FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
ELUCIDAÇÃO DIAGNÓSTICA NA LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA PARA A VIGILÂNCIA EPIDEMIOLÓGICA E CONTROLE DESTA ZOONOSE
JANAINA BIOTTO CAMARGO
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
ELUCIDAÇÃO DIAGNÓSTICA NA LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA PARA A VIGILÂNCIA EPIDEMIOLÓGICA E CONTROLE DESTA ZOONOSE
JANAINA BIOTTO CAMARGO
Dissertação apresentada junto ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária na área de saúde animal, saúde pública veterinária e segurança alimentar para obtenção do título de Mestre.
Nome da Autora: Janaina Biotto Camargo
Título: ELUCIDAÇÃO DIAGNÓSTICA NA LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA PARA A VIGILÂNCIA EPIDEMIOLÓGICA E CONTROLE DESTA ZOONOSE.
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof. Titular Helio Langoni Presidente e Orientador
Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública FMVZ – UNESP - Botucatu
Prof. Assistente Dr. Antonio Carlos Paes Membro
Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública FMVZ – UNESP - Botucatu
Prof. Assistente Dr. Paulo Eduardo Martins Ribolla Membro
Departamento de Parasitologia IBB – UNESP - Botucatu
DEDICATÓRIA
AOS MEUS PAIS,
SÉRGIO ANTÔNIO CAMARGO
& SANDRA REGINA BIOTTO CAMARGO
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente ao meu orientador e meu mentor Prof. Dr. Helio Langoni por me aceitar como sua orientada e confiar a mim esse projeto, à Profa. Dra. Simone Baldini Lucheis pela co-orientação e ajuda indispensável, ao Professor Antônio Carlos Paes pela participação nas bancas; ao Professor Dr. Paulo Ribolla pela orientação de estágio, participação nas bancas e por toda ajuda científica; ao Professor Dr. João Pessoa pelas informações técnicas e por ter disponibilizado seu laboratório. Agradeço aos residentes do departamento pela colaboração fornecendo amostras e material de apoio, em especial aos meus amigos Luciana Bonatto e Gustavo Lara; a todos os funcionários do departamento; aos pós-graduandos da Zoonoses, em especial à minha amiga Juliana Giantomassi, pela ajuda indispensável com os ELISAs, pelo apoio nos momentos difíceis e amizade incondicional; à amiga Marcella Troncarelli, pela colaboração enorme e principalmente pela sua amizade e bom humor; ao graduando Rodrigo Costa pela enorme ajuda em tudo que precisei, aos pós-graduandos da virologia do Instituto de Biociências da Unesp, em especial à minha amigona Marcela Bernenta que não só me ajudou com as PCRs como também pôs a mão na massa nas coletas do CCZ e sem a qual talvez esse projeto não teria sido concluído, e ao Thiago, pelas informações imprescindíveis. Obrigada também à minha amiga Acácia, que se disponibilizou e me ajudou muito com a parte estatística e com apoio moral, a Danielle, que apesar da distância me deu dicas e me apoiou não só no mestrado como em muitas outras lutas minhas. Agradeço também em especial à minha amiga e quase irmã Vitória, que me ajudou nas coletas, me deu apoio importantíssimo nos piores momentos e nunca faltou um instante qualquer. Ao meu namorado, Rodrigo, pela paciência e apoio durante a elaboração da dissertação. Agradeço enormemente aos médicos veterinários do Centro de Controle de Zoonoses, Neto e Cláudia, e a todos os funcionários; ao veterinário do CCZ de Botucatu Paulo Piguineli e todos os seus funcionários.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Esquema utilizado para a análise estatística referente a sensibilidade, especificidade, valores preditivos positivos e negativos, probabilidades de falsos negativos e falsos positivos... 42
Tabela 2 - Resultados dos exames parasitológico direto, RIFI, ELISA e PCR dos animais de Bauru. Botucatu 2008... 44
Tabela 3 - Resultados das PCR de aspirados de linfonodos dos cães de Bauru com os primers LIN R4 e LIN 19, e RV1 e RV2.
Botucatu 2008... 44
Tabela 4 - Distribuição dos cães provenientes do CCZ de Bauru em porcentagens de acordo com os sinais clínicos detectados. Botucatu 2008... 46
Tabela 5 - Distribuição dos 100 cães de Bauru, de acordo com os bairros de procedência. Botucatu 2008... 51
Tabela 6 - Resultados das provas RIFI, ELISA e PCR LIN R4 e LIN 19 nos 55 cães negativos de Bauru no exame parasitológico direto. Botucatu 2008... 54
Tabela 7 - Resultados das provas RIFI, ELISA e PCR LIN R4 e LIN 19 dos cães de Bauru, positivos no exame parasitológico direto. Botucatu 2008... 57
Tabela 9 - Distribuição dos resultados do ELISA dos cães de Bauru segundo exame parasitológico direto. Botucatu 2008... 58
Tabela 10 - Distribuição dos resultados da PCR dos cães de Bauru segundo exame parasitológico direto. Botucatu 2008... 59
Tabela 11- Limites de confiança para as proporções de concordância entre os vários métodos utilizados. Botucatu 2008... 64
Tabela 12- Distribuição dos títulos sorológicos obtidos na RIFI, comparado com os resultados dos exames parasitológicos diretos, a partir da punção de linfonodos dos cães de Bauru. Botucatu 2008... 66
