REAÇÃO EM CADEIA PELA POLIMERASE

4.8.1 EXTRAÇÃO DO DNA DAS AMOSTRAS

Para extração do DNA do material obtido da punção de linfonodos foi utilizado o kit de extração da Amersham Genomic Prep Cells and Tissue DNA Extraction kit®_{. Inicialmente foram pipetados 250 µl de cada amostra em} microtubos estéreis livres de DNAases e RNAases, centrifugando-se a 14.000 rpm por cinco segundos. Após a centrifugação foram descartados 220 µl do sobrenadante e o restante foi homogeneizado vigorosamente em vórtex por alguns segundos para facilitar a lise celular. Adicionou-se 600 µl de solução de lise e a seguir homogeneizou-se várias vezes. Não houve necessidade de incubar as amostras, e logo após a lise adicionou-se 3 µl de solução de RNAases invertendo- se os tubos 25 vezes para homegeneização. Incubou-se por 45 minutos à 37o_{C, e} adicionou-se 200 µl de solução de precipitação de proteínas, centrifugando-se a 14.000 rpm por 3 minutos. Novos microtubos foram identificados e preenchidos com 600 µl de álcool isopropílico vertendo-se cuidadosamente o sobrenadante obtido. Homogeneizou-se por inversão dos tubos 50 vezes, e centrifugou-se novamente a 14.000 rpm por 1 minuto. Descartou-se o conteúdo líquido dos tubos, e as bordas do microtubo foram secas com papel higiênico absorvível, permanecendo ao fundo somente o pellet de DNA. A seguir, adicionou-se 600 µl de álcool etílico gelado e os tubos foram invertidos repetidas vezes para que os pelltes fossem banhados novamente. Centrifugou-se como anteriormente por um minuto a 14.000 rpm, descartando-se o álcool etílico. Os microtubos foram mantidos à temperatura ambiente com as tampas abertas para evaporação do álcool etílico que eventualmente permaneceu no fundo do microtubo. Após secagem, pipetou-se 100 µl de solução de hidratação de DNA, fecharam-se os microtubos, mantendo-os em temperatura ambiente overnight, armazenando-os em freezer -20 o_{C. Para cada 13 amostras extraídas, foram extraídas também um} controle negativo e um controle positivo, obtido a partir de cultura de L. chagasi.

4.8.2 AMPLIFICAÇÃO COM OS PRIMERS LIN 19 E LIN R4

Foram utilizados 5 µl de tampão de PCR (Buffer 10X) (50mmol KCl, 10mmol de Tris-HCl), 1,5 U de Taq-polimerase, 10 pmol de cada primer (LIN R4 e LIN 19), 1,5 UI de MgCl2, e 15,2 µl de água ultra pura, 200mM de oligonucleotídeos e 10 µl da amostra em cada tubo de reação de 0,2 ml. Desta forma, utilizou-se 40 µl do MIX-PCR por amostra e 10 µl do produto de extração do DNA, totalizando um volume de 50 µl.

As condições de amplificação em termociclador (GeneAmp PCR System 9600) foram seguidas conforme descritas por Ikonomopoulos et al (2003), sendo a desnaturação inicial de 95ºC por 3 minutos, seguido de 32 ciclos a 95ºC durante 30 segundos, 58ºC durante 30 segundos e 72ºC durante 1 minuto e uma extensão final de 72ºC durante 7 minutos.

Para amplificação dos fragmentos de minicírculos de KDNA, foram utilizados os iniciadores LINR4 e LIN19, descritos por Ikonomopoulos et al (2003).

LIN19 5´ CAGAACGCCCCTACCCG 3´ LIN R4 5´ GGGGTTGGTGTAAAATAGGG 3´

Nessa reação, os produtos resultantes apresentaram 720 pares de base (pb) de comprimento, que correspondem à amplificação de segmento contendo região específica de minicírculo do KDNA de Leishmania sp (ARANSAY et al., 2000). A identificação dos produtos amplificados foi realizada em eletroforese em gel de agarose à 2,0%. Para isso, alíquotas de 10 µl das amostras amplificadas foram homogeneizadas com 2 µl de solução de azul de bromofenol, que foi submetida à eletroforese horizontal em tampão Tris-borato-EDTA (TBE) 0,5X. O gel para eletroforese foi preparado com 2,0g de agarose pura em 5 ml de tampão Tris-EDTA-Borato (TBE) 10X e 95 ml de água ultrapura. A agarose foi dissolvida na solução de TBE em ehrlenmeyer de 250 ml que foi em seguida colocado em microondas em potência máxima por três minutos para dissolução completa do soluto. A solução foi distribuída uniformemente na cuba de eletroforese. A corrida foi realizada a 100 volts por 90 minutos. Ao final, o gel foi corado em solução de brometo de etídio durante uma hora e as bandas foram visualizadas em

transiluminador ultravioleta, com filtro de 300nm. Os géis foram fotografados utilizando o sistema fotográfico Polaroid. Foram utilizados como controles positivos produtos da amostra amplificada de Leishmania major, e como negativos o TNE (Tris-NaCl EDTA). Para o padrão de peso molecular, foi utilizado o DNA Ladder 100 pb.

