Preparação e avaliação de micropartículas de gelatina contendo própolis

Foram preparadas micropartículas com os extratos EFEI 97 e EFEI 2002. O extrato etanólico de própolis 30% (p/p) foi disperso em solução de gelatina, sob agitação magnética por 30 min a 25 °C. A quantidade de gelatina utilizada foi determinada em função do valor do resíduo seco (RS) do extrato. Utilizou-se também manitol na proporção de 20% (p/p), em relação à massa teórica total de micropartículas a ser obtida. A dispersão obtida, mantida sob agitação constante, foi nebulizada em um Mini Spray Dryer Büchi® modelo B191. As condições experimentais de secagem estão descritas na Tabela 2.

Proporção Gelatina/RS (p/p) 6/1

Taxa de alimentação (mL/min) 1

Aspiração (% - m3/h) 80 - 32

Pressão do ar (bar) 3

Manitol (%, p/p) 20

As micropartículas de gelatina contendo própolis foram coletadas na base do ciclone (coletor) e acondicionadas em frascos âmbar, hermeticamente fechados e mantidos em dessecador provido de sílica.

4.2.3.1 Análise morfológica

A análise morfológica das micropartículas de gelatina contendo própolis foi realizada por microscopia eletrônica de varredura, utilizando um microscópio JEOL® modelo JSM T330A. As amostras foram distribuídas sobre uma fita dupla-face aderida a um suporte de metal, revestidas, sob atmosfera de argônio, com ouro coloidal e analisadas.

4.2.3.2 Análise granulométrica

A determinação da distribuição de tamanho das micropartículas foi realizada por captação de imagens, através de microscópio óptico DMRXA (Leica®), utilizando o programa Leica® Qwin Image Analysis Systems para quantificação.

As micropartículas foram colocadas sobre uma lâmina de vidro e, para cada campo analisado, foi realizada a distribuição de tamanho das micropartículas, usando como parâmetro para medição o diâmetro segundo Feret (BARBER, 1993). Foram medidas, no mínimo, 1000 partículas e a distribuição de tamanho das mesmas foi determinada.

O teor de própolis nas micropartículas foi determinado pelo método espectrofotométrico e por CLAE.

O teor foi obtido por espectrofotometria através da determinação do teor de flavonóides totais presente nas micropartículas. Cerca de 3,0 g de micropartículas foram exatamente pesados e quantificados de acordo com o método descrito no item 4.2.2.5. O resultado foi calculado de acordo com a fórmula a seguir:

) 1 .( . . PD m FD A TF − = ε (8)

onde: TF = Teor de flavonóides totais em quercetina expresso em gramas por 100 g de micropartículas secas (%, p/p); A = Absorvância da solução teste; FD = Fator de diluição (125); ε = Absortividade específica da quercetina (500); m = massa de micropartículas testada (g); PD = Teor de umidade das micropartículas (valor absoluto).

Pelo método cromatográfico, o teor de encapsulação da própolis foi determinado pela quantificação de seus três principais marcadores (BRUSCHI et al., 2003a). Em balão volumétrico de 25,0 mL, adicionou-se uma amostra de 15 mg de micropartículas de gelatina contendo própolis, exatamente pesados e completou-se o volume com acetonitrila. Em seguida, a amostra foi sonicada por 5 minutos, filtrada através de membrana de PTFE modificada (0,45 µm) e submetida à análise nas condições descritas no item 4.2.2.6. A determinação foi realizada em triplicata e os três principais picos (marcadores) foram quantificados em massa (g) de crisina em 100g de micropartículas secas (BRUSCHI et al., 2003b).

4.2.3.4 Determinação da eficiência de encapsulação

A eficiência de encapsulação foi determinada dividindo o teor observado do marcador nas micropartículas de gelatina contendo própolis, pela quantidade teórica do mesmo, multiplicando o resultado por 100 (BRUSCHI, 2002).

