Centro Universitário Feevale Programa de Pós-Graduação em Qualidade Ambiental. Mestrado em Qualidade Ambiental

Mestrado em Qualidade Ambiental

ANDRÉIA DALLA VECCHIA

DETECÇÃO MOLECULAR DE TORQUE TENO VÍRUS EM

AMOSTRAS DE ÁGUA

Livros Grátis

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Mestrado em Qualidade Ambiental

ANDRÉIA DALLA VECCHIA

DETECÇÃO MOLECULAR DE TORQUE TENO VÍRUS EM

AMOSTRAS DE ÁGUA

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Qualidade Ambiental como requisito para a obtenção do título de Mestre em Qualidade Ambiental.

Orientador: Prof. Dr. Fernando Rosado Spilki

Bibliotecária responsável: Susana Fernandes Pfarrius Ladeira – CRB 10/1484 Vecchia, Andreia Dalla

Detecção molecular de Torque Teno Vírus em amostras de água / Andreia Dalla Vecchia. – 2010.

84 f. ; 30 cm.

Dissertação (Mestrado em Qualidade Ambiental) – Feevale, Novo Hamburgo-RS, 2010.

Inclui bibliografia e apêndice.

“Orientador: Prof. Dr. Fernando Rosado Spilki”.

1. Toque Teno Vírus (TTV). 2. Água - Análise. 3. Vírus entérico. 4. Meio ambiente. I. Título.

Mestrado em Qualidade Ambiental

ANDRÉIA DALLA VECCHIA

DETECÇÃO MOLECULAR DE TORQUE TENO VÍRUS EM

AMOSTRAS DE ÁGUA

Dissertação de mestrado aprovada pela banca examinadora em 22 de fevereiro de 2010, conferindo ao autor o título de mestre em Qualidade Ambiental.

Componentes da Banca Examinadora:

Prof. Dr. Fernando Rosado Spilki (Orientador) Centro Universitário Feevale

Profa. Dra. Ana Cláudia Franco

Universidade Federal do Rio Grande do Sul Profa. Dra. Sabrina Esteves de Almeida Centro Universitário Feevale

Manifesto meu especial agradecimento a todas as pessoas que contribuíram e permitiram que este trabalho chegasse ao seu final.

Ao Prof. Dr. Fernando Rosado Spilki, pela brilhante orientação, incentivo, dedicação e confiança a mim depositada. Obrigada pelo aprendizado.

Ao Prof. Dr. Paulo Roehe – IPVDF que prontamente me acolheu e permitiu meu aprendizado em seu laboratório.

À amiga Ms. Thais Fumaco Teixeira - IPVDF, pela dedicação e apoio desde o início do mestrado, a ela devo minha gratidão.

À amiga e colega Márcia Regina Thewes – DMAE, por estar sempre presente, prestando auxílio nas coletas e não medindo esforços para auxiliar-me.

À equipe de pesquisa do Laboratório de Microbiologia Molecular da Feevale, Raquel, Joseane, Manoela, Juliana, Mariana, Roger, Bianca, Michele, Lucas, Thalita, Julio, Gabriela pelo apoio, dedicação e auxílio prestados.

Aos colaboradores da UFRGS, docentes do Instituto de Ciências Básicas da Saúde, Profa. Ms. Ana Beatriz Oliveira, Profa. Dra. Marisa Itapema Cardoso e Profa. Dra. Sueli Van Der Sand do curso de pós-graduação em Microbiologia Agrícola e do Ambiente (UFRGS), Gisele Nachtigall Garbinatto, Daniele Vargas de Oliveira, Julie Graziela Zanin, Roberta Capalonga e a técnica Sayonara Peixoto da Rosa pelo apoio nas coletas de estudo e fornecimento das análises bacteriológicas

Ao DMAE – Porto Alegre, Divisão de Pesquisa, especialmente à diretora Iara Morandi e colaboradores, pelo auxílio prestado nas coletas de amostras e envio de dados bacteriológicos.

Ao Centro Universitário Feevale pelo apoio no uso dos laboratórios e à Comissão de Aperfeiçoamento de Ensino Superior CAPES - Prosup pelo auxílio financeiro.

A minha querida família, esposo Julio César, meus queridos pais, e todos familiares de longe e de perto, que sempre manifestaram seu apoio, incentivo e entusiasmo. Agradeço pela paciência, compreensão, carinho e atenção recebidos.

E principalmente a Deus! Por me conceder estímulo, persistência e permitir que todas essas pessoas maravilhosas estivessem ao meu lado.

“Toda a nossa ciência, comparada com a realidade , é primitiva e infantil, no entanto, é a coisa mais preciosa que temos”.

RESUMO

Recentemente, o Torque teno vírus, agente viral constituído de DNA fita simples, não-envelopado e excretado pela via entérica vem sendo considerado um excelente candidato como agente viral marcador de contaminação fecal na água, devido à presença de características semelhantes a vírus entérico e por estar amplamente disseminado na população. Desta forma, o objetivo deste estudo foi investigar a ocorrência de TTV em amostras de águas de diferentes procedências coletadas na região de Metropolitana de Porto Alegre e de diferentes cidades do interior do estado, bem como padronizar uma técnica de concentração viral e uma técnica de reação em cadeia da polimerase aplicável à detecção molecular do TTV em amostras de água, e relacionar com a contaminação bacteriana destas águas. Foram utilizadas amostras de águas coletadas da estação de tratamento ETE São João – Navegantes em Porto Alegre, águas do Arroio Dilúvio, água mineral e águas oriundas de torneiras de escolas estaduais e municipais de três cidades do interior do estado. Após a padronização e validação, os resultados apontam para presença do TTV em 12,5% das amostras de efluente tratado da estação de tratamento (Porto Alegre) e ausência do TTV em amostras de esgoto bruto desta estação, 28,5% de positividade para águas do Arroio Dilúvio (Porto Alegre), 25% para água de escolas municipais da cidade de Pelotas, 10,5% para amostras de escolas estaduais e municipais de Caxias do Sul e negativo para o TTV em água de torneira para ambas as escolas da cidade de Santa Cruz do Sul. Esses resultados demonstram que o TTV está presente em amostras de água no Rio Grande do Sul.

ABSTRACT

Recently, the Torque teno virus, a single-stranded DNA, non-enveloped viral agent which is secreted by the enteric route, has been considered an excellent candidate as a viral marker of fecal contamination in water due to the presence of features similar to enteric viruses and be widespread in the population. Thus, this study aimed to investigate the occurrence of TTV in water samples collected from different sources in the metropolitan region of Porto Alegre and other cities in the state, and standardize a technique for virus concentration and a Polymerase chain reaction technique applied to molecular detection of TTV in water samples, and relate to bacterial contamination of groundwater. Samples collected from water treatment plant Sewage Treatment Plant São João – Navegantes (Porto Alegre), Arroio Dilúvio water, mineral water and tap water from state and municipal schools in three cities. After the standardization and validation of detection techniques, the results indicate the presence of TTV in 12.5% of the samples of treated effluent from treatment plant (Porto Alegre) and absence of TTV in samples of raw sewage, 28.5% positivity for Arroio Dilúvio samples (Porto Alegre), 25% for water in municipal schools in the city of Pelotas, 10,5% for samples of state and municipal schools in Caxias do Sul. Negative for TTV in tap water for both schools in the city of Santa Cruz do Sul. These results shows that TTV is present in water samples in Rio Grande do Sul.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES E FIGURAS

Figura 1. Organização genômica do TTV ... 24

Figura 2. Mapa da localização da ETE São João – Navegantes... 37

Figura 3. Vista aérea da estação de tratamento de esgoto ETE São João ... 37

Figura 4. Localização aproximada dos pontos 1, 2, 3, 4 e 5 do Arroio Dilúvio ... 39

Figura 5. Mapa do Rio Grande do Sul e suas microrregiões ... 41

Figura 6. Visualização da padronização da PCR ... 47

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Resultado viral e bacteriano para amostras da estação de tratamento São João – Navegantes em Porto Alegre. ... 49 Tabela 2. Resultado do TTV para amostras de água de torneira do interior do estado ... 51

