Queijo barra sem tratamento antifúngico

O queijo barra produzido na fábrica da Ribeira Grande (Açores) também foi objeto de estudo deste projeto. A eliminação do tratamento antifúngico foi estudada no queijo Terra Nostra e no queijo de marca branca. Em ambos os casos o acompanhamento microbiológico foi efetuado a partir da etapa de fatiamento, uma vez que o queijo barra é produzido nos Açores e fatiado na fábrica de Vale de Cambra. Desta forma, os resultados experimentais consistem nos resultados das análises microbiológicas ao longo do período em embalagem em atmosfera modificada. As análises microbiológicas englobam a análise a bolores e leveduras, no entanto em todos as análises efetuadas foram observadas quantidades nulas ou residuais de bolores no queijo, como se verificou também no queijo bola sem tratamento antifúngico. Assim, todos os resultados de análises microbiológicas apresentados nesta secção do relatório (ufc/g) correspondem a contagens de leveduras. A avaliação sensorial foi efetuada apenas no queijo Terra Nostra.

4.2.1 Desenvolvimento de leveduras em embalagem em atmosfera modificada

Após o fatiamento do queijo barra sem natamicina, este é imediatamente embalado em atmosfera modificada. A composição da mistura de gases aplicada no processo é igual à utilizada na embalagem do queijo Limiano fatiado, ou seja, 20±4% de CO2,

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concentrações de O2 inferiores a 0,4% e a percentagem restante é preenchida com N2.

Na Figura 15 encontra-se o perfil da população de leveduras ao longo do armazenamento em embalagem ATM para o queijo TN.

Figura 15 – População de leveduras (ufc/g) ao longo do período em embalagem em atmosfera modificada no queijo

Terra Nostra sem tratamento antifúngico (Ensaio) e com tratamento antifúngico (Referência).

Os resultados representados na Figura 15 correspondem aos valores médios dos resultados microbiológicos obtidos nos testes industriais de TN sem tratamento antifúngico. É importante referir que para o queijo TN foram apenas efetuados quatro testes industriais no âmbito deste projeto, enquanto que para o Limiano sem tratamento antifúngico foram realizadas catorze produções. Desta forma, os resultados obtidos ainda não permitem conclusões claras para a validação industrial do TN sem tratamento antifúngico, devido à realização de poucos testes industriais. O acompanhamento microbiológico das produções de 06.03.14, 27.03.14, 16.04.14 e 22.05.14 de TN sem tratamento antifúngico encontram-se no Anexo VIII.

Analisando a Figura 15, verificou-se um decréscimo na população de leveduras ao longo do período em embalagem ATM no queijo TN sem tratamento antifúngico, tal como o verificado no queijo Limiano (Figura 11). No entanto, verificou-se um ligeiro aumento na população de leveduras entre o 2º e 3º mês em embalagem ATM.

No fatiamento do queijo TN observou-se uma quantidade média de leveduras de 1881 ufc/g, tendo em conta os resultados obtidos em todas as produções de TN sem tratamento antifúngico. Num total de oito amostras analisadas na etapa de fatiamento, observaram-se contagens inferiores a 102 ufc/g em 50% das amostras, em 13% verificaram-se populações de leveduras entre 102-103 ufc/g e 37% das amostras

1881 346 44 75 81 0 0 0 0 400 800 1200 1600 2000

Fatiamento 1 mês ATM 2 meses ATM 3 meses ATM

ufc/g

Ensaio Referência

79

revelaram contagens entre 103-104 ufc/g. Através do teste ANOVA concluiu-se que existem diferenças estatisticamente significativas entres os resultados microbiológicos obtidos nas várias produções de TN sem natamicina para a etapa de fatiamento.