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 - Número de casos humanos e óbitos confirmados em decorrência da leishmaniose visceral de 2003 a 2008 no município de Bauru, registrados na Secretaria de Saúde de Bauru... 9
Quadro 2 - Número de cães positivos sorologica e/ou clinicamente com LVC e número de cães sacrificados no Centro de
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Localização do município de Bauru no estado de São Paulo e do estado de São Paulo no Brasil... 30
Figura 2 - Localização de Botucatu no estado de São Paulo e do estado de São Paulo no Brasil... 31
Figura 3 - Foto de cão apresentando mucosa oral perlácea revelando anemia severa... 47
Figura 4 - Foto de cão apresentando emagrecimento extremo (caquexia)... 47
Figura 5 - Mapa do município de Bauru com a localização de cada bairro, evidenciando, com as setas brancas, os três bairros com a maior incidência de animais capturados... 52
Figura 6 - Foto tirada em microscopia óptica de uma lâmina de aspirado de linfonodo corada ao Giemsa, de um cão de Bauru, apresentando formas amastigotas fagocitadas dentro de um macrófago (ninho de amastigotas). Aumento 100X... 55
Figura 7 - Foto tirada em microscopia óptica de uma lâmina de aspirado de linfonodo corada ao Giemsa, de um cão de Bauru, apresentando formas amastigotas com as estruturas bem visíveis: núcleo e cinetoplasto, corados em roxo e o citoplasma corado em rosa. Nesta foto, elas aparecem fora das células. Aumento 100X... 55
Figura 9 - Gel de eletroforese, apresentando bandas de 145 pares de base amplificadas pelos primers RV1 e RV2. Sendo, C+ o controle positivo de promastigotas de L. chagasi provenientes de meio de cultura; C- amostra de aspirado de linfonodo controle negativo de cão proveniente de área não-endêmica; H2O: água livre de nucleotídeos para controle dos reagentes; Ladder: marcador de peso molecular (PM) de 100 pares de base... 73
SUMÁRIO
Página
RESUMO………. xiii
ABSTRACT………. xiv
1 INTRODUÇÃO……… 2
2 REVISÃO DE LITERATURA………. 2.1 ETIOLOGIA... 2.2 HISTÓRICO... 2.3 EPIDEMIOLOGIA... 2.4 ASPECTOS DE SAÚDE PÚBLICA... 2.5 IMUNIDADE E CLÍNICA... 2.6 DIAGNÓSTICO... 2.6.1 REAÇÃO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (RIFI).... 2.6.2 TESTE IMUNOENZIMÁTICO (ELISA)... 2.6.3 EXAME PARASITOLÓGICO DIRETO... 2.6.4 REAÇÃO EM CADEIA PELA POLIMERASE (PCR) ... 2.7 CONTROLE... 5 5 5 6 12 12 14 15 16 18 19 22
3 OBJETIVOS... 28
4.7.2.1 PREPARAÇÃO DO ANTÍGENO (L. major)... 4.7.2.2 SENSIBILIZAÇÃO DAS PLACAS DE ELISA... 4.7.2.3 CÁLCULO DO PONTO DE CORTE... 4.8 REAÇÃO EM CADEIA PELA POLIMERASE... 4.8.1 EXTRAÇÃO DO DNA DAS AMOSTRAS... 4.8.2 AMPLIFICAÇÃO COM OS PRIMERS LIN R4 E LIN 19... 4.8.3 AMPLIFICAÇÃO COM OS PRIMERS RV1 E RV2... 4.8.4 LIMIAR DE DETECÇÃO... 4.8.5 CONTROLE DE CONTAMINAÇÃO... 4.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA ...
34 35 36 37 38 38 39 39 41 42
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO... 5.1 RESULTADOS GERAIS... 5.2 SINAIS CLÍNICOS... 5.3 DISTRIBUIÇÃO DOS CÃES NO MUNICÍPIO DE BAURU... 5.4 SEXO E RAÇA... 5.5 EXAME PARASITOLÓGICO DIRETO COMO PADRÃO-OURO... 5.6 SENSIBILIDADE... 5.7 ESPECIFIDADE... 5.8 FALSOSPOSITIVOS, FALSOS NEGATIVOS, VERDADEIROS POSITIVOS E VERDADEIROS NEGATIVOS... 5.9 VALORES PREDITIVOS ... 5.10 PROPORÇÕES DE CONCORDÂNCIA ENTRE AS PROVAS... 5.11 RESULTADOS DA RIFI DOS CÃES DE BAURU ... 5.12 ELISA ... 5.13 PCR... 5.14 RESULTADOS INDIVIDUAIS...
44 44 45 49 53 54 57 60 62 63 63 65 67 69 73
6 CONCLUSÃO... 77
7 BIBLIOGRAFIA... 79
CAMARGO, J. B. Elucidação diagnóstica na leishmaniose visceral canina para a vigilância epidemiológica e controle desta zoonose. Botucatu, 2008. 123p. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista.
RESUMO
A leishmaniose visceral (LV) é uma enfermidade infecciosa de caráter zoonótico, endêmica em algumas áreas do Brasil, causada pela L. chagasi. A maior dificuldade encontrada para controlar a doença está relacionada ao seu diagnóstico, que apresenta limitações quanto aos seus resultados. Desta maneira, o estudo comparou duas provas sorológicas, a reação de imunofluorescência indireta (RIFI) e o ensaio imunoenzimático (ELISA); o exame parasitológico direto bem como a reação em cadeia pela polimerase (PCR), ambos de aspirado de linfonodo. Foram utilizados os iniciadores gênero-específicos LINR4 e LIN19 e os iniciadores RV1 e RV2 espécie-gênero-específicos para identificar a L. chagasi. Foram coletadas amostras de 100 cães sorologicamente positivos, provenientes do Centro de Controle de Zoonoses (CCZ) de Bauru, região endêmica, e de 100 cães provenientes do canil municipal de Botucatu-SP, área não-endêmica para a enfermidade. A RIFI, o parasitológico e a PCR apresentaram especificidade de 100% e o ELISA de 99%. As sensibilidades foram 97,77%; 93,33% e 91,11%, para RIFI, ELISA e PCR respectivamente. A proporção de concordância entre as provas foi satisfatória, apresentando valores de P sempre menores que 0,05. Pode-se concluir que além do exame sorológico, pode-se utilizar também a PCR de linfonodo no diagnóstico da LVC, pois a associação de técnicas melhorou a detecção de cães infectados, contribuindo para o melhor controle desta zoonose.