LISTA DE SÍMBOLOS E SIGLAS

µl Microlito

µm Micrometro

BAV Adenovírus bovino

CONSEMA Conselho Estadual do Meio Ambiente D.O.U Diário Oficial da União

DMAE Departamento Municipal de Água e Esgoto DNA Ácido desoxirribonucléico

ETE Estação de Tratamento de Efluentes

GC Genome copies

ICBS Instituto de Ciências Básicas da Saúde

Kb Kilobases

Nm Nanômetro

NMP Número Mais Provável

ORF Open reading frame

Pb Pares de base

PCR Reação em cadeia da polimerase pH Pontencial de Hidrogênio

qPCR Reação em cadeia da polimerase em tempo real

RNA Acido ribonucléico

Rpm Rotação por minuto

RT PCR Reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa

SEPLAG-RS Secretaria de Planejamento e Gestão do Estado do Rio Grande do Sul

TTV Torque teno vírus

UFRGS Universidade Federal do Rio Grande do Sul

UV Ultravioleta

Sumário

RESUMO ... VII

ABSTRACT ... VIII

LISTA DE ILUSTRAÇÕES E FIGURAS ... IX

LISTA DE TABELAS ... X

LISTA DE SÍMBOLOS E SIGLAS ... XI

1.INTRODUÇÃO ... 14

2.OBJETIVOS ... 19

3.FUNDAMENTAÇÃOTEÓRICA ... 20

3.1 AGENTES VIRAIS COMO MARCADORES DE QUALIDADE DA ÁGUA ... 20

3.2 TORQUE TENO VÍRUS ... 22

3.3 HISTÓRICO E IMPORTÂNCIA CLÍNICA DO TTV EM SERES HUMANOS ... 24

3.4 EPIDEMIOLOGIA DO TTV ... 26

3.5 DETECÇÃO MOLECULAR DE VÍRUS EM AMOSTRAS AMBIENTAIS ... 27

3.6 TTV COMO MARCADOR DE POLUIÇÃO AMBIENTAL ... 28

3.7 SISTEMAS DE TRATAMENTO DE ESGOTO E ÁGUA PARA CONSUMO ... 30

4.METODOLOGIA ... 35

4.1 AMOSTRAS DE ÁGUA UTILIZADAS E PROCEDIMENTO DE COLETA ... 35

4.1.1 Amostras de Estação de Tratamento de esgoto - DMAE ... 35

4.1.2 Amostras do Arroio Dilúvio – Porto Alegre ... 38

4.1.3 Amostras de água de escolas Municipais e Estaduais ... 39

4.1.4 Amostras de água mineral ... 41

4.2 PROCESSAMENTOS DAS AMOSTRAS ... 42

4.2.1 Concentração viral ... 42

4.2.2 Extração de DNA viral... 44

4.2.3 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e Eletroforese ... 45

4.3 ANÁLISES BACTERIANAS ... 47

5.RESULTADOS ... 48

5.2 ANÁLISES DO ARROIO DILÚVIO – PORTO ALEGRE ... 49

5.3 ANÁLISE PARA ÁGUA TRATADA DE ESCOLAS ... 50

5.4 ANÁLISES DE ÁGUA MINERAL ... 51

6.DISCUSSÃO ... 52

7.CONCLUSÕES ... 57

8.PERSPECTIVAS ... 58

REFERÊNCIABIBLIOGRÁFICA ... 59

1.INTRODUÇÃO

O artigo 1º da Resolução Conama Nº 001, de 23 de janeiro de 1986, publicado no D.O.U. de 17/2/86 define Impacto Ambiental como sendo qualquer alteração das propriedades físicas, químicas e biológicas do meio ambiente. Tais alterações podem ser causadas por qualquer forma de matéria ou energia decorrente das atividades humanas que, direta ou indiretamente, afetam a saúde, a segurança e o bem-estar da população. Além disto, podem afetar as atividades sociais e econômicas, a biota, as condições estéticas e sanitárias do meio ambiente e a qualidade dos recursos ambientais (BRASIL, 1986). Desta forma, a qualidade ambiental pode ser entendida como sendo um conjunto de fatores interligados que abrangem a qualidade do ar, da água, da rede de esgotos e a correta destinação dos resíduos sólidos e líquidos gerados pela população, indústrias e por todos os segmentos da sociedade (VARGAS; TERRA; SARMENTO, 2008). Por sua importância no transporte de materiais entre diferentes matrizes ambientais e sua necessidade para a manutenção das funções em organismos vivos, ocupa lugar de destaque a água.

Com base no exposto acima, o tema qualidade da água potável é uma questão de preocupação para a saúde humana. A problemática da crescente escassez e da queda na qualidade da água disponível para consumo, higiene e recreação é preocupação de ordem mundial, atingindo tanto países em

desenvolvimento quanto desenvolvidos (TUNDISI, 2009,

http://www.ana.gov.br/prodes/prodes.asp; http://www.onu-brasil.org.br/busca.php). Os riscos de agravos à saúde humana ou animal relacionados ao uso de água com baixa qualidade incluem desde a contaminação de agentes infecciosos até a presença indesejável de produtos químicos com potencial tóxico ou genotóxico. As doenças de veiculação hídrica constituem hoje a segunda causa de morbidades no mundo todo, segundo dados da Organização mundial da Saúde (WHO http://www.who.int/). Estes fatos apontam para o valor do gerenciamento e de abordagens preventivas avançadas para o monitoramento e tratamento da água, desde as fontes de captação até o consumidor final (WHO, http://www.who.int/). A WHO referencia que os riscos à saúde humana são hoje e no futuro próximo intensificado pela contaminação microbiológica dos recursos hídricos cada vez mais

escassos. Além disto, a água pode estar contaminada tanto por fezes humanas, quanto por dejetos de animais (WHO, 2006).

Câmara e Tambellini (2003) registram que, no Brasil, o tema da Saúde Ambiental tem a má qualidade de água para o uso humano, as deficiências no saneamento, a poluição de mananciais hídricos, entre outros fatores, como situações de especial risco à manutenção da saúde pública. Nesse contexto, se faz urgente a adoção de estratégias, sejam de monitoramento, sejam de tecnologias de mitigação, que permitam um desenvolvimento sustentável, tendo como foco a preservação dos ambientes salubres para as futuras gerações. O ambiente constitui hoje um ente inseparável e interdependente da saúde e deve ser considerado um campo de ação na prevenção dos agravos em saúde pública. Para Gomes e Soares (2004), a qualidade do meio ambiente é um fator determinante para melhoria da qualidade de vida dos indivíduos e das populações. Além disto, o acesso à água para o consumo de forma segura é essencial para a saúde, um direito humano fundamental e um fator de política eficaz de proteção à saúde. Intervenções para melhorias na qualidade da água proporcionam significativos benefícios para a saúde da população, muitas vezes com notável redução nos gastos em atividades de cunho terapêutico (WHO, 2008).

No caso do Brasil, calcula-se que metade da população brasileira está submetida, ainda hoje, ao impacto do saneamento básico inadequado e de doenças a ele relacionadas, muito evidenciadas nos estados do Norte e Nordeste do país (NETTO e CARNEIRO, 2009). Todavia, essa situação mostra-se também bastante presente em diversos estados das demais regiões, denunciando que o saneamento básico inadequado é ainda um problema de escala nacional que necessita ser tratado como prioridade. No caso do Rio Grande do Sul, enquanto 80% dos domicílios estão conectados às redes de abastecimento de água, apenas 27,43% estão interligados à rede geral de esgoto, segundo dados publicados pela Secretaria de Planejamento e Gestão do Estado do Rio Grande do Sul (SEPLAG – RS, http://www.seplag.rs.gov.br/download.asp?nomeArq=SaneamentoFinal.pdf). Vale ressaltar que a ligação à rede não resulta na maioria dos casos em tratamento do esgoto, sendo que na maioria dos municípios gaúchos esses resíduos são lançados diretamente nos corpos hídricos. Esta situação é idêntica àquela relatada para outros países em desenvolvimento, onde as doenças relacionadas à veiculação

hídrica afetam principalmente a qualidade de vida das pessoas de classes menos favorecidas nas populações (WHO, 2003).

Para controlar a contaminação microbiológica e ambiental dos recursos hídricos, no atual sistema de tratamento e monitoramento microbiológico de esgotos e tratamento de água, a Escherichia coli, pertencente ao grupo dos coliformes termotolerantes, é a bactéria marcadora da poluição fecal em águas e esgoto (BRASIL, 2004; RIO GRANDE DO SUL, 2006). Na década de 1990, algumas autoridades governamentais européias incluíram nos padrões microbiológicos utilizados na avaliação da qualidade da água, além dos indicadores bacterianos, a análise de vírus entéricos, em especial Enterovírus e Adenovírus, como indicadores virológicos (MEHNERT et al., 2001). Em cumprimento à legislação vigente, o monitoramento prestado em nosso país por serviços de controle do saneamento ambiental está voltado somente para análise bacteriológica da água, não contemplando a análise virológica. Neste ponto, a resolução 518/2004 do Ministério da Saúde, apenas sugere que se faça a pesquisa de Enterovírus com o objetivo de atingir um padrão de ausência destes agentes, porém não se referenciam metodologias, procedimentos, critérios e não se estabelecem parâmetros mínimos ou máximos aceitáveis. Tal normativa passa atualmente por revisão, a qual deve integrar a análise virológica da água de consumo (MIAGOSTOVICH, M., comunicação pessoal).