Após um mês em embalagem em atmosfera modificada observou-se uma população média de leveduras de 346 ufc/g, verificando-se uma redução de cerca de 66% na quantidade de leveduras presente no queijo em relação à etapa de fatiamento. Num total de nove amostras de queijo analisadas verificou-se que em 45% das amostras a população de leveduras foi inferior a 102 ufc/g, em 44% das amostras observaram-se contagens entre 102-103 ufc/g e apenas 11% revelaram quantidades de leveduras superiores a 103 ufc/g. Depois de dois meses de armazenamento em embalagem ATM foi observada uma população de leveduras no queijo fatiado de 44 ufc/g, correspondendo a uma diminuição na quantidade de leveduras de 87% em relação à população de leveduras observada no 1º mês em embalagem ATM. Após o 2º mês em embalagem ATM foram analisadas nove amostras de queijo, sendo que em 78% das amostras não foram detetadas leveduras e 22% revelaram contagens entre 102-103 ufc/g. No fim do prazo de validade, ou seja, após um período de três meses em embalagem ATM observou-se uma quantidade de leveduras de 75 ufc/g.

Os resultados do teste ANOVA para os resultados microbiológicos após um, dois e três meses em embalagem ATM revelaram que não existem diferenças estatísticas significativas entre os resultados obtidos nas várias produções de TN sem tratamento antifúngico nas três fases referidas.

No acompanhamento microbiológico do queijo TN sem tratamento antifúngico foram efetuadas análises microbiológicas também ao queijo referência (com tratamento antifúngico). Como previsto, verificou-se que a referência apresentou uma população de leveduras inferior ao ensaio em todas as etapas do acompanhamento microbiológico, devido à presença de natamicina (Figura 15). Os mesmos resultados foram observados no queijo bola sem tratamento antifúngico (Figura 11).

Através dos resultados observados na Figura 15, constatou-se o efeito inibitório da mistura de gases aplicada na embalagem ATM no desenvolvimento de leveduras no queijo TN sem tratamento antifúngico. Estes resultados vão de encontro ao observado no queijo bola sem tratamento antifúngico (Figura 11 e Tabela 7).

Na Figura 16 encontra-se o perfil da população de leveduras ao longo do período em embalagem ATM para o queijo de marca branca (MB) sem tratamento antifúngico.

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Figura 16 - População de leveduras (ufc/g) ao longo do período em embalagem em atmosfera modificada no queijo

de marca branca sem tratamento antifúngico (Ensaio) e com tratamento antifúngico (Referência).

Os resultados da Figura 16 representam os valores médios dos resultados obtidos nos vários testes industriais de queijo de marca branca sem tratamento antifúngico. No total foram realizadas nove produções e os perfis da população de leveduras observados em cada produção encontram-se representados no Anexo IX.

O comportamento do desenvolvimento de leveduras do queijo de MB sem tratamento antifúngico não vai de encontro aos resultados previstos ou aos resultados observados nos queijos Limiano e TN sem tratamento antifúngico (Figuras 11 e 15, respetivamente). Na etapa de fatiamento foi observada uma população média de leveduras de 2,19E+04 ufc/g, sendo que no total de dezoito amostras analisadas 50% revelaram contagens superiores a 103 ufc/g. Através do teste ANOVA concluiu-se que não existem diferenças estatísticas significativas entre os valores observados nas várias produções de queijo de MB sem tratamento antifúngico na etapa de fatiamento. Após um mês em embalagem ATM a população média de leveduras presente no queijo era 4,29E+05 ufc/g, verificando-se, contrariamente ao previsto, um aumento na quantidade de leveduras em relação à etapa de fatiamento. Cerca de 28% das amostras analisadas nesta fase do acompanhamento microbiológico apresentaram contagens de leveduras superiores a 105 ufc/g. Através do teste ANOVA verificou-se a igualdade estatística entre os resultados obtidos após um mês em embalagem ATM nos testes industriais realizados. Após dois meses em embalagem ATM verificou-se um novo aumento na população de leveduras (1,37E+06 ufc/g), correspondendo à contagem de leveduras mais elevada do acompanhamento microbiológico. Num total de doze amostras analisadas observaram-se quantidades de leveduras superiores a 104 ufc/g em 67% das