CAMARGO, J. B. Diagnostic briefing in canine visceral leishmaniasis for epidemiologic monitoring and control of this zoonose. Botucatu, 2008. 123p. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista.
ABSTRACT
The visceral leishmaniasis (VL) is a zoonotic infectious disease, endemic in some areas from Brazil, caused by L. chagasi. The greatest difficulty to control the disease is related to its diagnosis, which present limitations related with the results. Thus, the study compared two serologic methods, the indirect fluorescent antibody test (IFAT) and the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA); the parasitological direct examination and the polymerase chain reaction (PCR), both drawn from the lymph node. The initiators used were gender-specific LINR4 and LIN19 and the initiators species-specific RV1 and RV2 to identify L. chagasi. The samples were collected from 100 dogs serologically positive, from the Center for Zoonoses Control (CZC) of Bauru, endemic region, and 100 dogs from municipal kennel of Botucatu-SP, an area considered non-endemic to the disease. The IFAT, the parasitological and the PCR showed 100% of specificity and ELISA 99%. The sensitivities were 97.77%, 93.33% and 91.11% for IFAT, ELISA and PCR respectively. The proportion of agreement between the methods was satisfactory, showing values of P always smaller than 0,05. It was concluded that in addition to the serologic methods, PCR of lymph node can also be used for CVL diagnosis, and that the combination of techniques improved the detection of infected dogs, contributing for better control of this zoonosis.
1 INTRODUÇÃO
A leishmaniose visceral canina (LVC) é uma enfermidade infecciosa de caráter zoonótico de distribuição mundial que tem como agentes etiológicos protozoários do gênero Leishmania, complexo L. donovani. Nas duas últimas décadas aumentou, no Brasil, o número de casos e distribuição geográfica desta enfermidade transferindo-se do meio rural para o urbano. Muitos fatores são atribuídos a essa disseminação, entretanto, os principais são o descontrole populacional dos cães e a presença dos vetores. Os cães são considerados os principais reservatórios no meio urbano, pela proximidade com o ser humano e pela alta prevalência nesses animais. Os vetores são espécies de flebotomíneos, mais especificamente a Lutzomyia longipalpis, que se proliferam em locais onde há disponibilidade de matéria orgânica.
A LV em humanos ocorre principalmente em crianças menores de dez anos e adultos imunossuprimidos. Atualmente, ressalta-se a importância da leishmaniose em pacientes HIV positivos, já que a co-infecção tornou-se mais freqüente na última década.
As medidas de controle da LV envolvem fundamentalmente o tratamento de casos humanos, borrifação de casas e peridomicílios com inseticidas de ação residual, identificação e eliminação de cães sorologicamente positivos. No entanto, a maior dificuldade encontrada relaciona-se com o diagnóstico da LVC, já que os métodos utilizados para o seu controle são baseados na pesquisa de anticorpos, e estes apresentam limitações. Desta maneira, a identificação dos cães infectados é um ponto chave para interromper a cadeia epidemiológica da doença nos centros urbanos.
detecção de fragmentos de DNA específicos provenientes do seu cinetoplasto. É recomendado para identificar o parasito em casos em que as sorologias apresentem resultados inconclusivos e também quando os exames parasitológicos não são suficientemente sensíveis para detectar o agente nos órgãos.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Etiologia
A leishmaniose visceral é uma doença infecciosa, de caráter zoonótico, de distribuição mundial, causada por protozoários pertencentes à ordem Kinetoplastida, família Trypanosomatidae, gênero Leishmania do complexo Leishmania donovani. No velho mundo, a leishmaniose é causada pela L. infantum e L. donovani, enquanto que no novo mundo é causada pela L. chagasi (BANETH, 2006).
No Brasil, o seu agente é a L. chagasi, espécie semelhante à L. infantum encontrada em alguns países do Mediterrâneo e Ásia. Há grande polêmica quanto à origem da LV no novo mundo; se foi introduzida após a colonização européia e causada pela L. infantum, ou há vários milhares de anos juntamente com os canídeos, devendo ser classificada como L. chagasi (GONTIJO e MELO, 2004). As espécies variadas de leishmanias são morfologicamente indistinguíveis e têm sido identificadas por meio de métodos moleculares. O estudo conduzido por Lukes et al. (2007) sugere que o genótipo está extremamente correlacionado com a origem geográfica (continental) e não com sua taxonomia atual ou característica clínica. Segundo os autores, o gênero Leishmania pode ter se originado na América do Sul e posteriormente se diversificado durante sua migração para a Ásia.
2.2 Histórico
estudados os aspectos clínicos, de patogenia e de tratamento da doença. Na época, os mecanismos de transmissão e os processos de infecção não foram definidos e foi possível apenas assinalar o provável papel dos flebotomíneos na difusão da doença (CHAGAS et al., 1938).