Em relação à detecção de vírus em amostras de água, esta teve seu início há aproximadamente 60 anos (METCALF; MELNICK; ESTES, 1995), sendo o foco inicial voltado aos estudos de disseminação de Poliovírus vacinal e selvagem em amostras de água para consumo (BERG, 1974; FONG e LIPP, 2005). Anterior a este evento, um surto de hepatite viral provocada pela contaminação de fontes de água por esgotos do rio Jumna em Nova Delhi na Índia, também teve sua importância na detecção de vírus em águas (BOSCH, 1998).

Assim, os vírus entéricos, tais como Poliovírus, Rotavírus, Calicivírus e o Vírus da hepatite A e E, entre outros, são agentes virais que estão presentes no trato gastrointestinal humano e em alguns casos também de outros animais. Estes agentes são eliminados através das fezes e são geralmente transmitidos por via fecal-oral, podendo em seu ciclo no ambiente, contaminar o solo, os alimentos e a água (LECRERC et al., 2002; TAVARES et al., 2005). Estes vírus são importantes

agentes etiológicos de gastroenterites e hepatites em humanos e, em razão de sua veiculação hídrica, são motivos de constante preocupação em saúde pública. Dada sua disseminação hídrica, os mesmos se constituem hoje poluentes ambientais (GUTIÉRREZ et al., 2007), afetando não só a vida humana quanto a biodiversidade (PINA et al., 1998). Ainda que possam causar na maioria dos eventos, infecções assintomáticas, os diferentes tipos de vírus entéricos podem causar diversas doenças quando do consumo de água contaminada, tais como paralisia infantil, meningite, doenças respiratórias e diarréia, a exemplo dos Rotavírus, o principal agente etiológico de diarréia infantil no mundo (TEIXEIRA e LEAL, 2002). Há ainda o contágio por agentes virais em atividades de banho ou recreação, como é caso de infecções pelo vírus da Hepatite A ou Adenovírus (CUSACK, 2005; POND, 2005; SHORT et al., 2006). Além disto, conforme relatado, segundo dados da Organização Mundial da Saúde, doenças relacionadas ao consumo e outros usos de águas contaminadas estão entre as principais causas de morbidade e mortalidade no mundo todo (HEDBERG e OSTERHOLM, 1993; WHO, 2003; COLFORD et al., 2006).

Com o advento e a disseminação do uso de metodologias moleculares, uma série de novos microrganismos tem sido descobertos. Dentre os novos vírus, há um agente viral não-envelopado dotado de excreção pela via entérica, denominado Torque teno vírus (TTV, NISHIZAWA et al., 1997). O TTV apresenta características biológicas similares a vírus entéricos, é um vírus não-envelopado e excretado pela via fecal, possui elevada resistência no ambiente e está amplamente disseminado na população, desta forma, tem sido identificado como um excelente candidato no uso como marcador de contaminação fecal em águas (GRIFFIN et al., 2008). No presente estudo foi realizada a detecção molecular com vistas a determinar a ocorrência do TTV em amostras de água colhidas na região Metropolitana de Porto Alegre e municípios do interior do estado, abrangendo a Bacia do Guaíba e Bacia Hidrográfica Litorânea. As amostras aqui estudadas foram de água superficial, efluentes de estação de tratamento de esgoto, água mineral comercializada na região metropolitana e também água tratada de torneira da cozinha de escolas municipais e estaduais de três cidades do interior do estado do Rio Grande do Sul. Para a realização deste estudo, utilizou-se a técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR), a qual possui elevada especificidade e sensibilidade e tem sido

muito utilizada, nos últimos anos, para detecção de vírus em amostras ambientais (KATAYAMA et al., 2002; LEY et al., 2002). Com maior limitação, este método sozinho não permite distinguir a presença de vírus infeccioso (vírions) da simples presença de fragmentos genômicos e partículas virais não infecciosas (FONG e LIPP, 2005). Dada a dificuldade inerente ao isolamento do TTV em cultivos celulares, no presente estudo utilizou-se a amplificação de um pequeno fragmento da região ORF2 do genoma de TTV que embora seja uma região altamente heterogênea em seus aspectos globais, apresenta diversas regiões conservadas do genoma viral que permitem detectar e, por conseguinte classificar a posteriori um maior número de genogrupos de TTV em um mesmo conjunto de ensaios (WATANABE et al., 2005). Este estudo é pioneiro no Rio Grande do Sul, onde nosso grupo iniciou as primeiras pesquisas para detecção de vírus entéricos em amostras de água há aproximadamente um ano e meio atrás.

2.OBJETIVOS

Geral

Investigar a ocorrência de TTV em amostras de água de diferentes origens, coletadas em regiões diversas do estado do Rio Grande do Sul.

Específicos

- Padronizar uma técnica molecular de reação em cadeia da polimerase aplicável a detecção de TTV em amostras de água de diferentes tipos;

- Investigar a relação entre a presença de TTV e a possível contaminação fecal em amostras de águas colhidas na cidade de Porto Alegre, especialmente de amostras coletadas na estação de tratamento do DMAE – ETE São João – Navegantes e amostras de água superficial coletada ao longo do Arroio Dilúvio;

- Pesquisar a ocorrência de TTV e relacionar com a possível contaminação fecal em amostras de água mineral de uso comercial na cidade de Porto Alegre;

- Investigar a ocorrência de TTV em amostras de água tratada obtida de torneira da cozinha de escolas municipais e estaduais do interior do estado do Rio Grande do Sul.

- Comparar a detecção molecular de TTV e detecção de coliformes fecais em amostras de água, analisando o potencial do TTV como marcador de contaminação fecal.

3.FUNDAMENTAÇÃOTEÓRICA

3.1AGENTESVIRAISCOMOMARCADORESDEQUALIDADEDAÁGUA

No atual sistema de monitoramento da qualidade da água, a Escherichia coli (coliformes termotolerante) e demais microrganismos pertencentes ao grupo dos coliformes são as bactérias marcadoras da poluição fecal em águas e esgoto (BRASIL, 2004; RIO GRANDE DO SUL, 2006). Tal indicador tem se mostrado insuficiente e limitado, pois esses microrganismos podem não atestar o risco de infecção por outros patógenos, especialmente vírus, no ambiente (DORE et al., 2000; DURAN et al., 2002; HARAMOTO et al., 2005b; GRIFFIN et al., 2008). Já foram identificados mais de 140 tipos de vírus de veiculação hídrica, alguns potencialmente causadores de enfermidades em seres humanos (HAMZA et al., 2009) que podem ser encontrados em esgotos sanitários, que por sua vez estarão contaminando o ambiente aquático que mais tarde acaba sendo utilizado como fonte de água potável. A contaminação viral de águas subterrâneas e poços também tem sido relatada frequentemente (TEIXEIRA e LEAL, 2002).

Os vírus entéricos são em geral eliminados em quantidades relativamente grandes pelas fezes de indivíduos infectados, podendo atingir títulos virais de aproximadamente 108 a 1011 partículas virais por grama de fezes, conforme o agente viral analisado (MEHNERT, 2003). A presença desses patógenos pode estar associada tanto a infecções assintomáticas quanto à ocorrência de doenças em indivíduos susceptíveis (TAVARES et al., 2005). As infecções são ocasionadas tanto pela ingestão de água contaminada quanto pelo seu uso para recreação. Para alguns agentes, apenas uma unidade infecciosa de vírus é o suficiente para iniciar uma infecção em um indivíduo suscetível (GRAHAM et al., 1987).

