente nas regiões perivasculares (vasculite), necrose, reação glial, distorção da arquitetura da retina, migração de células pigmentares e cisto parasitário na camada plexiforme interna. De acordo com GONÇALVES & YAMAMOTO (1997) a retina é o sítio primário da infecção pelo Toxoplasma. Assim como neste trabalho, estudos anteriores no modelo experimental (NUSSEMBLATT & PALESTINE, 1989; TEDESCO et al., 2004) demonstram um infiltrado inflamatório predominantemente mononuclear e necrose na retina, com o aspecto semelhante ao da toxoplasmose ocular em humanos. A vasculite foi também encontrada por outros autores (DUTTON et al., 1986; McMENAMIN et al., 1986). HAYASHI et al. (1996) descreveram inflamação causada por infiltrado mononuclear podendo originar destruições na retina em vários graus. A baixa porcentagem de parasitas (cistos) observada nos olhos dos animais apesar da presença da retinite sugere que o T.
gondii pode dar início a um processo inflamatório autorreativo, que eventualmente
culmina nas lesões oculares, como proposto por GAZZINELLI et al. (1994). Os cistos localizados na retina, observados no nosso modelo crônico, não estavam acompanhados de alterações evidentes ao seu redor, semelhante ao observado por McMENAMIN et al. (1986).
Como descrito anteriormente por TEDESCO et al., (2004), a migração das células do EPR para dentro da retina e as alterações na camada dos segmentos externos dos fotorreceptores (FR) foram características marcantes nos focos de retinite no nosso estudo. De acordo com CRAFOORD et al. (2000) a migração das células da retina está associada com a destruição focal dos fotorreceptores, o que também pode ser observado em nosso estudo. Existe uma forte evidência do papel crucial da migração das células do EPR na toxoplasmose experimental. O EPR pode ser importante na eliminação do parasita através da fagocitose, considerando que as células do EPR atuam fisiologicamente como células fagocitárias. A habilidade das células do EPR em participar da regulação imune, tanto pela estimulação quanto pela inibição da proliferação dos linfócitos, tem sido demonstrada em vários modelos de auto-imunidade in vivo (GASPARI et al., 1988). As células do EPR foram preferencialmente encontradas suprimindo a proliferação dos linfócitos cultivados com antígenos endógenos (LIVERSIDGE et al., 1993).
Como já salientado e considerando que a patologia da infecção pelo T. gondii resulta da interação entre fatores do parasita e do hospedeiro e que as descrições das alterações histopatológicas são essencialmente subjetivas, os diversos trabalhos da literatura podem apresentar resultados não comparáveis, ainda que os modelos experimentais sejam rigorosamente iguais.
Com o desenvolvimento da morfometria a partir de programas de computador, dados objetivos puderam ser construídos. Mas, como a literatura ainda não dispõe de dados morfométricos da retina de camundongos infectados pelo T.gondii, nosso estudo baseou-se nos dados subjetivos da descrição histopatológica que sugeriam aumento de espessura da retina devido ao edema e infiltrado inflamatório e distorção da arquitetura normal da retina pela inflamação e necrose. A partir disso, estudamos a histopatologia da retinite por Toxoplasma em modelo murino com mensuração da espessura da retina e da distorção na arquitetura da retina (relação
perímetro/área) através da morfometria, com obtenção de resultados objetivos (numéricos).
Como citado anteriormente, os resultados da análise histopatológicas deste trabalho estão de acordo com o descrito por outros autores.
A espessura da retina dos camundongos infectados mostrou aumento estatísticamente significante se comparada com a dos camundongos não infectados (167,8±24,9 versus 121,1 ± 15,4 com p = 0,00002). Como era esperado devido ao infiltrado inflamatório e edema no foco de retinite, nos animais infectados observou- se aumento na espessura da retina no foco de retinite comparada com a espessura fora dos focos de retinite (183,3±15,99 versus 147,3±12,2 com p = 0,0001). A diferença na espessura da retina dos camundongos não infectados e a dos infectados foi significativa mesmo se consideradas apenas as medidas fora dos focos de retinite provavelmente em decorrência do edema difuso na retina dos camundongos infectados como também pode ser observado na histopatologia (vacúolos) em várias das camadas, alteração também descrita por TEDESCO et al. (2004). Foi considerado estatisticamente significativo o p< 0,05.