2.3 Epidemiologia
Os vetores da leishmaniose visceral são dípteros da família Psycodidae, dos quais a Lutzomyia longipalpis é o principal e mais importante, no novo mundo (BRASIL, 2002a). Atualmente, a Lutzomyia evansi também é considerada vetor para a doença nas Américas e a L. forattini também foi proposta como vetor (GOMES et al., 2006). A Lutzomyia cruzi também foi incriminada como vetor da LV, sendo encontrada principalmente em algumas regiões do Mato Grosso (SANTOS et al., 1998). O mosquito possui 3 mm de comprimento, cor de palha, aspecto giboso, possui grandes asas pilosas dirigidas para trás e para cima, cabeça fletida e longos palpos maxilares. Durante o repasto sanguíneo, introduz no hospedeiro, por meio da saliva, um peptídeo considerado dos mais potentes vasodilatadores (BRASIL, 2002a). Outros possíveis vetores da leishmaniose têm sido estudados, como pulgas e carrapatos. Na pesquisa conduzida em Belo Horizonte, Minas Gerais foi realizada infecção experimental de Leishmania spp em cães, que em seguida, foram parasitados por carrapatos. Os autores conseguiram, por meio da reação em cadeia pela polimerase (PCR), identificar o DNA de Leishmania spp nestes carrapatos, o que sugere que os mesmos poderiam, provavelmente, desempenhar papel de vetor para a enfermidade (COUTINHO et al., 2005). Em alguns casos, pode-se supor que, apesar da existência de carrapatos e cães concomitantemente infectados por Leishmania importados de municípios endêmicos vivendo no município de Botucatu, área não endêmica para LVC, não foram identificados animais positivos na RIFI em inquérito realizado por Langoni et al (2001).
soroconversão humana entre os locais nos quais os cães eram eliminados e naquelas em que esses animais não eram eliminados, como forma de controle. Esses achados sugerem que os cães podem não ser os principais reservatórios nessas áreas, e que a transmissão humano-mosquito-humano pode também ser importante na dispersão e na manutenção da infecção (MESTRE e FONTES, 2007).
No Brasil, vários animais silvestres como raposas das espécies Lycalopex vetulus e Cerdocyon thous e um marsupial da espécie Didelphis albiventris foram encontrados naturalmente infectados pela L. chagasi. No Rio de Janeiro, há o relato de um caso de LV em um cão do mato-vinagre (Speothos venaticus) mantido em cativeiro no zoológico. Outras espécies silvestres estão possivelmente relacionadas com o ciclo silvestre da enfermidade, sendo necessários estudos para o melhor entendimento do seu curso natural e a importância destes na cadeia de transmissão (FIGUEIREDO et al., 2007).
O principal reservatório da leishmaniose visceral no país é o cão doméstico, que assume grande importância na transmissão da doença provavelmente pelo seu maior parasitismo cutâneo e por apresentar-se infectado em quase todos os focos brasileiros de LV humana (REIS, 2001). Um estudo realizado nos Estados Unidos utilizando cães beagles de laboratório sugere que a transmissão vertical também é possível (ROSYPAL et al., 2005).
O poder de infectar os mosquitos, segundo Zivicnjak et al (2005) é similar, tanto em portadores assintomáticos como em cães que apresentam algum grau de sintomatologia. Contudo, em um estudo realizado em Montes Claros - MG, as taxas de infecção em flebotomíneos que se alimentaram em cães comprovadamente infectados apresentando diferentes quadros clínicos da LV foram mensuradas. Cães assintomáticos, oligossintomáticos e sintomáticos, revelaram taxas de infecção de 5,4%, 5,1% e 28,4%, respectivamente, sugerindo que os animais sintomáticos são aproximadamente quatro vezes mais infectantes para os vetores que os oligossintomáticos e assintomáticos (MICHALSKY et al., 2007).
Após oito a 20 dias do repasto sanguíneo, as formas amastigotas evoluem para formas promastigotas no tubo digestivo dos insetos, tornando-se infectantes. O período de incubação no homem varia de dez a 24 meses, sendo em média dois a quatro meses (BRASIL, 2002a). Nos cães, o início dos sinais clínicos se dá entre três meses e sete anos após a inoculação (BANETH, 2006). As formas amastigotas se multiplicam por divisão binária e vivem dentro de células do sistema fagocítico monocitário de hospedeiros mamíferos, podendo ser encontradas também fora das células.
A LV possui ampla distribuição mundial, atingindo principalmente as regiões tropicais e subtropicais, sendo que 90% dos casos humanos ocorrem na Índia, Sudão, Bangladesh, Nepal e Brasil (LINDOSO e GOTO, 2006). Em todo território nacional, aproximadamente 2500 a 5000 casos são notificados anualmente e em regiões de baixa incidência, como o estado de São Paulo, a mortalidade chega a 10% (GOMES et al., 2006). Segundo o Ministério da Saúde, cerca de 1500 novos casos são notificados anualmente, com um aumento de 2800 casos por ano de 1992 a 1997 (MICHALSKY et al., 2007). Na América Latina, está presente em 12 países, sendo que 90% dos casos se concentram no Brasil, onde grandes centros urbanos estão sendo invadidos pela doença, a exemplo das capitais Belo Horizonte, Teresina, São Luís, Fortaleza e Rio de Janeiro, que já possuem registros autóctones (WHO, 1996, apud CABRERA, 1999). No município de Bauru, SP, onde a enfermidade é endêmica, Gomieri∗ relata que apesar de todos os esforços empregados no
controle, observa-se um aumento significativo do número de casos humanos até 2006 (Quadro 1). Até o presente momento, em 2008, foram registrados três casos sem nenhum óbito.
No Centro de Controle de Zoonoses (CCZ) de Bauru os cães são eutanasiados de acordo com o diagnóstico sorológico e/ou clínico da doença, totalizando a cada ano, um número crescente de animais eutanasiados de 2003 até 2007 (Quadro 2). Segundo levantamento realizado pelos profissionais do CCZ, o número estimado de cães em todo município é de 61.593, divididos em 12 áreas que abrangem vários bairros. Levando-se em consideração que a população bauruense é ao redor de 347.601 habitantes (IBGE, 2008), o número de cães é de um para cada 5,64 habitantes, ou seja, acima da razão homem/cão máxima recomendada pela Organização Mundial da Saúde, que é de um cão para cada sete habitantes para os países emergentes (WHO, 1992), fato agravante, levando-se em consideração que o Canis familiaris é o principal reservatório da enfermidade nos centros urbanos (REIS, 2001).