Os vírus excretados pela via fecal são, em geral, não-envelopados, o que lhes confere elevada resistência a condições ambientais adversas. Podem permanecer viáveis por longos períodos na água, até mesmo em ambiente marinho e em águas subterrâneas, resistindo a condições ambientais desfavoráveis ou letais para outros microrganismos, tais como extremos de pH, elevadas temperaturas e alta salinidade (LEY et al., 2002; FONG e LIPP, 2005). Tanto o consumo direto da água, seu uso em atividades de higiene e recreação, quanto o uso de vegetais

folhosos ou moluscos contaminados na alimentação podem ser uma forma eficaz de contágio por vírus entéricos (BOSCH, 1998; VINATEA et al., 2006).

Organismos filtrantes possuem a capacidade de armazenar altas concentrações de vírus no interior do seu corpo, a exemplo de organismos aquáticos como os mariscos que tendem a concentrar bactérias e vírus em suas vísceras, muitas vezes em níveis superiores aos da água circulante (ABAD et al., 1997; PARASHAR e MONROE, 2001). Conforme mencionado anteriormente, também alguns vírus potencialmente patogênicos podem ser transmitidos pelo uso de águas para fins recreativos e no caso da Hepatite A, esta parece constituir uma importante forma de contaminação (TAYLOR et al., 1995; SABACK et al., 2001).

Embora não se multipliquem quando estão dispersos no ambiente por serem parasitos intracelulares obrigatórios, os vírus não-envelopados são geralmente mais resistentes do que procariotos ou mesmo vírus envelopado aos métodos químicos e físicos utilizados no tratamento de água e esgoto, a solventes, detergentes ou compostos que no ambiente possam degradar sua estrutura. Assim, os vírus entéricos apresentam vantagens em relação às bactérias como marcadores de eficiência do processo de descontaminação da água, pois muitos agentes viras são mais resistentes aos processos de desinfecção por tratamento de cloração e radiação ultravioleta. Além disto, muitos dos procariotos são mais susceptíveis aos processos de tratamento químico-físico e à degradação ambiental (JIANG et al., 2007). Desse modo, a ausência ou baixa concentração de bactérias de presumida origem fecal na água não significa ausência de vírus entéricos (JIANG et al., 2007). De fato, os tratamentos primários (físicos) e secundários (químicos, cloração) presentemente utilizados tem baixa eficácia na eliminação de vírus em água potável, sendo hoje amplamente estudadas as alternativas em tratamentos terciários ou melhoramentos ao tratamento secundário, como a adição de um passo de exposição à radiação Ultra-violeta (UV, NIEUWSTAD et al., 1991), todavia, alguns agentes tem elevada resistência aos raios UV, como no caso de Adenovírus (KO et al., 2005; EISCHEID et al., 2009).

A ausência de rotinas em análise virológica pelos serviços de monitoramento e fornecimento de água potável, tem se caracterizado como um problema de ordem mundial. Acredita-se que esse fato venha contribuindo para os episódios de surtos de gastroenterites e para a elevada prevalência de hepatites dos tipos A e E,

especialmente em áreas em desenvolvimento na Ásia, África e América Latina, sendo freqüentemente associadas a surtos de doenças transmitidas pela água (TEIXEIRA e LEAL, 2002; THERON e CLOETE, 2002). Os vírus entéricos não são apenas excretados em grande quantidade pelas fezes e urina de indivíduos infectados, como muitos deles são capazes de se manterem viáveis com sua infectividade conservada na água, persistindo no ambiente por vários meses. Sua inativação é dependente do tipo de vírus e do tratamento utilizado (HURST, 1991; LAZAROVA et al., 1999 ), muitos destes, a exemplo do Rotavírus e Enterovíurs tem demonstrado resistência à cloração (PAYMENT, 1985) e o Adenovírus também a radiação (UV) (GERBA et al., 2002; THOMPSON et al., 2003). Estes vírus têm sido isolados a partir de amostras de água potável que atendem aos padrões bacteriológicos e químicos (LEE e KIM , 2002).

3.2TORQUETENOVÍRUS

O Torque Teno vírus (TTV) é um vírus não envelopado, pequeno, composto por DNA fita simples, circular com polaridade negativa e formado por 3,4 – 3,9 kb de comprimento (MUSHAHWAR et al., 1999; OKAMOTO et al., 2000a,b; WATANABE et al., 2005; DEVALLE e NIEL, 2005) e diâmetro de 30-32 nm (ITOH et al., 2000). O genoma é bastante reduzido, sendo composto por apenas 3.853 nucleotídeos (BENDINELLI et al., 2001) e apresenta duas ou três possíveis Open Reading Frame (ORFs) capazes de codificar 770 aa (ORF1), 202 aa (ORF2) e 105 aa (ORF3) (MYATA et al., 1999) (Fig.1). Embora seja um vírus de DNA, mostra um elevado grau de diversidade e apresenta diferentes genótipos (OKAMOTO et al., 1999). Além disso, este vírus pode exibir características similares aos vírus entéricos patogênicos (GRIFFIN et al., 2008). Inicialmente o TTV apresentava características compatíveis com o gênero Anellovirus e família Circoviridae (MUSHAHWAR et al., 1999; MYATA et al., 1999), atualmente a classificação se resume somente ao gênero Anellovirus (BIAGINI et al., 2006). Este vírus tem sido detectado não apenas em humanos, mas também em outros mamíferos, tais como felinos, caninos e suínos (DEVALLE e NIEL, 2005). Posteriormente um novo vírus de DNA, pequeno, considerado parente distante do TTV foi descrito (TAKAHASHI et al., 2000). Estes outros vírus denominados de Torque teno mini vírus (TTMV), possuem o genoma ainda menor

que o TTV, apresentando em torno de 2,8 a 2,9 kb e 2.915 bases, menor que a sequência genômica prototípica do TTV que apresenta 3.852 bases (NINOMIYA et al., 2007). TTV e TTMV mostram divergência de sequências genômicas ainda maior entre si do que entre os genótipos do TTV, porém é difícil de determinar o grau de divergência visto que os fragmentos genômicos dos dois vírus não podem ser facilmente alinhados. O TTV possui sequências com maior percentual de GC do que as sequências nucleotídicas do TTMV, (65,4% e 58,5% respectivamente) (THOM et al., 2003). Uma recente descoberta, de um novo anellovirus chamado de Torque teno midi vírus (TTMDV) foi relatada, o mesmo possui genoma com extensão de 3.2 kb e tem sido demonstrada uma alta prevalência em chipanzés e não em seres humanos (NINOMIYA et al., 2009).

O TTV já foi detectado em bovinos, suínos, aves, ovinos e em vários primatas não humanos (BRASSARD et al., 2008, OKAMOTO et al., 2000 a). Estudos identificaram a presença de TTV suíno em até 66% de amostras de soro coletadas de animais sadios. O genoma do TTV de origem suína é menor e possui similaridade em torno de 45% em relação às sequências genômicas do TTV humano (MCKEOWN et al., 2004).

Apesar do pouco conhecimento sobre suas propriedades biológicas, sabe-se que o TTV apresenta considerável diversidade genética, tendo sido encontrados cerca de quarenta genótipos, até o momento. Estes podem ser classificados em cinco grupos que teoricamente podem apresentar diferentes níveis de virulência (PENG et al., 2002; MAGGI et al., 2007). Entretanto, embora a associação do TTV com indução de doença em humanos seja discutível, estudos indicam que o genótipo 1, especificamente, tem possível maior participação nestes processos (WATANABE et al., 2005). Além disto, os genótipos tipo 1 e 2 do TTV estão, aparentemente, mais distribuídos geograficamente em todo o mundo (OKAMOTO et al., 1998b), presente nos vários continentes (BENDINELLI et al., 2001). Embora a pesquisa do TTV já tenha alcançado 10 anos de investigação, a distribuição da infecção pelo TTV em seres humanos, por muitos considerada ubíqua, ainda continua sendo um tema de discussão (VASILYEV et al., 2009).

Figura 1. Organização genômica do TTV apresentando as localizações correspondentes à ORF1 (azul, 589-2901); ORF2 (vermelho, 353- 711) e ORF3 (verde, 2564-3077). Mapa criado com

base na sequência genômica disponível no GenBank sob o código de acesso NC_002076.

3.3HISTÓRICOEIMPORTÂNCIACLÍNICADOTTVEMSERESHUMANOS

Acredita-se que seu nome esteja associado às iniciais (TT) do primeiro paciente investigado pelo grupo de pesquisadores, embora essas iniciais também possam representar uma abreviatura ou acronímia para Transfusion-transmitted

virus (NISHIZAWA et al., 1997; BENDINELLI et al., 2001). O TTV foi detectado

primeiramente pelo pesquisador japonês Nishizawa e seus colaboradores (1997), a partir de amostras biológicas de pacientes com hepatite pós-transfusional de etiologia desconhecida. Posteriormente, foi detectado em diversos países (OKAMOTO et al., 2000b; BASSIT et al., 2002, DEVALLE e NIEL, 2005; DINIZ-MENDEZ et al., 2004).

