PROCESSAMENTOS DAS AMOSTRAS

4.2.1 Concentração viral

Realizou-se a concentração viral, visto que, de forma geral, as partículas virais encontram-se extremamente diluídas nas amostras de estudo. Desta forma, segui-se metodologia descrita por Katayama et al. (2002) com algumas modificações, especialmente relacionadas ao volume das amostras, os valores das soluções utilizadas foram proporcionalmente ajustados ao volume de água usada nos ensaios. Para a certificação da eficiência do método, antes do processamento das amostras de estudo, realizou-se um teste experimental, onde uma amostra padrão de Adenovírus bovino tipo 3 (BAV), gentilmente cedida pelo Dr. Eduardo Furtado Flores (Setor de Virologia, UFSM) foi utilizada como modelo. Neste caso, análises com Adenovírus como modelo foram realizadas, tendo em vista o cultivo fácil deste agente in vitro, diferente do TTV, de cultivo fastidioso. Os procedimentos de cultivo celular e viral foram realizados em parceria com o Laboratório de Virologia do ICBS/ UFRGS. O vírus foi propagado em células de cultivo CRIB, de origem bovina. As células foram mantidas em frascos plásticos contendo Meio mínimo essencial de Eagle (E-MEM, Sigma) acrescido 2% de Soro Fetal Bovino (SFB, Cultilab). Os cultivos foram mantidos em estufa a 37°C seguindo metodologia usual. O BAV foi inoculado em monocamadas celulares semi-confluentes e após adição de E-MEM sem SFB, os cultivos celulares inoculados foram novamente levados a 37°C e observados diariamente quanto à presença de efeito citopático (CPE) por visualização em microscópio invertido. Quando o CPE estava presente em aproximadamente 70% do cultivo analisado, conforme inspeção visual, o sobrenadante foi coletado, homogeneizado por agitação, aliquotado em criotubos e conservado à temperatura de -70°C. Após, alíquotas de cultivo do BAV foram submetidas à titulação viral, visando a quantificação do número aproximado de doses infectantes (DI) presentes, utilizando para tanto a técnica de diluições limitantes de base 10 em microplacas, seguindo metodologia usual anteriormente descrita (SPILKI et al., 2006). Os títulos foram calculados conforme o método de Spearman-Karber e então determinados os valores de diluição e, por conseguinte os valores para doses infectantes.

Para os ensaios de concentração viral propriamente dita, água autoclavada, inicialmente negativa para a presença de Adenovírus, foi aliquotada em frascos de vidro contendo 500 mL, os quais foram inoculados com volumes de 100 µL contendo 100, 10, 1, 0,1 DI ou ainda menos, seguindo a diluição até 10-7 da solução inicial. Foi mantido ainda um frasco não inoculado, como controle negativo. Todos os ensaios foram realizados em duplicata.

No protocolo de concentração viral testado, pequenas modificações ao que foi proposto por Katayama et al. (2002) foram inseridas, com base em experimentos prévios e relatos da literatura, principalmente no que tange aos volumes utilizados, bem como na opção em não realizar um passo adicional de ultracentrifugação. Brevemente, às amostras experimentalmente contaminadas com BAV, no volume de 500 mL, foram adicionados inicialmente 0,3 g de MgCl2 (25 mM) e o pH foi ajustado a 5,0 utilizando uma solução 1N de H2SO4, com auxílio de medidor de pH eletrônico. Após, a mistura resultante teve sua passagem forçada pela membrana HA descrita anteriormente, em carcaça de acrílico esterilizada, com auxílio de uma bomba de vácuo de 1 hp, a qual exerceu uma pressão negativa sobre o sistema de 1 atm, em uma velocidade de filtração de aproximadamente 100 mL/ min. Aproveitando este mesmo sistema de vácuo, a membrana foi lavada com 87,5 mL de uma solução 0,5 mM de H2SO4 pH 3,0. No passo seguinte realizou-se a etapa de eluição onde, ainda sob pressão negativa, passou pela membrana 2,5 mL de uma solução 1 mM de NaOH com pH 10,5. O filtrado resultante foi então neutralizado com 12,5 µl de 50 mM H2SO4 e tampão Tris-EDTA (TE) 100X concentrado. Esse material foi aliquotado a partir do copo coletor e mantido a -70°C até o processamento.