QUADRO 1. Número de casos humanos e óbitos confirmados em decorrência
da leishmaniose visceral de 2003 a 2008 no município de Bauru, registrados na Secretaria de Saúde de Bauru.
ANO CASOS REGISTRADOS ÓBITOS
2003 17 01
2004 29 03
2005 37 06
2006 72 04
2007 38 07*
2008 03 (até maio)
Foram testadas por Langoni et al (2001) 781 amostras de soro canino na cidade de Botucatu, durante campanha de vacinação anti-rábica, para anticorpos da classe IgG contra Leishmania. Todos os soros testados pela RIFI, foram negativos, indicando, pelo menos por essa prova, que Botucatu não apresentava, até esse momento, risco potencial para ocorrência de surtos epidêmicos de leishmaniose. Contudo, o estudo enfatiza a importância de esforços contínuos na vigilância epidemiológica contra a leishmaniose, visando o diagnóstico precoce de casos autóctones, prevenindo-se consequentemente a disseminação do agente para o homem, cães e flebotomíneos.
QUADRO 2 Número de cães positivos sorologicamente e/ou clinicamente com
LVC e número de cães sacrificados no Centro de Controle de Zoonoses de Bauru de 2003 a 2008.
Fonte: Secretaria da Saúde de Bauru
A LVC coexiste com a doença humana em todos os focos conhecidos, porém, precede normalmente sua ocorrência em humanos. Pode-se considerá-la como uma doença negligenciada, já que 80% dos casos ocorrem em populações de baixa renda, que sobrevivem com menos de dois dólares por dia. Até os anos 90, a maioria dos casos humanos brasileiros eram provenientes da região Nordeste, todavia, observa-se uma mudança drástica nesse panorama, com expansão das áreas endêmicas para regiões Sudeste, Centro-Oeste e Norte (LINDOSO e GOTO, 2006). Anteriormente, a região Nordeste
destacava-ANO N° CÃES POSITIVOS SOROLOGICAMENTE
OU CLINICAMENTE N° EUTANÁSIAS
2003 450 528
2004 753 2.270
2005 598 2.438
2006 1.151 4.452
2007 916/2.491 4.325
se com o maior número de casos de leishmaniose (81,7%), seguido pela região Norte (8,8%), Sudeste (7,6%) e por último a região Centro-Oeste (1,9%) (REIS, 2001). No ano de 2003, o percentual no Nordeste foi de 58%, no Norte 15%, no Centro-Oeste 7% e no Sudeste 19%. No estado de São Paulo, foi reintroduzida em 1999, quando os primeiros casos humanos foram registrados em Araçatuba. Atualmente está presente em 24 municípios, obedecendo principalmente a uma distribuição ao longo da Rodovia Marechal Rondon (LINDOSO e GOTO, 2006).
Nos últimos anos, no Brasil, a LVC tem aumentado sua prevalência tanto em número de casos, quanto em sua distribuição geográfica. Acreditava-se que se tratava de uma doença tipicamente rural e de ambientes terrestres, todavia, atualmente já se sabe que pode ser contraída em zonas urbanas e suburbanas e já foi notificada em praticamente todos os estados brasileiros sendo considerada endêmica no país (BRAGA et al., 1998). O comportamento epidemiológico da leishmaniose é cíclico ocorrendo elevação do número de casos em períodos médios a cada cinco anos, além de uma tendência crescente desde 1980 até o momento (BRASIL, 2002b).
A enfermidade tem sido considerada re-emergente no país e assumiu novo perfil devido às mudanças sócio-econômicas ocorridas nas duas últimas décadas, transformando-se em uma endemia urbana e, em virtude do potencial zoonótico, sério problema de saúde pública (BRAGA et al., 1998). Inicialmente, era considerada esporádica e atingia cães e seres humanos que viviam em contato estreito com a mata. Tem sido apontada como re-emergente, caracterizando nítido processo de transição epidemiológica. Apresenta incidência crescente nos últimos anos, nas áreas onde ocorria tradicionalmente, expansão geográfica para estados localizados mais ao sul do Brasil e em locais que se urbanizaram rapidamente no Nordeste e no Sudeste (ALVES e BEVILLAQUA, 2004). Acredita-se que degradações ambientais e falta de políticas sociais, associadas às migrações de populações rurais carentes para as periferias de centros urbanos de maneira desordenada e sem estrutura sanitária, aliadas à presença de reservatórios no local, proporcionaram condições favoráveis à urbanização da leishmaniose visceral em áreas metropolitanas (REIS, 2001).
mosquito transmissor, colocando o cão e o homem como fontes alternativas acessíveis. Esse processo, ainda que intensificado nas duas últimas décadas, teve início em meados do século XX (BRASIL, 2002b). Muitos outros fatores inter-relacionados têm sido considerados como determinantes no aumento das endemias como, por exemplo: exploração de terras, interrupção de inquéritos epidemiológicos, processos de urbanização, aumento das áreas ocupadas com moradias e condições sanitárias inadequadas, e a presença de cães infectados. O acúmulo de matéria orgânica propicia também condições favoráveis para a reprodução dos mosquitos (MICHALSKY et al., 2007).
2.4 Aspectos de saúde pública
Acomete pessoas de todas as idades e sexos, entretanto, a incidência é maior em crianças menores de dez anos e é crescente em indivíduos adultos nos casos de co-infecção Leishmania-HIV (vírus da imunodeficiência humana) (BRASIL, 2002b). Na Europa, mais de 70% dos casos de leishmaniose visceral em adultos estão associados com a aids e mais de 9% das pessoas com aids sofrem de leishmaniose recém-adquirida ou reativada. A partir da década de 80, a co-infecção passou a ser descrita na Europa, particularmente na Espanha, Itália e sul da França (BORGES et al., 1999). Na Europa, usuários de drogas intravenosas são considerados de maior risco para a co-infecção. Na aids, a leishmaniose acelera sua manifestação por um sinergismo imunossupressivo letal, e pela estimulação da replicação viral (WHO, 2007).