Inicialmente suspeitou-se que o TTV causava hepatites, mas recentes estudos indicam que este vírus pode não provocar sérios problemas de saúde, pelo fato de a infecção ativa ser altamente prevalente entre indivíduos aparentemente saudáveis, sugerindo que o TTV seja desprovido de potencial patogênico (ABE et al., 1999; WATANABE et al., 2005). Outros estudos, porém, indicam que vários genótipos podem ser responsáveis por provocar doenças em humanos (TAKAHASHI et al., 1998), em especial o genótipo I.

A presença do TTV foi identificada em aproximadamente 50% dos casos de hepatites crônicas ou agudas e 12% de doadores de sangue em estudo realizado no

Japão (OKAMOTO et al., 1998a). Em estudo realizado no Brasil por Bassit et al. (2002), foi observada a presença do TTV em 85,3% dos doadores de sangue e em 81,2% das crianças e adolescentes pesquisados. Outro estudo realizado por Kato et al. (2003) demonstrou alta prevalência do TTV em uma população normal, sugerindo que a infecção persiste na maioria dos indivíduos infectados. Mais recentemente, um estudo realizado na Rússia por Vasilyev et al. (2009), demonstrou altíssima presença deste vírus nesta população, chegando a atingir 94% de positividade para este vírus e não havendo correlação com idade, além disto, este índice mostrou ser superior ao descrito pela literatura (VASILYEY et al., 2009).

Tais resultados, além de um grande número de relatos da detecção do vírus em indivíduos saudáveis e da ausência de um modelo experimental adequado para a infecção, não permitem confirmar a participação do TTV como agente etiológico de alguma doença específica em humanos, uma vez que o TTV é um vírus presente em mais de 80% da população em todo o mundo (PRESCOTT e SIMMONDS, 1998; HUANG et al., 2001).

O TTV causa infecções crônicas e está presente no plasma sendo capaz de infectar muitos tecidos do corpo, além de estar presente em tecidos e fluidos corporais de mais de 80% de doadores de sangue saudáveis (POLLICINO et al., 2003) e estudos têm mostrado que o vírus persiste por períodos prolongados ou indefinidamente no plasma de indivíduos infectados. Além disso, de acordo com o estudo feito por Nasser (2007), o TTV é mais prevalente em indivíduos soropositivos ao HIV em comparação com indivíduos saudáveis. Embora ainda a significância clínica da associação do TTV com HIV necessite ser elucidada, esse estudo sugere que a presença do TTV pode estar relacionada a uma diminuição da carga viral do HIV em indivíduos portadores.

No Brasil, o TTV foi detectado em pacientes com doenças hepáticas crônicas nas Regiões Sudeste e Norte do país (PINHO et al., 1998). Outros estudos têm evidenciado a presença do DNA de TTV em tecidos e fluidos corporais (saliva, urina, fezes e sêmen, pele) e em vários órgãos humanos como fígado, bílis, medula óssea, linfonodo de linfa, músculo, tireóide, glândulas, pulmão, baço, pâncreas, rim, região gástrica, garganta, cérebro e outros (OKAMOTO et al., 2001; MAGGI et al., 2003).

3.4EPIDEMIOLOGIADOTTV

Inicialmente acreditava-se que a principal via de transmissão do TTV fosse a transfusão sanguínea, ou pacientes com elevados riscos de contrair viroses pela via parenteral como hemofílicos, que fazem hemodiálises ou usuários de drogas. Porém a presença de TTV nas fezes de indivíduos saudáveis é ubíqua revelando que a infecção pode estar amplamente disseminada na população humana, denunciando a transmissão também pela via não parenteral (OKAMOTO et al., 1998a) . Assim, o TTV, por ser um vírus não-envelopado e possuir excreção por diferentes vias, incluindo a via fecal, pode ser considerado como um interessante candidato a agente biológico marcador no estudo de contaminação fecal de águas, tal como ocorre com outros microrganismos dotados de disseminação hídrica (FONG e LIPP, 2005). Os tratamentos com virucidas conhecidos e utilizados para inativar vírus envelopados, como solventes-detergentes com aquecimento a seco a 95ºC por 96 horas, demonstram ser pouco efetivos na destruição da estrutura viral de vírus não-envelopados como o Adenovírus , Norovírus e HAV (WATANABE et al., 2005).

No que tange à infecção pelo TTV em outras espécies animais, existe também muito ainda por esclarecer. Embora estudos complementares sejam necessários para uma melhor compreensão deste agente, pesquisas moleculares em outros hospedeiros apontam que 60 – 80% da população suína apresenta o TTV em amostras de soro. Sendo a epidemiologia do TTV pouco compreendida, suspeita-se que a rota fecal-oral represente uma importante via de transmissão deste vírus também em suínos. Entretanto, estudos têm demonstrado uma baixa prevalência do TTV em bovinos, o que poderia ser explicado pela replicação viral em baixos títulos nesses animais e pela elevada variabilidade das amostras virais que afetaria os limiares de detecção por métodos moleculares. Assim, futuras pesquisas devem determinar a prevalência do TTV na espécie bovina e elucidar os fatores que afetam as diferenças na prevalência TTV em suínos e bovinos (BRASSARD et al., 2008). Há relatos também de infecção do TTV em chimpanzés e macacos rhesus (OKAMOTO et al., 1998a; MUSHAHWAR et al., 1999). Porém pouco se sabe a respeito de infecção em mamíferos menores, devido a grande dificuldade de se obter replicação deste vírus em cultura de tecidos (MAGGI et al., 2001)

3.5DETECÇÃOMOLECULARDEVÍRUSEMAMOSTRASAMBIENTAIS

Inicialmente, para a pesquisa de vírus em ambientes aquáticos utilizava-se grande volume de água, chegando a serem usados em torno de 500 litros em cada amostra submetida à detecção viral (HARAMOTO et al., 2004). Outros estudos sugerem como recomendável o uso de 10 litros de água como amostra, com a coleta em um processo de concentração das amostras por filtros e eluição, centrifugação ou outras metodologias com o fim de concentrar as escassas partículas virais presentes (HARAMOTO et al., 2005b). Estudos recentes têm mostrado que a quantidade de amostra inicial pode ser significativamente reduzida comparativamente a estudos anteriores, chegando em alguns deles a 500 ml, como descreveram Haramato et al. (2005b) e Albinana-Gimenez et al. (2009). Este último estudo mostrou que quantidades menores de amostra facilitam a detecção viral por métodos moleculares, tendo sido comparados volumes de amostra de 40 mL, 1 litro, 10 litros e 50 litros. O estudo mostrou que amostras de 10 litros e 50 litros apresentaram a menor taxa de detecção viral e uma alta inibição na reação em cadeia da polimerase (PCR), dada a provável concentração de inibidores da reação no processo, obtendo-se limites de detecção de 2,5 × 101 GC / L para 50 L e 1,25 × 102 GC/L para 1 e 10 L. Encontrou-se, dessa forma, uma maior sensibilidade analítica na detecção em amostras da ordem de 1 e 10L. Além disso, diversos volumes de amostra de água de rio com alta turbidez e significativa contaminação fecal foram comparados e o volume de 1L foi o que apresentou a maior taxa de detecção viral (ALBINANA-GIMENEZ et al., 2009).

O TTV é transmitido pela via fecal-oral e pode ser detectado por meio de ensaios moleculares que possuem características de sensibilidade e rapidez como, por exemplo, a PCR (GRIFFIN et al., 2008), que nos últimos anos tem sido utilizada para detecção de vírus em amostras ambientais (KATAYAMA et al., 2002; LEY et al., 2002). O desenho de oligonucleotídeos para detecção de TTV muitas vezes está voltado para a amplificação de sequências de uma região codificante, com sucesso para detectar TTV do grupo 1, ao passo que para detectar TTV de todos os grupos conhecidos normalmente têm sido utilizados iniciadores baseados em uma região não codificante (OKAMOTO et al., 1998a; 2000c). Além disso, regiões conservadas do genoma viral podem constituir alvos capazes de permitir a detecção de um

número maior de amostras de TTV, mesmo de genogrupos não conhecidos (DEVALLE e NIEL, 2004).