2,19E+04 4,29E+05 1,37E+06 9,21E+04 1156 44 142 1,00E+00 1,00E+02 1,00E+04 1,00E+06 1,00E+08

Fatiamento 1 mês ATM 2 meses ATM 3 meses ATM

ufc/g

Ensaio Referência

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amostras. O teste ANOVA indicou a igualdade estatística entre os resultados obtidos no 2º mês em embalagem ATM nas várias produções de queijo de marca branca sem tratamento antifúngico. No 3º mês de embalagem ATM observou-se uma população de leveduras de 9,21E+04 ufc/g presente no queijo, verificando-se uma diminuição em relação às etapas anteriores. Para esta fase do acompanhamento microbiológico também foi verificada a igualdade estatística entre os resultados obtidos nas várias produções. A ocorrência de populações de leveduras entre 104-107 ufc/g em queijo embalado sob atmosfera modificada não era prevista. Apesar da mistura de gases utilizada ser igual à aplicada no processo de embalagem ATM do queijo TN e Limiano, neste caso não se observou um efeito inibitório no desenvolvimento de leveduras, pelo contrário verificou-se um aumento na população de leveduras após o 1º mês em embalagem ATM de 19% em relação à etapa de fatiamento. É importante referir que a população de leveduras presente na etapa de fatiamento no queijo de marca branca (2,19E+04 ufc/g) encontra-se na mesma ordem de grandeza da verificada no queijo Limiano (1,06E+04 ufc/g), o que significa que o processo de embalagem ATM utilizado neste projeto já demonstrou um efeito inibitório no crescimento de leveduras em populações iniciais elevadas. No entanto, o mesmo não foi observado no queijo de marca branca sem tratamento antifúngico.

Apesar do acompanhamento microbiológico representado na Figura 16 corresponder aos valores médios dos resultados obtidos em todas as produções de queijo de MB sem tratamento antifúngico, é importante referir que o aumento da população de leveduras após o 1º mês em embalagem ATM verificou-se em cinco dos nove testes industriais realizados (Anexo IX). Estes resultados sugerem que o elevado desenvolvimento de leveduras no queijo de marca branca relaciona-se com alguma característica específica deste tipo de queijo, uma vez que este padrão não foi observado nem no queijo Limiano nem no queijo TN sem tratamento antifúngico. As diferenças no processo de fabrico entre o queijo TN e o queijo de marca branca centram-se no fermento lático utilizado e no processo de maturação. No fabrico do queijo TN é utilizado o fermento MO, constituído por microrganismos mesófilos homofermentativos e sem capacidade de produção de CO2, incluindo as espécies de Lactococcus lactis subsp. Lactis e Lactococcus lactis subsp. Cremoris. Na produção de queijo de marca branca é utilizado outro tipo de fermento, designado por A2000, constituído por microrganismos termófilos e mesófilos homofermentativos e sem capacidade de produção de CO2,

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Cremoris e Streptococcus thermophilus. O processo de cura é distinto para estes dois tipos de queijo, sendo que após a saída da salga o queijo TN segue para a cave de cura e tem um período de maturação de três dias. Depois desta fase, o queijo TN em barra é embalado a vácuo, permanecendo nestas condições até à etapa de fatiamento, efetuada na fábrica de Vale Cambra. O processamento do queijo de marca branca é mais simples, uma vez que após a saída da salga o queijo é imediatamente embalado em vácuo, esta técnica é designada por embalamento direto. Desta forma, o queijo de marca branca não tem cura. A causa do crescimento elevado de leveduras no queijo de MB não está ainda esclarecida, uma vez que aparentemente as diferenças no processo de fabrico relativamente ao TN parecem não estão relacionadas com as elevadas populações de leveduras observadas. O estudo desta questão é fundamental para a validação industrial de projeto.

No acompanhamento microbiológico do queijo de marca branca sem tratamento antifúngico foi também analisado o queijo referência, observando-se neste caso um crescimento de leveduras expectável (Figura 16). De facto, o queijo com tratamento antifúngico apresentou uma população de leveduras inferior ao ensaio em todas as etapas do acompanhamento e uma diminuição na quantidade de leveduras ao longo do período em embalagem ATM, tal como o verificado nos queijos TN e Limiano (Figuras 11 e 15).