2.5 Imunidade e clínica
A imunidade é regulada geneticamente e mediada por células T do tipo CD4+ e CD8+ (GOTO e LINDOSO, 2004). A resistência à infecção está relacionada com a proliferação de linfócitos B no sangue periférico e com a produção de citocinas relacionadas à estimulação antigênica do parasito. Os macrófagos infectados são destruídos por células CD8+ e CD4+ (BANETH, 2006). As células CD4+ são mais importantes nas duas primeiras semanas após a infecção, quando a multiplicação parasitária ainda está ocorrendo, principalmente na formação de granulomas hepáticos, porém posteriormente, essa população de células se reduz e é substituída por células CD8+, no momento em que o progresso da infecção é controlado (GOTO e LINDOSO, 2004).
Clinicamente, os cães se tornam apáticos, apresentam intolerância a exercícios, alopecia simétrica e progressiva e descamação seca. Pode ocorrer depressão mental, poliúria, polidipsia e vômitos em virtude de insuficiência renal, onicogrifose, neuralgia, poliartrite, polimiosite, lesões osteolíticas, demodicose, piodermite e manifestações decorrentes de infecções secundárias à imunossupressão como babesiose e erliquiose (BANETH, 2007). Estima-se que aproximadamente 50% dos cães infectados não apresentam sinais clínicos (FERREIRA et al., 2007).
O diagnóstico clínico da LVC é relativamente simples em cães sintomáticos, e um teste de alta especificidade geralmente é suficiente. O diagnóstico pode tornar-se mais complicado em cães assintomáticos e nos animais com poucos sinais clínicos, os oligossintomáticos. Nesses casos e para fins epidemiológicos é necessário um teste de elevada sensibilidade (GOMES et al., 2006). Os cães foram classificados por Mancianti e Meciani (1988) em assintomáticos, sem nenhum sinal clínico; oligossintomáticos, com adenopatia linfóide, leve perda de peso e pêlos opacos; e sintomáticos, com todos ou alguns dos sinais clássicos descritos anteriormente.
tratados, as mudanças nos títulos não estão correlacionadas com a remissão dos sinais clínicos. Alguns cães mantêm títulos altos durante o tratamento, mesmo que os sinais clínicos tenham desaparecido (FERRER et al., 1995).
O desenvolvimento de doença clínica depende muito da resposta imune mediada por linfócitos T, que interagem com os macrófagos parasitados (ROSYPAL et al., 2005). Estudos de cães sintomáticos provenientes do Mediterrâneo com LV revelaram que a ausência de resposta celular está relacionada com a diminuição dos níveis de CD4+ e altos títulos de anticorpos (GUARGA et al., 2000). Os anticorpos específicos opsonizam as formas amastigotas iniciando sua fagocitose pelos macrófagos (BANETH, 2006). Adicionalmente, os macrófagos infectados têm capacidade reduzida de interagir com linfócitos T, o que interfere na liberação de interferon-gama e destruição do parasito (ROSYPAL et al., 2005).
A análise das citocinas provenientes do sangue periférico de cães assintomáticos, mostram que eles desenvolvem resposta linfocitária do tipo T helper 1 marcada por crescente secreção de interferon-gama, fator de necrose tumoral e interleucina 2 (SANTOS-GOMES et al., 2002). A formação de imunocomplexos desencadeia vasculite generalizada, poliartrite, uveíte e glomerulonefrite, levando à insuficiência renal. Há também um componente autoimune relacionado ao processo, produzindo anemia e trombocitopenia. A leucopenia é conseqüência da aplasia medular severa que se desenvolve durante o curso da doença (BANETH, 2006). As células CD8+ também estão relacionadas à proteção contra a enfermidade e não foram observadas diferenças significantes entre a expressão de CD4+ e CD8+ em cães (ROSYPAL et al., 2005).
2.6 Diagnóstico
O diagnóstico era realizado pelo exame parasitológico da pele e/ou vísceras e pela detecção de anticorpos anti-leishmania por meio da reação de fixação do complemento. A fixação de complemento baseia-se no princípio de que os títulos de anticorpos fixadores do complemento são elevados em cães doentes e apesar de ser um método prático, apresenta a desvantagem de revelar certa taxa de anticomplementariedade (CUNHA et al., 1963). O diagnóstico indireto tem sido bastante empregado em inquéritos soroepidemiológicos e pode ser realizado por diferentes métodos como a reação de imunofluorescência indireta (RIFI), ensaio imunoenzimático (ELISA), aglutinação direta e fixação do complemento (MOREIRA et al., 2002).
2.6.1 Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI)
A RIFI é amplamente utilizada para detectar anticorpos anti-leishmania tanto para leishmaniose visceral quanto para leishmaniose cutânea. Mancianti e Meciani et al (1988) testaram soros de cães positivos para LV utilizando a RIFI, hemaglutinação indireta e imunoeletroforese, e constataram que a RIFI apresentou melhor especificidade e sensibilidade, detectando 100% dos cães infectados com L. infantum. A RIFI tem correlação com o teste parasitológico, porém, pode falhar em estágios iniciais da doença quando anticorpos da classe IgG ainda não são detectáveis. Apesar da RIFI apresentar elevada sensibilidade e especificidade, pode revelar reação cruzada no caso da infecção pelo Trypanosoma cruzi (ROSÁRIO, 2002). Pacientes humanos infectados por L. chagasi mostraram-se positivos quando foram utilizados antígenos de L. braziliensis e T. cruzi na RIFI, comprovando a presença de determinantes antigênicos comuns às enfermidades, explicando as reações sorológicas cruzadas (VEXENAT et al, 1996).
e nunca se torna clinicamente doente ou transmite o parasito. Caso houvesse uma boa correlação entre títulos de anticorpos e infectividade, a eliminação seletiva de cães removeria de maneira efetiva os animais responsáveis pela transmissão (DYE et al., 1993).