O uso da PCR é de grande importância na detecção de contaminação por vírus em amostras ambientais, principalmente pelo fato de que muitas vezes os agentes virais estão extremamente diluídos nas amostras de água, necessitando, portanto, de uma técnica de elevada sensibilidade para sua detecção (VAIDYA et al., 2002). Essa metodologia ainda tem o benefício adicional da determinação de sequências específicas do material genético detectado, auxiliando na caracterização dos agentes encontrados por filogenia molecular. A principal desvantagem é que a PCR ou outros métodos de detecção molecular não permitem distinguir partículas virais viáveis de partículas não infecciosas na amostra em teste, o que só é possível complementando os ensaios com cultivos celulares (TAVARES et al., 2005).

No caso específico da detecção de TTV em amostras de água, vários estudos têm revelado o aspecto promissor deste agente, quando analisado ao lado de outros agentes virais, como marcador de poluição fecal (GRIFFIN et al., 2008). Mesmo no Brasil, outros grupos de pesquisa já obtiveram resultados de extrema relevância sobre a relação entre TTV e poluição fecal. O relato mais recente no país refere-se à cidade de Manaus (DINIZ-MENDEZ et al., 2008), em estudo no qual foi utilizada a coleta de amostras de 2 litros de água de vários pontos na bacia de cursos d'água que atravessam a cidade. Estas amostras foram submetidas a concentração viral de acordo com a metodologia descrita anteriormente (KATAYAMA et al., 2002) com algumas modificações, extração de material genômico viral conforme métodos usuais e detecção por metodologia molecular por reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real (qPCR) comparada à PCR convencional. Os pesquisadores observaram a presença de TTV em 92% das amostras de água analisadas e processadas por qPCR. Na mesma pesquisa também foram analisadas as amostras seguindo a metodologia por PCR convencional, na qual o resultado positivo para o TTV foi de 36,5%.

3.6TTVCOMOMARCADORDEPOLUIÇÃOAMBIENTAL

A frequência do TTV no sangue da população humana e a transmissão pela via fecal-oral podem explicar sua ocorrência em todo o mundo (PRESCOTT e

SIMMONDS, 1998). No atual sistema de abastecimento e monitoramento da qualidade e potabilidade da água, somente os coliformes totais e Escherichia coli são parâmetros indicadores de contaminação fecal. Sabe-se que estes indicadores bacterianos não asseguram total proteção à saúde pública, visto que muitas doenças de origem viral podem ser oriundas de águas nas quais a ausência de bactérias tenha sido detectada, além de se observar que após o tratamento da água ainda se observa a presença do TTV e de outros vírus (GRIFFIN et al., 2008). Além disso, estudos mostram ausência de relação entre TTV e sazonalidade, representando desta forma um fator positivo no sentido deste vírus ser um indicador de contaminação ambiental (DINIZ-MENDEZ et al., 2008), além de relatos de alta frequência de TTV em águas antes e após tratamento. No Japão, o TTV foi detectado em 97% das amostras de esgoto, sendo 18% antes da cloração e 24% após a cloração, o que indica que o vírus estava amplamente disseminado na população japonesa durante um ano de estudo (HARAMOTO et al., 2005a). Tais dados podem ser comparados com o estudo realizado por Vaidya et al. (2002), na Índia, no qual observou-se a presença de 14,5% e 2% de amostras positivas para o TTV, respectivamente antes e após tratamento, o que significa prevalência muito mais baixa. No Brasil, diferentemente ao estudo da realizado na Índia, Diniz-Mendes et al. (2008) demonstrou elevada ocorrência (92%) do TTV em amostras em um córrego que atravessa a cidade de Manaus, mostrando que o vírus pode ser um indicador de contaminação viral humana em águas.

Embora haja grande divergência de opiniões de virologistas e ambientalistas a respeito da efetividade deste vírus como marcador de contaminação ambiental, há que se valorizar que este vírus pode ser considerado um indicador promissor em relação aos tradicionais indicadores bacterianos e mesmo alguns outros vírus entéricos, visto que sua transmissão ocorre por via fecal-oral e por apresentar algumas características distintas dos demais vírus (GRIFFIN et al., 2008). Formado por DNA de fita simples e circular, não apresenta envelope em sua estrutura (NISHIZAWA et al., 1997; MIYATA et al., 1999), que lhe confere de certa forma certa resistência. Isolados de TTV apresentam grande diversidade tendo em torno de 47% – 70% de variação em seus aminoácidos (BIAGINI et al., 1999) e divergência no genoma, apresentando regiões hiper variáveis na região traduzida (NISHIZAWA et al., 1999) e regiões não traduzida apresentam sequências mais conservadas do

genoma (OKAMOTO et al., 1998b; LEARY et al., 1999). Embora, pouco se sabe sobre a estabilidade ambiental deste vírus, Takayama et al. (1999) mostraram a presença de infecciosidade do TTV após 95 horas de tratamento a seco, desta forma acredita-se que este vírus possua características de resistência a estresse ambiental (VERANI et al., 2006).

3.7SISTEMASDETRATAMENTODEESGOTOEÁGUAPARACONSUMO

No Brasil, o atual sistema de tratamento de água para o consumo humano segue as já citadas normativas determinadas pela portaria 518, de 25 de março de 2004 (BRASIL, 2004), na qual estabelece os procedimentos e responsabilidades relativos ao controle e vigilância da qualidade da água para consumo humano e seu padrão de potabilidade. Sendo assim, este segmento define água potável como sendo a que não oferece risco à saúde da população e cujos parâmetros físicos, químicos, radiológicos e microbiológicos atendam aos padrões de potabilidade. Em se tratando de parâmetros microbiológicos, atualmente, as bactérias do grupo coliformes (coliformes totais) e a Escherichia coli (coliformes termotolerantes), esta última exclusivamente de origem fecal, são consideradas o mais específico indicador de contaminação fecal recente e de eventual presença de organismos patogênicos. Desta forma, a presença destas bactérias tem sido considerada como sendo o parâmetro microbiológico indicador de contaminação fecal na água. Portanto, é considerada hoje, água potável para consumo humano aquela cujos padrões microbiológicos revelem ausência dos microrganismos E. coli e coliformes totais em 100 mL de água, mas esses valores podem ter sua tolerância aumentada conforme a demanda populacional atendida.

Para o tratamento de efluentes, a resolução do CONSEMA 128 de 2006 (RIO GRANDE DO SUL, 2006) define sobre os padrões de emissão dos efluentes líquidos, os quais são lançados em águas superficias. Para tal evento, é necessário que o esgoto sanitário gerado pela população seja tratado antes de ser despejado em rios ou corpo receptor. Para isso, é imprescindível que o efluente gerado seja tratado em estações de tratamento, as quais são compostas por um conjunto de instalações e processos que tem por finalidade a redução do material contaminante em águas. A resolução do Conama 357/2005, dispõe sobre a classificação dos

corpos de água e estabelece padrões de lançamentos de efluentes. Esta normativa classifica os corpos receptores de águas doces em: classe especial: cujas águas são destinadas ao consumo humano com desinfecção; classe I: águas destinadas ao abastecimento humano após tratamento simplificado e que apresentam valores máximos de 200 coliformes termotolerantes em 100 mL de água; classe II: destinadas ao abastecimento humano após tratamento convencional e que não exceda a 1.000 coliformes termotoletantes em 100 mL de água; classe III: águas doces destinadas ao abastecimento para consumo após tratamento convencional ou avançado, que apresentem no máximo 4.000 coliformes termotoletantes em 100 mL de água em 80% das amostras; classe IV: águas destinadas a navegação e paisagística (BRASIL, 2005a).

As estações de tratamento de águas residuais de esgoto, conhecidas como Estação de Tratamento de Esgoto (ETE), adotam diferentes métodos de tratamento que tem por finalidade reduzir ou minimizar a poluição dos esgotos. Existem vários processos de tratamento de esgoto que são utilizados no mundo inteiro. Neste trabalho enfatizam-se os tratamentos por lagoas de estabilização e por lodos ativados, os quais são freqüentemente utilizados (FERREIRA, 2006). Muitas estações fazem uso do tratamento de esgoto por lagoas de estabilização, consideradas a forma mais simples de tratamento de esgoto. Compostas basicamente por lagoas anaeróbias, facultativas e de maturação, consistem no tratamento biológico onde o esgoto é tratado através da decomposição da matéria orgânica pelas bactérias. Este processo é realizado em várias etapas, como tratamento primário, secundário e terciário. Inicialmente as etapas são de tratamento físico com a finalidade de remover os sólidos suspensos no esgoto, seguidas das etapas de tratamento biológico que objetivam a redução da matéria orgânica, demanda bioquímica de oxigênio (DBO), demanda química de oxigênio (DQO) e nutrientes como fósforos e nitrogênios muito presentes no esgoto. Na sequência outros tratamentos destinados à remoção biológica de poluentes tóxicos são inseridos, além de tratamento para remoção de organismos patogênicos (VON SPERLING, 2002).