4.2.4.1 Difusão em agar

A atividade antimicrobiana dos extratos de própolis (EFEI 97 e EFEI2002) e das micropartículas de gelatina contendo própolis (MPEFEI 97 e MPEFEI 2002) foi avaliada frente Candida albicans ATCC 10231, Candida albicans ATCC 28366, Enterococcus faecalis ATCC 4082, Enterococcus faecalis ATCC 10541, Escherichia coli ATCC 25922, Kocuria rhizophila ATCC 9341, Lactobacillus casei ATCC 11578, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Streptococcus mitis ATCC 49456, Streptococcus mutans ATCC 25175, Streptococcus salivarius ATCC 25975, Streptococcus sanguinis ATCC 10556 e Streptococcus sobrinus ATCC 33478, pela técnica de difusão em agar (método do poço) utilizando o sistema de dupla camada de agar, preconizado por Grove e Randall (1955). As cepas de microrganismos foram suspensas em 2,5 mL de meio de cultura estéril Brain-Heart Infusion (BHI). A concentração padronizada de cada suspensão de microrganismo foi obtida utilizando-se espectrofotômetro, em comprimento de onda (λ) de 800 nm, atingindo a transmitância de 90, equivalente a 0,5 da escala de McFarland (1,5 x 108 UFC/mL). Para as suspensões de cepas de C. albicans, a transmitância foi ajustada para 80, equivalente a 1,0 na escala de McFarland (3,0 x 108 UFC/mL). Foram homogeneamente misturados 12,5 mL de agar BHI (50 °C) e 2,5 mL de suspensão da cepa a ser testada. Essa mistura foi adicionada sobre a camada previamente depositada de 25 mL de agar BHI (placa de Petri 25,0 x 125,0 mm), obtendo-se assim a camada seed. Após a solidificação, essa camada seed foi perfurada com um cilindro de aço inoxidável esterilizado (4,0mm de diâmetro interno) para formação dos poços, cuja localização ficou cerca de 25 mm da borda e eqüidistantes entre si a uma distância de 40 mm. A seguir, os poços foram preenchidos com os extratos de própolis, micropartículas contendo própolis, álcool etílico (controle negativo) ou solução de gluconato de clorexidina, penicilina, gentamicina ou miconazol (controle positivo). Para a difusão dos agentes através do agar, as placas foram mantidas em temperatura ambiente por duas horas. A seguir, as mesmas foram incubadas em aerobiose ou microaerofilia (jarra de anaerobiose com sistema Gás-Pack), de acordo com as exigências dos microrganismos indicadores quanto à atmosfera, a 37°C durante 24 e/ou 48 horas. Decorrido

medido incluindo o poço e no seu maior diâmetro. O critério de avaliação da susceptibilidade é baseado na presença ou ausência de uma zona de inibição de crescimento bacteriano (halo de inibição) e o tamanho real desse halo (MÖLLER, 1966; KOO et al., 2000). Todos os ensaios foram realizados em triplicata.

4.2.4.2 Determinação da concentração inibitória mínima

A determinação da concentração inibitória mínima (CIM) dos extratos (EFEI 97 e EFEI 2002) e das micropartículas de gelatina contendo própolis (MPEFEI 97 e MPEFEI 2002) foi realizada frente à Candida albicans ATCC 10231, Candida albicans ATCC 28366, Enterococcus faecalis ATCC 4082, Enterococcus faecalis ATCC 10541, Escherichia coli ATCC 25922, Kocuria rhizophila ATCC 9341, Lactobacillus casei ATCC 11578, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Streptococcus mitis ATCC 49456, Streptococcus mutans ATCC 25175, Streptococcus salivarius ATCC 25975, Streptococcus sanguinis ATCC 10556 e Streptococcus sobrinus ATCC 33478, por meio da técnica de titulação em microplaca (ANDREWS, 2001). Com o auxílio de uma alça de inoculação esterilizada, culturas de 24 horas dos microrganismos indicadores, desenvolvidos em agar Brain Heart Infusion (BHI) foram transferidas para tubos contendo 10 mL de Trypitic Soy Broth (TSB). As suspensões foram padronizadas utilizando-se espectrofotômetro (λ = 800 nm) para ajustar a transmitância em 90, equivalente a 0,5 na escala de McFarland (1,5 x 108 UFC/mL). Para as cepas de C. albicans, a transmitância de cada suspensão foi ajustada para 80, equivalente a 1,0 na escala de McFarland (3,0 x 108 UFC/mL). Em uma microplaca esterilizada de 96 orifícios, foram depositados 100 µL de TSB, suspensão microbiana e substância a ser testada, de forma a obter-se uma concentração final de 0,078 µg/mL a 300 µg/mL. Penicilina ou miconazol foi utilizado como controle positivo. Em um dos orifícios foi feito o controle da cultura, o qual deve apresentar crescimento bacteriano devido à ausência do agente antimicrobiano. Em outro orifício foi feito o controle de esterilidade do caldo TSB. A placa foi selada com filme de PVC e incubada a 37 oC durante 24 e/ou 48 horas. Posteriormente, foram adicionados 30 µL de solução aquosa de resazurin 0,01% (p/V) em cada orifício com bactérias. A cor vermelha foi interpretada como crescimento positivo e a cor azul como ausência de crescimento. Em cada

Todos os ensaios foram realizados em triplicata.

4.2.5 Seleção do extrato de própolis e das micropartículas de gelatina contendo própolis