4.8.3 AMPLIFICAÇÃO COM OS PRIMERS RV1 E RV2

As amostras que apresentaram resultado positivo na PCR utilizando os primers gênero específicos LINR4 e LIN19 foram novamente testadas com os primers espécie específicos para L. chagasi. Foram utilizados 5 µl de tampão de PCR (Buffer 10X) (50mmol KCl, 10mmol de Tris-HCl), 1,5 U de Taq-polimerase, 50 pmol de cada primer (RV1 e RV2), 1,5 UI de MgCl2, e 19,7 µl de água ultra pura, 200mM de oligonucleotídeos e 10 µl da amostra em cada tubo de reação de 0,2 ml. Desta forma, foi utilizado 40 µl do MIX-PCR e 10 µl do produto de extração do DNA, totalizando volume de 50 µl.

As condições de amplificação em termociclador (GeneAmp PCR System 9600) foram seguidas conforme descritas por Lachaud et al. (2002), sendo a desnaturação inicial de 94ºC por 4 minutos, seguido de 40 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 59ºC durante 30 segundos e 72ºC durante 30 segundos e uma extensão final de 72ºC durante 10 minutos.

Para amplificação dos fragmentos de minicírculos de KDNA, foram utilizados os iniciadores RV1 e RV2 descritos por Lachaud et al (2002).

RV1 5’ CTTTTCTGGTCCCGCGGGTAGG 3´ RV2 5´ CCACCTGGCCTATTTT ACACCA 3´

Nessa reação, os produtos resultantes apresentaram 145 pares de base (pb) de comprimento, que correspondem à amplificação de segmento contendo região específica de minicírculo do KDNA de Leishmania chagasi (LACHAUD et al., 2002). A identificação dos produtos amplificados foi realizada da mesma maneira que os primers LIN R4 e LIN19

4.8.4 LIMIAR DE DETECÇÃO

Foi utilizada a amostra de Leishmania chagasi proveniente de repique em meio de cultura LIT e NNN, utilizada na rotina do Serviço de Diagnóstico de Zoonoses da FMVZ – UNESP Botucatu – SP. Foram pipetados 5 ml de meio LIT com formas promastigotas viáveis de dois diferentes tubos de cultura em tubo Falcon de 15 ml. O tubo permaneceu 15 minutos em banho maria a 56 o_{C para} que as promastigotas permanecessem imóveis durante o procedimento de contagem. A amostra foi homogeneizada e parte dela utilizada para contagem dos parasitos em câmara de Neubauer. Foram procedidas seis contagens de cinco dos quadrantes menores, de maneira bem distribuída por toda câmara. A média obtida nos cinco quadrantes foi de 127 formas promastigotas. Para obtenção do número de parasitos por ml de meio de cultura foi utilizada a seguinte fórmula:

no de promastigotas contadas / 0,1 mm3.1. 0,2 = no promastigotas/ml

Sendo: 0,1 a altura da câmara de Neubauer

1 a diluição utilizada na contagem, ou seja, meio de cultura puro 0,2 o número de campos contados dividido pelo número total de campos (5/25)

Então:127/0,02 = 6.350 promastigotas/ml ou seja 6,35x103/ml

Para se obter valores em potências de 10, realizou-se regra de três para obtenção do volume de meio de cultura que possui 1000 formas promastigotas (103):

1 ml ---6.350 x = 0,1575 ml ou 157,5 µl X ml---1.000

Em seguida, utilizou-se 157,5 µl de meio de cultura em 842,5 µl de água destilada totalizando 1 ml de amostra, ou seja, 103 _{parasitos por ml de solução.} As diluições seguintes foram realizadas de maneira que as soluções resultantes nos novos tubos ficassem 10 vezes mais diluídas que no tubo anterior,

produzindo concentrações 102_{, 10}1 _{e 10}0 _{formas promastigotas por ml de} solução.

Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5