O sistema de tratamento de efluentes líquidos por lodos ativados, amplamente utilizado em todo mundo, é caracterizado pela alta eficiência na remoção da matéria orgânica, além de estar associado a uma pequena área de

implantação, quando comparado a outros sistemas de tratamento (BENTO et al., 2005). O tratamento por lodo ativado convencional é formado por um reator biológico aerado artificialmente e um sedimentador. O processo opera na depuração biológica, exclusivamente por via aeróbia, onde os compostos orgânicos e inorgânicos presentes na água residuária são degradados por uma população microbiana diversificada como muitas espécies de bactérias, protozoários e fungos que são mantidos em suspensão num ambiente na presença de oxigênio (VON SPERING, 1997; CLAAS, 2007). As próprias bactérias são as principais responsáveis pela depuração da matéria carbonácea e pela estruturação dos flocos. A participação da microfauna (protozoários e micro-metazoários) também favorecem a manutenção da comunidade bacteriana equilibrada, a remoção de E. coli, a redução da DBO e a floculação. Por serem extremamente sensíveis às alterações no processo, os componentes da microfauna alternam-se no sistema em resposta às mudanças nas condições físico-químicas e ambientais. Desse modo, a composição da micro fauna do lodo ativado revela tendências do processo, quanto a eficiência da remoção da DBO, DQO e na eficiência da remoção de sólidos suspensos (SS) (SALVADO et al., 1995; HOFFMANN et al., 2001).

Embora no Brasil ainda não se disponham de sistemas de tratamento aplicáveis à desinfecção de agentes virais em água destinada para o consumo ou para efluentes de esgotos, muitos países utilizam tecnologias nesse sentido. A utilização de tecnologias de desinfecção por ultravioleta (UV) é o tipo de tratamento voltado à desinfecção de vírus mais frequentemente reportado através da exposição de finas lâminas de água a lâmpadas de mercúrio que produzem UV em comprimentos de onda com potencial de inativar a maioria das espécies de vírus presentes na água (STANFIELD; LECHEVALLIER; SNOZZI, 2003). Entretanto, já foi demonstrado que algumas espécies de Adenovírus são muitos resistentes à luz ultravioleta e não são facilmente inativados como os outros agentes virais (WHO, 2004; THOMPSON et al., 2003).

Muitos países adotam esta tecnologia em nível doméstico, pois a luz ultravioleta não tem contra-indicações e seu uso apresenta vantagens, pois não apresenta adição de produtos químicos, e não interfere no sabor e odor, é simples de operar, não necessitando de um profissional altamente qualificado para isto (LAURENT, 2005). Além disto, não há risco de excesso de dosagem como ocorre

com os produtos químicos. A grande maioria dos processos de esterilização por UV é usada para desinfecção de efluentes tratados, onde os microrganismos são destruídos pela ação germicida da luz. A eficácia desta tecnologia para tratamento de efluentes depende da intensidade, tempo de exposição e comprimento de onda da fonte irradiante. Além disto, excesso de turbidez pode inibir o processo de dissolução e comprometer a eficiência do processo. Esse tratamento também apresenta a desvantagem em não apresentar proteção residual contra a recontaminação (LAURENT, 2005).

Em relação ao aspecto ambiental, o sistema de tratamento por UV é uma técnica ambientalmente sustentável e amplamente difundida, pois seu efeito nocivo se restringe aos microrganismos presentes na água, não gerando desta forma subprodutos nos corpos hídricos (BILOTTA e DANIEL, 2006). Ainda há que ressaltar a crescente preocupação com o uso de cloro e os efeitos de compostos clorados formados no processo de sobra à saúde humana (LAZAROVA et al., 1999).

Em se tratando do processo de cloração, que é desinfecção de microrganismos pela ação do cloro, esta etapa tem sua tem importância principalmente para inativar algumas bactérias intestinais gram-negativas pertencentes ao grupo de coliformes. No entanto, esta prática é insuficiente para inativar agentes virais como Enterovírus, Adenovírus, Norovírus e vírus da Hepatite A que tem resistência variada à inativação por cloro (THERON e CLOETE, 2002).

Outro tratamento terciário recomendado para inativar vírus em água é o processo de ozonização. A desinfecção pela utilização da molécula de ozônio, fortemente oxidante e desinfetante, é pouco utilizada nos tratamentos de esgoto no Brasil (SOUZA e DANIEL, 2008), mas tem sido considerado um excelente desinfetante usado para inativar patógenos em água, principalmente em países europeus. Muito embora o método por ozonização tenha demonstrado ser menos efetivo que a desinfecção pela UV (FACINE et al., 2000), o ozônio apresenta capacidade em remover substancias responsáveis pela cor, gosto e odor. Além disso, elimina microrganismos resistentes a outros métodos de desinfecção, age inativando bactérias, protozoários e vírus (BILOTTA E DANIEL, 2006). Após anos de uso, a eficiência deste mecanismo na inativação de todos os agentes ainda é pouco compreendida, visto que algumas bactérias são mais sensíveis ao ozônio e geralmente os vírus entéricos apresentam maior resistência do que fagos e bactérias

ao tratamento (STANFIELD; LECHEVALLIER; SNOZZI, 2003). Estudo experimental mostrou que vírus em águas residuárias foram totalmente inativados por tratamento através de ozônio (XU et al., 2002). O ozônio também não possui estabilidade residual e frequentemente é adicionada uma etapa de cloração para a proteção residual das águas (STANFIELD; LECHEVALLIER; SNOZZI, 2003).

4.METODOLOGIA

4.1AMOSTRASDEÁGUAUTILIZADASEPROCEDIMENTODECOLETA

As amostras originaram-se de diferentes locais de Porto Alegre e de cidades do interior do estado. Procedeu-se a coleta de amostras de estudo seguindo protocolo da Companhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental (CETESB, 1987) com algumas modificações. Desta forma, frascos de 500 mL previamente esterilizados por autoclavagem foram utilizados para a coleta de amostras de campo. As amostras foram coletadas nas estações de tratamento (ETE’s) do Departamento Municipal de água e esgoto (DMAE) especificamente da ETE São João – Porto Alegre e amostragens de diferentes pontos do Arroio Dilúvio localizado em Porto Alegre, água mineral de bombonas e água tratada obtida da torneira da cozinha de Escolas municipais e estaduais do interior do estado. Para a correta coleta e acondicionamento das amostras, as mesmas foram coletadas em frascos de vidro de 500 mL estéreis (autoclavados) e livres de partículas grandes, detritos ou folhas. Alem disto para minimizar a contaminação, a coleta foi realizada com a boca do frasco voltado contra a corrente de água, tomando o máximo de cuidado para não tocar na parte interna do frasco. Os coletores foram orientados a manterem as mãos higienizadas, adicionalmente usar luvas no procedimento e não deixar as amostras expostas à fumaça, pó ou outras impurezas. Após a coleta, as amostras foram identificadas, registrando a localização do ponto, data e tipo de amostragem. Imediatamente após a coleta, as amostras foram colocadas ao abrigo de luz solar e mantidas em temperatura entre 2ºC e 8°C (em isopor com gelo) até o transporte ao Laboratório de Biologia Molecular do Centro Universitário Feevale, onde as quais foram mantidas sob refrigeração a 4ºC até o processamento.