Com vistas a realizar a PCR, foi feita a extração de ácidos nucléicos virais para o Adenovírus, utilizando para tanto o “kit” comercial RTP DNA/RNA Virus Mini Kit (Invitek), seguindo instruções do fabricante igualmente ao protocolo usado para a extração do DNA do TTV citado neste trabalho. O DNA viral assim obtido foi usado como molde para a amplificação por PCR. Utilizando ferramentas de bioinformática, foram desenhados oligonucleotídeos com potencial de alinhamento em regiões altamente conservadas do genoma de Adenovírus, com base em sequências disponíveis no Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/). Os oligonucleotídeos escolhidos foram denominados ADV-F1 (5’-CAGTGGTCGTACATGCACAT-3´) e ADV-R1 (5’-TCGGTGGTGACGTCGTGG-3´), e

amplificam em torno de 130 pares de bases do fragmento genômico alvo. As reações de PCR foram realizadas em volume final de 50µL, contendo 3 µL de solução de DNA extraído da amostra a testar e diluídos em 20 µL de H2O ultrapura, 1 µL de solução com 20 pmol de cada iniciador (ADV-F1 e ADV-R1) e 25 µL da solução pré-pronta 2X PCR Master Mix (Promega). A reação compreendeu uma etapa inicial de 2 minutos a 94ºC seguida por 40 ciclos de 1 minuto a 94ºC para desnaturação das cadeias, 1 minuto para anelamento dos iniciadores a 58°C e 1 minuto a 72ºC para extensão das cadeias, passados os ciclos, utilizaram-se mais 7 minutos a 72ºC para extensão final dos produtos. Após a reação, o produto foi analisado por eletroforese em gel de agarose 1% em tampão TBE 1X com adição do corante atóxico Blue Green (Promega) e posteriormente visualizados sob luz ultravioleta (UV).

Observou-se a amplificação dos produtos de PCR na faixa de 100 a 1 DI (dose infectante) viral diluída em 500 mL de água nas PCRs realizadas, sempre com amplicons apresentando o tamanho esperado. Não houve amplificação em controles negativos (água pura não inoculada) nem em diluições inferiores a 1 DI (0,1 DI em diante). Tais resultados demonstram que para o vírus estudado (BAV) em situações de contaminação artificial de água obtida em laboratório, a técnica descrita é suficiente para a detecção de quantidades tão pequenas quanto uma DI, alcançando portanto algo próximo do limite teórico de detecção, evitando o gasto adicional com aparatos para ultracentrifugação ou floculantes.

Posteriormente, utizando-se da técnica anteriormente descrita, processou-se a concentração viral das amostras de campo e de maneira semelhante o produto obtido foi aliquotado em eppendorf de 1,5 mL a partir do copo coletor e mantido a -70°C até o processamento.

4.2.2 Extração de DNA viral

Para a realização da extração de ácidos nucléicos virais, utilizou-se o “kit” comercial RTP DNA/RNA Virus Mini Kit (Invitek), seguindo instruções do fabricante. O processo de extração viral procedeu-se na sequencia de eventos, onde inicialmente colocou-se em um tubo tipo “eppendorf” de 1,5 mL, 200 µL de amostra que foram homogeneizados com 200 µL de H2O ultrapura, após as misturas foram