4.2.2 Análise sensorial

No estudo da eliminação do tratamento antifúngico no queijo barra, a análise sensorial foi efetuada apenas para o queijo Terra Nostra. Foram realizadas duas provas sensoriais, tal como na avaliação sensorial do queijo Limiano. A primeira realizou-se três semanas após o acabamento do produto, estimativa do tempo que o produto demora a chegar ao consumidor, e a segunda degustação foi realizada perto do fim do prazo de validade. Na análise sensorial do queijo TN sem tratamento antifúngico o único método sensorial utilizado foi o teste triangular. Na Tabela 10 encontra-se o calendário de degustações cumprido na análise sensorial do queijo TN sem tratamento antifúngico e os resultados obtidos.

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Tabela 10 – Listagem das degustações de Terra Nostra sem tratamento antifúngico e os resultados obtidos nos testes

triangulares. ND = não há diferenciação

Produção Degustação Resultado Classificação

06.03.14 1ª 17.04.14

Diferenciação (5%)

Diferenças Mínimas Aspeto/Textura/Sabor Preferência: 33% Referência - 67% Ensaio

Figura 17 2ª 16.06.14 ND (5%) -- 27.03.14 1ª 12.06.14 ND (5%) -- 2ª 11.08.14 Diferenciação (5%) Diferenças Nulas Aspeto

Diferenças Mínimas Textura/Sabor Preferência: 50% Ensaio - 50% Referência

Figura 18

22.05.14 1ª 21.07.14 ND (5%) --

Foram realizadas degustações para as produções de TN sem tratamento antifúngico de 06.03.14. 27.03.14 e 22.05.14 (Tabela 10). Nas degustações realizadas três semanas após o fatiamento, verificou-se a existência de diferenças entre as duas fórmulas testadas (ensaio e referência) apenas na produção de 06.03.14. Nesta prova sensorial seis em nova provadores conseguiram identificar corretamente a amostra única, concluindo-se que existe diferença entre o queijo sem e com tratamento antifúngico com um risco de erro de 5%. As diferenças entre as amostras foram classificadas como mínimas no aspeto, textura e sabor. O ensaio obteve melhor classificação na textura e aspeto, no entanto a referência foi melhor pontuada quanto ao sabor (Figura 17). Desta forma, 67% dos provadores consideraram o ensaio a amostra preferida. Por outro lado, nas produções de 27.03.14 e 22.05.14 concluiu-se que não existem diferenças entre o ensaio e a referência com um risco de erro de 5%.

Figura 17- Resultados da classificação (teste triangular) do ensaio e da referência na 1ª degustação da produção de

06.03.14 de TN sem tratamento antifúngico. Escala: 1 – medíocre; 2 – suficiente; 3 – bom; 4 – excelente. As barras de erro representam o desvio-padrão.

1 2 3 4

Aspeto Textura Sabor

C lass if icação Ensaio Referência

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Na segunda degustação, realizada perto do fim do prazo de validade, concluiu-se que existem diferenças ente o ensaio e referência apenas na produção de 27.03.14. Nas produções de TN sem tratamento antifúngico de 06.03.14 e 22.05.14 concluiu-se que não existem diferenças entre as duas fórmulas com um risco de erro de 5%. Na segunda degustação da produção de 27.03.14, seis em oito provadores distinguiram corretamente as amostras, concluindo-se que existem diferenças entre o ensaio e a referência com um risco de erro de 5%. Na perceção dos provadores as diferenças entre as amostras foram classificadas como nulas no aspeto e mínimas na textura e no sabor. O ensaio e a referência obtiveram a mesma classificação no aspeto e textura e a referência obteve melhor pontuação no sabor (Figura 18).