Na pesquisa conduzida por Ferreira et al (2007), de 20 cães infectados com outros patógenos como Trypanosoma cruzi, L. braziliensis, Toxoplasma gondii e Ehrlichia canis, a RIFI apresentou positividade em sete animais com doença de Chagas, dois com leishmaniose tegumentar e dois com erliquiose. O ELISA revelou reações positivas em quatro cães chagásicos, em três com leishmaniose tegumentar e em um com erliquiose. O teste de aglutinação direta (DAT) revelou apenas uma reação cruzada com erliquiose canina.
2.6.2 Teste Imunoenzimático (ELISA)
O teste imunoenzimático, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), consiste na reação de soros de cães com antígenos solúveis e purificados de Leishmania, obtidos a partir de cultura in vitro. Os anticorpos específicos das amostras se fixam aos antígenos e em seguida é adicionada uma anti-globulina de cão marcada com a enzima peroxidase, que se liga aos anticorpos presentes. (BRASIL, 2002b). Estudo comparativo entre os testes de ELISA e a RIFI demonstrou que de 30 amostras de soro provenientes de cães com cultura positiva, o ELISA detectou 27 positivos, e a RIFI apenas 12, o que mostra a possibilidade de falha na RIFI em detectar cães infectados, dificultando o controle da doença em áreas endêmicas. Comparativamente à RIFI, o ELISA é um procedimento mais rápido e simples, necessita de apenas uma diluição de soro, e é considerado mais sensível (CABRAL et al., 1998).
Muitas proteínas recombinantes foram desenvolvidas para tornar o diagnóstico mais acurado. A rK39 é a mais promissora, com elevada sensibilidade e especificidade , na leishmaniose visceral, pois não detecta anticorpos contra leishmaniose cutânea ou mucocutânea. Além disso, o ELISA rK39 tem grande capacidade de detectar anticorpos em pessoas imunocomprometidas, como na aids (SINGH e SIVAKUMAR, 2003). O ELISA rK39 é um ensaio relativamente simples e rápido, considerado uma alternativa para a RIFI, especialmente quando o objetivo é o diagnóstico de grande quantidade de amostras (GOMES et al, 2006).
Na pesquisa conduzida por Porrozzi et al (2007), o uso do antígeno rK26 e rK39 revelou alta sensibilidade na detecção de anticorpos em cães assintomáticos (94% e 100% respectivamente), enquanto que o antígeno bruto e o rA2 revelaram 88% e 70% de sensibilidade respectivamente. O rA2 foi mais sensível para cães assintomáticos que o rK39 e o rK26 (ambos 66%) e que o antígeno total (30%). Com relação à especificidade, a proteína rA2 forneceu melhores resultados (98%).
A fucose-manose ligante (FML) é um complexo glicoprotéico encontrado na superfície de promastigotas de L. donovani. O ensaio imunoenzimático com esse antígeno em estudo realizado por Cabrera et al (1999), revelou sensibilidade e especificidade de 100% em cães naturalmente infectados. A resposta pela RIFI foi muito inferior (2,9%) e similar ao número de cães com sintomas da doença (2,6%), comparada ao ELISA que revelou 23% de positividade. A glicoproteína GP36 é reconhecida de maneira específica no soro desses animais sugerindo alta sensibilidade do ELISA-FML comparada a RIFI na detecção de casos assintomáticos de L. chagasi.
Na pesquisa realizada por Ribeiro et al (2007), voltada para o diagnóstico da LTA, a sensibilidade para detecção de anticorpos IgG específicos anti-Leishmania pelo ELISA foi maior que a RIFI. O estudo enfatiza que antígenos utilizados no ELISA, quando homólogos, apresentam maior sensibilidade. O uso de antígenos de L. braziliensis mostrou maior sensibilidade, mesmo que ligeira, em relação ao uso de antígenos de L. chagasi. Falsos-positivos foram apenas 2,9% no ELISA IgG utilizando L. braziliensis, em cães com esporotricose.
clonados de genes de L. infantum são utilizados para produzir porções de proteínas antigênicas em bactérias, e muitas dessas são utilizadas como antígeno alvo em inquéritos epidemiológicos (GOMES et al., 2006).
O teste de ELISA possui algumas desvantagens, como resultados falsos negativos, que são normalmente de soros de cães assintomáticos ou os que estão na fase inicial da doença, pois o título de anticorpos pode ser muito baixo a ponto de não ser detectado. No entanto, o teste possui grande potencial para ser usado a campo pois é facilmente aplicável, por ser interpretado visualmente; todos os passos são conduzidos em temperatura ambiente e os seus reagentes são estáveis por um longo período de tempo (MANCIANTI et al., 1996).
2.6.3 Exame parasitológico direto
Dentre os métodos utilizados no diagnóstico da LVC, a identificação microscópica dos parasitos em esfregaços obtidos por punção de linfonodos, baço ou medula óssea constitue-se em método eletivo, podendo-se ainda utilizar o cultivo desse material em diferentes meios de cultura para isolamento do agente. A sensibilidade é maior quando se utiliza aspirado esplênico, porém o risco de hemorragia é grande (SINGH e SIVAKUMAR, 2003). Em estudo conduzido por Michalsky et al (2007), a positividade a partir do cultivo de baço, inclusive pós-mortem, foi maior quando comparada com o cultivo de aspirado de medula óssea e de fragmentos de pele.
negativo, e o isolamento a partir de meios de cultura é demorado (MANCIANTI e MECIANI, 1988).