4.1.1 Amostras de Estação de Tratamento de esgoto - DMAE

O DMAE é o departamento Municipal de água e esgoto responsável pela coleta e tratamento do esgoto sanitário cloacal na cidade, além disto, é responsável pela captação, tratamento e distribuição de água em Porto Alegre (http://www.portoalegre.rs.gov.br/dmae/). A estação realiza o tratamento do esgoto

cloacal de onze bairros da cidade e tem capacidade para tratar 444 litros de esgoto por segundo, beneficiando assim uma população de aproximadamente 150 mil habitantes da zona norte da capital (fig. 2). Para o presente estudo, amostras de esgoto originalmente coletadas por profissionais do DMAE foram concedidas através do processo de parceria de pesquisa nº 003.005689.08.2, o qual foi previamente avaliado e autorizado por este órgão. Desta forma, amostras mensais de dois pontos, afluente (aflu- esgoto bruto) e efluente (eflu - esgoto tratado) foram coletadas no período de março a outubro de 2009 na estação de tratamento ETE São João – Navegantes - DMAE, Porto Alegre (fig. 3). A coleta baseou-se em métodos já descritos anteriormente, com o adicional que para a coleta destas amostras utilizou-se um recipiente apropriado para este fim, o qual é inicialmente lavado com a própria água do sistema e depois é emergido no tanque para a retirada da amostra. Esta estação de tratamento tem por característica o tratamento do esgoto pelo método de lodos ativados, tratamento que é amplamente utilizado no mundo todo, pelo fato de apresentar alta eficiência associada à pequena área de implantação quando comparados a demais sistemas de tratamento. Neste tratamento o esgoto é inicialmente pré tratado e depois é direcionado para os tanques de aeração (fig. 3). Neste processo o oxigênio é introduzido artificialmente ao esgoto, acelerando a decomposição natural do material orgânico, que é degradado pelas bactérias que removem 99% da matéria orgânica, melhorando a qualidade da água que é liberada para o rio Guaíba. A ETE São João - Navegantes passou a operar neste sistema desde 2001, quando o DMAE adaptou o sistema baseado em modelos tecnológicos

aprovados em países europeus

Figura 2. Mapa da localização da ETE São João – Navegantes, mostrando a grande quantidade de bairros que a circunda. (Fonte: DMAE).

Figura 3. Vista aérea da estação de tratamento de esgoto ETE São João – Navegantes, identificando os locais das coletas das amostras, 1: afluente (esgoto bruto) e 2: efluente (esgoto tratado). 3: tanques de aeração. (http://www2.portoalegre.rs.gov.br/dmae/default. php).

ETE

2

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4.1.2 Amostras do Arroio Dilúvio – Porto Alegre

O Arroio Dilúvio, localizado em Porto Alegre, percorre uma distância de 13,8 Km, atravessando a capital no sentido leste-oeste. Este arroio tem sua nascente no Município de Viamão e, junto com demais arroios de pequeno porte, forma já em Porto Alegre, a Barragem Lomba do Sabão. Este arroio tinha por finalidade original o escoamento de seus afluentes e a coleta de águas pluviais. Porém, como ele atravessa bairros de elevada taxa de ocupação, tem assumido um papel importante no saneamento da região, onde então recebe águas de escoamento natural e também efluentes cloacais de uma importante parcela da população que ocupa sua área de drenagem, além da presença de vários estabelecimentos de saúde e hospitais de grande porte que lançam seus efluentes. As cargas cloacais e pluviais lançadas ao longo do Arroio constituem um aspecto negativo do ponto de vista de Saúde pública, pois o mesmo lança diretamente ao Guaíba suas águas de péssima qualidade sanitária (FARIA; NEUVALD; ALVES, 1994). Para o presente estudo realizaram-se três coletas com periodicidade trimestral nos meses de janeiro a setembro de 2009 nos 5 pontos distribuídos no percurso do arroio, O ponto 1 situa-se na nascente do arroio, na represa Lomba do Sabão, e os demais pontos 2, 3, 4 e 5 estão localizados na Avenida Ipiranga esquina com as Ruas Antonio de Carvalho, Guilherme Alves, Ramiro Barcelos e Borges de Medeiros, respectivamente. O último ponto está situado no local em que o arroio deságua no Guaíba (Fig. 4), neste ponto tomou-se o máximo de cuidado para não coletar muito próximo da margem com o Guaíba, para evitar interferências na composição das águas do arroio. Coletou-se amostras de água da superfície do arroio até 50 cm de profundidade, as amostras foram coletas com auxílio de um recipiente apropriado e imediatamente acondicionadas nos frascos de coleta e mantidas em refrigeração até sua chegada no laboratório. Para a correta coleta e acondicionamento das amostras, os procedimentos seguiram as normas previamente determinadas (CETESB, 1987), com alguns procedimentos assépticos citados anteriormente. Estas amostras foram obtidas por colaboração com docentes do Instituto de Ciências Básicas da Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Sul.

Figura 4. Localização aproximada dos pontos 1, 2, 3, 4 e 5 do Arroio Dilúvio em Porto Alegre, mostrando local das coletas. (Mapa cedido por Gisele Nachtigall Garbinatto).

4.1.3 Amostras de água de escolas Municipais e Estaduais

Amostras de água de escolas Municipais e Estaduais foram coletadas em garrafas plásticas de 500 mL, gentilmente cedidas pela Profa. Ana Beatriz Oliveira (Centro Colaborador em Alimentação e Nutrição Escolar do Sul, CECANE – SUL – UFRGS). Estas amostras são oriundas das cidades de Santa Cruz do Sul, Pelotas e Caxias do Sul, e foram coletadas de torneiras da cozinha destas escolas. O estado do Rio Grande do Sul é constituído por 7 mesorregiões, cada mesorregião é composta por diferentes microrregiões geográficas. As cidades de Pelotas, Santa Cruz do Sul e Caxias do Sul estão entre as cidades mais populosas do estado e estão representando a microrregião de Pelotas, Santa Cruz do Sul e Caxias do Sul (fig.5). Estas microrregiões estão inseridas nas mesorregiões chamadas de Sudeste Rio-grandense, Centro Oriental Rio-grandense e Nordeste Rio-Rio-grandense, respectivamente. As microrregiões de Santa Cruz do Sul e Caxias do Sul estão

localizadas na bacia hidrográfica do Guaíba; Pelotas está inserida na bacia hidrográfica Litorânea (FEE - FUNDAÇÃO DE ECONOMIA E ESTATÍSTICA - RS, 2009, http://mapas.fee.tche.br/). O Serviço Autônomo Municipal de Água e Esgoto (SAMAE) é uma autarquia vinculada à Prefeitura de Caxias do Sul e é responsável pela captação, tratamento e distribuição de água à população. A água nesta cidade é tratada seguindo as etapas de floculação, decantação, filtração e por último a desinfecção e fluoretação (http://www.samaecaxias.com.br/site/default.asp). Para a cidade de Pelotas, a captação, o tratamento e a distribuição da água são realizados pelo Serviço Autônomo de Saneamento de Pelotas (Sanep). Esta instituição realiza o tratamento da água pelos processos de coagulação e floculação, decantação, filtração, e por último a desinfecção, fluoretação e neutralização do pH, esta última etapa é realizada no reservatório da estação de tratamento de água (http://www.pelotas.com.br/sanep/sanep/sanep.htm#). A cidade de Santa Cruz do Sul realiza o tratamento da água através de serviços prestados pela Secretaria Municipal de Meio Ambiente e Saneamento (SEMMAS) que incentivam a população a realizar também a limpeza das caixas d’água. O tratamento das águas atende as exigências dos padrões de potabilidade determinados pela portaria 518/2004 (http://www.pmscs.rs.gov.br/index.php?acao=noticias&noticias_id=4099).De maneira semelhante às outras coletas, os cuidados de assepsia e armazenamento se fizeram presentes no momento das coletas. Coletaram-se 34 amostras no período de julho a setembro de 2009. Destas, 19 amostras são procedentes de Caxias do Sul, 8 de Pelotas e 7 amostras da cidade de Santa Cruz do Sul. Assim, 23 amostras oriundas de escolas municipais e 11 de escolas estaduais foram utilizadas para o estudo. Estas amostras foram obtidas por colaboração com docentes do Instituto de Ciências Básicas da Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Sul.

Figura 5. Mapa do Rio Grande do Sul e suas microrregiões. Em destaque as três microrregiões utilizadas no estudo, número 16: Caxias do Sul; 20: Santa Cruz do Sul e 33: Pelotas. (Mapa

modificado, disponível em: http://mapas.fee.tche.br/wp-content/uploads/2009/08/microrregioes_rs_2009.png).

4.1.4 Amostras de água mineral

Amostras de água mineral de 200 mL provenientes de bombonas de 20 L comercialmente disponíveis foram coletadas. A metodologia da coleta também seguiu os cuidados de higiene e assepsia descritos anteriormente, tendo o máximo de atenção em manter os exemplares livres de quaisquer impurezas disponíveis no ambiente. Neste trabalho, 7 amostras de diferentes marcas comerciais foram utilizadas para análise. Estas amostras foram obtidas por colaboração com docentes do Instituto de Ciências Básicas da Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Sul.