Figura 18 - Resultados da classificação (teste triangular) do ensaio e da referência na 2ª degustação da produção de

27.03.14 de TN sem tratamento antifúngico. Escala: 1 – medíocre; 2 – suficiente; 3 – bom; 4 – excelente. As barras de erro representam o desvio-padrão.

Analisando os resultados das provas sensoriais, verificou-se que a eliminação do tratamento antifúngico no queijo TN não interfere negativamente nas propriedades sensoriais. Na maioria das provas efetuadas, o painel de provadores não foi capaz de distinguir as amostras e quando se verificou a diferenciação entre o ensaio e a referência as diferenças entre as amostras foram classificadas como mínimas ou nulas.

1 2 3 4

Aspeto Textura Sabor

C lass if icação Ensaio Referência

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4.3 IDENTIFICAÇÃO DE MICRORGANISMOS

As leveduras são frequentemente associadas à microflora de vários tipos de queijos. A ocorrência de leveduras neste produto alimentar é comum e expectável devido às suas características fisiológicas que permitem o seu crescimento em condições adversas. De facto, a elevada ocorrência de leveduras em queijos está associada aos requisitos nutricionais destes microrganismos, a determinadas atividades enzimáticas, principalmente às enzimas extracelulares lipolíticas e proteolíticas, e à capacidade de crescimento a baixos valores de pH e temperatura e na presença de elevadas concentrações de sal (Beresford et al., 2001; Juszczyk et al., 2005; Wyder e Puhan, 1999). A maioria das espécies de leveduras cresce numa ampla gama de valores de pH, o que possibilita a colonização de meios onde ocorreu previamente atividade fermentativa por bactérias, como é o caso do queijo (Jacques e Casaregola, 2008). A ocorrência e o crescimento de leveduras em queijos devem-se também à assimilação de ácidos orgânicos como o ácido lático e o ácido cítrico. Deste modo, a capacidade de assimilar ácido lático é uma característica comum nas espécies de leveduras isoladas em produtos lácteos fermentados, sendo que a maioria também é capaz de assimilar ácido cítrico (Ferreira e Viljoen, 2003). Outros fatores para a predominância de determinadas espécies de leveduras são as interações positivas com outros microrganismos presentes no queijo, assim como a sua atividade tóxica e capacidade de resistência (Juszczyk et al., 2005).

Segundo a literatura, as espécies de leveduras mais frequentes em lacticínios são: Debaromyces hansenii, Geotrichum candidum, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Rhodotorula mucilaginosa, Saccharomyces cerevisiae, Torulaspora delbrueckii, Trichosporon beigelii, Yarrowia lipolytica, Candida zeylanoides, Candida catenulata e Candida intermedia (Jacques e Casaregola, 2008; Wyder e Puhan, 1999). Um dos objetivos deste projeto foi a identificação das colónias isoladas durante o acompanhamento microbiológico. Na Tabela 11 encontram-se as espécies de leveduras identificadas ao longo do projeto, assim como as amostras onde ocorreu a identificação.

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Tabela 11 – Espécies identificadas em amostras de queijo sem tratamento antifúngico (Limiano, Terra Nostra e

marca branca) e em superfícies de instrumentos de fabrico

Espécie identificada Amostra

Candida spp. Limiano – Saída da salga (03.12.13)

Candida famata

(= Debaromyces hansenii)

Tapete de entrada da salga Tapete de saída da salga

Limiano – Antes da acidificação (06.02.14) Limiano – Entrada da salga (11.02.14; 18.03.14)

Limiano – Saída da salga (03.12.13; 06.02.14; 18.02.14; 06.03.14) Limiano – Fatiamento (03.12.13)

Candida hellenica Formas de prensagem

Última água de enxaguamento

Limiano – Antes da acidificação (29.04.14)

Candida krusei

(=Issatckenkia orientalis)

Limiano – Entrada na salga (29.04.14)

Candida lusitaniae

(=Clavispora lusitaniae)

Última água de enxaguamento

Limiano – 1 mês em embalagem ATM (13.05.14; 05.06.14) Limiano – 3 meses em embalagem ATM (18.03.14)