A mudança na arquitetura da retina de camundongos infectados e não infectados, avaliada neste trabalho através da relaçãoP)A, não apresentou distribuição normal e homocedasticidade mesmo após várias tentativas de transformação matemática e por isso foi avaliada através do teste não paramétrico de Mann-Whitney. Apesar da alta instabilidade, mostrou diferença estatística entre camundongos infectados e não infectados refletindo a mudança na arquitetura da retina em decorrência da infecção, que também foi descrita por TEDESCO et al. (2004).
Quando avaliada cada camada separadamente, a P/A mostrou homocedasticidade e distribuição normal. A variável apresentou baixa instabilidade e número amostral suficiente nas camadas nuclear externa (CNE), plexiforme externa (CPE) e plexiforme interna (CPI), mas somente na camada plexiforme externa observou-se diferença estatística entre infectados e não infectados. Nas camadas de fotorreceptores (CFR), nuclear interna (CNI) e na camada de células ganglionares e fibras nervosas (CGFN) a variável apresentou média instabilidade e apesar do
número amostral teoricamente insuficiente mostrou diferença estatística entre os dois grupos. Assim, a P/A foi capaz de mostrar matematicamente a alteração na arquitetura da retina e nas camadas de fotorreceptores, plexiforme externa, nuclear interna e na de células ganglionares e fibras nervosas.
Com a demonstração das diferenças estatisticamente significativas, acreditamos que as medidas de espessura da retina e da relação P/A tornam-se importantes ferramentas de comparação para futuros estudos envolvendo a retinite por Toxoplasmose.
Na pesquisa de apoptose, células marcadas pela reação de TUNEL foram encontradas no corpo vítreo, na interface vitreorretiniana e nas diversas camadas da retina neurossensorial, mas em maior quantidade região perivascular, coincidindo com o local onde foi encontrado maior número de células inflamatórias. Apesar de não contarmos com nenhum trabalho que tenha pesquisado a apoptose na fase crônica, o resultado não nos surpreende visto que LÜDER & GROSS (2005) demonstraram que na toxoplasmose sistêmica, populações específicas de células imunológicas não parasitadas são induzidas à apoptose pelo T. gondii. Além disso, SHEN et al. (2001) mostraram que os olhos de camundongos do tipo selvagem não infectados expressam constitucionalmente níveis mais altos de moléculas pró- apoptóticas que o cérebro e que a apoptose foi encontrada mais freqüentemente no olho que no cérebro durante a infecção aguda. HU et al. (1999) também encontrara aumento da apoptose no olho durante a infecção aguda pelo T. gondii. CALABRESE
et al. (2007) demonstraram que em camundongos no 300 dia após a infecção ocorre diminuição de 20% no nível sérico de Fas e seu ligante enquanto que no líquido intraocular o nível de Fas aumenta 82% e Fas L 56% sugerindo aumento da apoptose no olho durante a infecção. O aumento do Fas-L dentro do olho, encontrado por CALABRESE et al. (2007), reforça a suspeita de que as células inflamatórias sejam o principal alvo da apoptose induzida pela toxoplasmose, já que essas células expressam o receptor Fas na sua superfície. Novos estudos são necessários para determinar se a apoptose encontrada no olho na fase crônica da infecção é induzida pelo Toxoplasma gondii ou se é decorrente do fato de o olho ser um sítio de privilégio imune. Como tal, o olho expressa moléculas pró apoptóticas, o que leva a apoptose de células inflamatórias que alcançam o espaço intraocular.
1. A análise morfométrica mostrou diferença estatística entre a espessura da retina de camundongos infectados se comparada com a dos animais não infectados (167,8 ± 24,9 versus 121,1 ± 15,4), bem como entre a espessura nos focos de retinite comparada com a espessura fora dos focos de retinite (183,3±15,99 versus147,3±12,2) em animais infectados. A análise da relação perímetro/área da retina dos animais infectados mostrou diferença estatística se comparada com a dos animais não infectados refletindo a mudança na arquitetura decorrente da infecção. Difernça estatística também foi encontrada nas camadas de fotorreceptores, plexiforme externa, nuclear interna e de camada de células ganglionares e fibras nervosas. Não houve diferença significativa entre infectados e não infectados nas camadas dos núcleos dos fotorreceptores e plexiforme interna.
2. A apoptose não vista na retina dos animais do grupo controle e foi encontrada em células no corpo vítreo, na interface vitreorretiniana e em todas as camadas da retina neurossensorial, mas predominantemente na região perivascular, local coincidente com o infiltrado inflamatório. O resultado sugere que as células inflamatórias são possivelmente os alvos preferenciais da apoptose induzida pela infecção.
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