transferidas a um "Extraction Tube". Em seguida vortecou-se e colocou-se o "Extraction Tube" em banho-maria por 15 minutos a 65°C e após por 10 minutos a 95° C. Na sequência procedeu-se o pré-aquecimento do "Elution Buffer R" a 80°C (60 ul para cada amostra) que manteve-se aquecido até seu uso no final da extração. O processo inicial da ligação do DNA e RNA se procedeu adicionando 400 µL de "Binding Solution" ao "Extraction Tube" e em seguida homogeneizou-se e transferiu-se a mistura pra um "Spin filter Set" e logo após centrifugou-se a 10.000 rpm por 1 minuto. Na sequência descartou-se o "RTA receiver" com o filtrado e colocou-se o tubo com filtro novamente em um novo “RTA receiver tube”. Para a realização da primeira lavagem adicionou-se 500 µL do "Wash buffer R1" ao último "Spin filter Set" e novamente centrifugou-se a 10.000 rpm por 1 minuto, descartou-se o filtrado e recolocou-se o Spin filter no “RTA receiver tube”. Na segunda lavagem adicionou-se 800 µL do "Wash buffer R2" ao último "Spin filter Set" e novamente centrifugou-se a 10.000 rpm 30 segundos, descartou-se o filtrado e recolocou-se o Spin filter no RTA receiver tube, e na sequência centrifugou-se por 4 minutos na velocidade de 14.000 rpm. Para finalizar, a coleta do DNA foi realizada colocando-se o “RTA spin filter” num “eppendorf” de 1,5 mL e ao mesmo adicionou-se 60 µL do "Elution buffer R" (pré-aquecido a 80°C). Em seguida deixou-se repousar à temperatura ambiente por 3 minutos, após centrifugou-se por 1 minuto a 10.000 rpm, e por fim coletou-se o líquido filtrado. O DNA viral assim obtido foi armazenado em freezer a -70ºC para posterior processamento de amplificação dos fragmentos genômicos virais alvo por PCR.

4.2.3 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e Eletroforese

A reação em cadeia da polimerase procedeu-se utilizando ferramentas de bioinformática, onde foram desenhados oligonucleotídeos com potencial alinhamento em fragmentos altamente conservados do gene ORF2 do Torque teno

vírus, com base em sequências disponíveis no Genbank

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/). Os iniciadores escolhidos foram os seguintes: F1: 5' - GGG AGC TCA AGT CCT CAT TTG - 3' F2: 5' - GGG CCW GAA GTC CTC ATT AG - 3' e - Rev: GCG GCA TAA ACT CAG CCA TTC - 3'. Posteriormente utilizando-se para F1 (início posição 221 do genoma), F2 (posição

170 do genoma) e Ver (final na posição 272 do genoma), sendo que o conjunto dos três oligonucleotídeos fornece um amplicon de 103 pb que amplificam em torno de 100 pares de bases do fragmento genômico alvo. Estes iniciadores apresentaram sensibilidade para detectar amostras de TTV em amostras de soro de suíno e também em humanos, embora outras espécies de TTV possam vir a ser identificadas após sequenciamento genômico. A padronização e as reações de PCR foram realizadas em volume final de 50µL, contendo 1,0 µL de amostra de DNA controle positivo na diluição de 1:100 diluído em 22,5 µL de H2O ultrapura, 0,5 µL de solução 20 pmol de cada iniciador (F1, F2 e Rev) e 25 uL da solução pré-pronta 2X PCR Master Mix (LGC). A reação compreendeu uma etapa inicial de 2 minutos a 94ºC seguida por 40 ciclos de 1 minuto a 94ºC para desnaturação das cadeias, 30 segundos para o anelamento dos iniciadores a 59°C e 30 segundos a 72ºC para extensão das cadeias. Passados os ciclos, utilizaram-se mais 7 minutos a 72ºC para extensão final dos produtos. Em todas as reações utilizou-se uma amostra positiva de DNA viral previamente testada e como controle negativo utilizou-se uma amostra de DNA extraído de cultivo celular não infectado (fig. 6). Após a reação, adicionou-se 1,0 µL do corante atóxico fluorescente (Blue Green) da marca LGC, a 10 µL do produto da PCR, posteriormente a mistura foi analisada por eletroforese em gel de agarose a 2% em tampão TBE 1X. A corrida inicialmente foi de 30V por 10 minutos, seguidos de 90V por mais 30 minutos, posteriormente os resultado foram visualizados sob luz ultravioleta (UV), analisados e fotografados. Em todas as análises utilizou-se o marcador de peso molecular 100pb DNA (ladder) do fabricante Promega com limite de detecção de 1.500pb a 100pb, o qual serviu para definir o peso molecular dos fragmentos amplificados.

Figura 6 Visualização da padronização da PCR utilizando os controles positivos e negativos. Eletroforese em gel de agarose 2%, adicionado do corante atóxico Blue Green (Promega) e

visualizados sob luz ultravioleta. Amostras 1 e 2: controles positivos; 3 e 4: controles negativos, 5: marcador de peso molecular.