TN – 1 mês em embalagem ATM (16.04.14)

Candida parapsilosis Limiano – Entrada na salga (11.02.14)

Cryptococcus spp. Última água de enxaguamento

Limiano – Antes da acidificação (29.04.14) MB – 3 meses em embalagem ATM (05.03.14)

Cryptococcus ater TN – 3 meses em embalagem ATM (16.03.14)

Cryptococcus gastricus Limiano – 3 meses em embalagem ATM (12.03.14)

Cryptococcus humicola

Última água de enxaguamento

Limiano – Antes da acidificação (18.03.14; 29.04.14) Limiano – Entrada na salga (29.04.14)

Limiano – Saída da salga (29.04.14)

Cryptococcus laurentii Tapete de entrada na salga Última água de enxaguamento

Cryptococcus neoformans Limiano – 1 mês em embalagem ATM (05.06.14) MB – Fatiamento (17.06.14)

MB – 1 mês em embalagem ATM (29.04.14)

Geotrichum spp. Formas de prensagem (25.02.14) Última água de enxaguamento

Limiano – Antes da acidificação (06.02.14; 25.02.14; 29.04.14)

Geotrichum capitatum Tapete de entrada na salga Última água de enxaguamento

Limiano – Antes da acidificação (25.02.14) Limiano – Entrada na salga (29.04.14)

Prototheca spp. Última água de enxaguamento

Limiano – Antes da acidificação (29.07.14)

Limiano – 2 meses em embalagem ATM (13.05.14) TN – 2 meses em embalagem ATM (16.04.14) MB – Fatiamento (17.06.14)

MB – 1 mês em embalagem ATM (21.05.14)

Prototheca wickerhamii Última água de enxaguamento

Limiano – Antes da acidificação (29.07.14)

Limiano – 2 meses em embalagem ATM (13.05.14) MB – 1 mês em embalagem ATM (21.05.14)

Rhodotorula mucilaginosa Última água de enxaguamento

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Todos os microrganismos identificados ocorreram durante as produções de queijo sem tratamento antifúngico (Tabela 11). Foram identificadas várias espécies do género Candida como C. famata, C. hellenica, C. krusei, C. lusitaniae e C. parapsilosis. Algumas espécies de Candida spp. são conhecidas pela sua patogenicidade, estando presentes na microflora das mucosas oral, intestinal e vaginal, continuando a colonizar estes habitats até encontraram condições apropriadas para expressar os seus fatores de virulência (Wanderley et al., 2013). Dentro do género Candida as espécies C. albicans, C. parapsilosis (espécie identificada - Tabela 11), C. tropicalis e C. guillermondii são as espécies de leveduras patogénicas mais comuns, apresentando-se como parasitas oportunistas responsáveis por várias micoses (Kauffman, 2006 citado Jacques e Casaregola, 2008). Nos últimos anos outras espécies oportunistas do género Candida como C. glabrata, C. dublinensis, e C. krusei (espécie identificada - Tabela 11) têm emergido como patogénicos principalmente devido à crescente utilização de terapia imunossupressora, cateterização por longos períodos, grande esperança de vida para os pacientes imunocomprometidos e o envelhecimento da população (Jacques e Casaregola, 2008). Espécies como a Issatckenkia orientalis (o telemorfo da Candida krusei) e a Clavispora lusitiniae (o telemorfo da Candida lusitiniae) têm sido descritas como leveduras que raramente ocorrem no queijo (Jacques e Casaregola, 2008), sendo que as espécies C. krusei e C. lusitaniae foram identificadas neste projeto (Tabela 11). As espécies patogénicas pertences a este género têm sido isoladas principalmente em leite de animais com mastites, assim como em queijos artesanais. Quando espécies de Candida spp. se encontram em alimentos em grandes concentrações e o trato gastrointestinal do hospedeiro apresenta condições apropriadas para uma colonização oportunista, as espécies de Candida são capazes de segregar metabolitos tóxicos, o que pode resultar numa série de diversos sintomas (Wanderley et al., 2013). Nos casos de