Zivicnjak et al (2005) isolaram Leishmania spp de animais soropositivos que apresentavam alguns sinais clínicos, e também de animais assintomáticos. Esse aspecto é relatado por outros pesquisadores, e está relacionado à carga parasitária, sendo importante a associação de provas diagnósticas para a melhor interpretação de seus resultados. Métodos imunoistoquímicos são usados como ferramenta suplementar para confirmar o diagnóstico baseado em cortes histológicos corados por hematoxilina-eosina, particularmente em órgãos que não apresentam grande circulação de parasitos, todavia, são métodos invasivos, laboriosos e inadequados para inquéritos epidemiológicos (GOMES et al., 2006).
Além da presença de formas amastigotas nos órgãos, são evidenciadas alterações histopatológicas. Em estudo conduzido por Giunchetti et al (2008), foram caracterizados os perfis histopatológicos de linfonodos de cães infectados esclarecendo que a hiperplasia e hipertrofia desses órgãos foram as principais características observadas em cães assintomáticos, e a atrofia da zona cortical foi predominante em cães sintomáticos. A maior alteração imunofenotípica dos linfonodos durante o curso da doença é um aumento da freqüência de linfócitos T, particularmente de CD8+ e diminuição de linfócitos B do tipo CD21+. Muitas vezes as formas amastigotas não podem ser visualizadas, entretanto, a análise das células em esfregaços de linfonodos corados a base de Romanowsky, revelam macrófagos vacuolizados, proliferação linfoblástica, plasmocitose moderada e muitas vezes a presença de eosinófilos (MOREIRA et al, 2002).
Adicionalmente, o diagnóstico parasitológico pode ser estabelecido pelo cultivo dos parasitos presentes nos tecidos, em meios de cultura como de Novy-MacNeal-Nicolle (NNN) ou meio Schneider’s Drosophila ou ainda pela inoculação em hamsters (BANETH, 2006).
2.6.4 Reação em cadeia pela polimerase (PCR)
áreas endêmicas, os casos alóctones. As espécies de Leishmania presentes na América Latina pertencem a dois grupos taxonômicos. Um deles é o sub-gênero Leishmania, composto pela L. mexicana e L. amazonensis, responsáveis pela forma cutânea localizada ou difusa; e a L. chagasi, causadora da forma viscerotrópica no novo mundo. O outro sub-gênero, Viannia, compreende a L. braziliensis, L. panamensis e L. guyanensis, que causam lesões cutâneas e mucocutâneas. A variabilidade das espécies é estudada tradicionalmente por análise multilocus por eletroforese baseada em 15 enzimas. O polimorfismo dos aminoácidos é responsável pela mudança da mobilidade enzimática produzindo diferentes fenótipos. No entanto, a identificação das espécies leva de dois a três meses para ser concluída. Essa técnica requer o isolamento do parasito em meios de cultura, todavia, muitas formas promastigotas não se desenvolvem nos meios (GOMES et al., 2006).
Tanto as leishmanias como outros kinetoplastídeos, possuem uma complexa rede de moléculas de DNA circular dentro de uma única mitocôndria. O DNA mitocondrial do parasito representa aproximadamente 20% do DNA total celular e está organizado em rede discóide, onde milhares de minicírculos e maxicírculos interligados constituem 95% de sua estrutura. Cada minicírculo completo possui de 700 a 800 pares de bases, sendo que 200 pares correspondem a uma região conservada (DEGRAVE et al., 1994).
al., 2000). Ferreira et al (2008) realizaram PCR de material proveniente de swab conjuntival obtendo alta freqüência de positividade (de até 73,9%). Essa técnica é muito útil no diagnóstico da LVC e pode ser aplicada também no monitoramento de cães vacinados.
O diagnóstico sorológico de pacientes imunocomprometidos é de difícil interpretação, com muitos resultados falsos negativos. A PCR assume importância por revelar a presença do parasito em vários tipos de amostras, como sangue periférico, líquido ascítico e efusão pleural. Adicionalmente aos métodos clássicos para o diagnóstico da LV, como o parasitológico direto e cultura, a PCR é uma ferramenta importante que deve ser considerada pelos clínicos, que avaliam pacientes de áreas endêmicas (DIEHL et al., 2004).
Em estudo comparativo no qual foram utilizadas técnicas microbiológicas convencionais e PCR com iniciadores espécie-específicos, tomando como amostra biológica sangue periférico de pessoas imunocompetentes e imunocomprometidas, a PCR mostrou sensibilidade e especificidade elevadas em ambos os casos (ANTINORI et al., 2007).
Leontides et al (2002) pesquisaram pela RIFI e PCR em amostra de soro e de medula óssea de 73 cães saudáveis provenientes de área endêmica na Grécia. Na PCR obtiveram 46 (63%) amostras positivas enquanto que na RIFI apenas 9 (12,3%). As técnicas de PCR utilizadas para leishmaniose variam de acordo com os primers utilizados. Lachaud et al (2002) demonstraram que os iniciadores oriundos do cinetoplasto são mais sensíveis, principalmente o K13A-K13B e o RV1-RV2, detectando até menos de 10 parasitos por mililitro de sangue. Os primers provenientes do cinetoplasto provaram ser mais adaptados pois detectaram os parasitos em 100% dos cães soropositivos. A sorologia se mostrou ineficiente na detecção da LVC em um grande número de casos sintomáticos, enquanto que a PCR foi positiva em casos sintomáticos como assintomáticos.
endêmicas somente para L. braziliensis, a PCR é interessante por discriminar as espécies envolvidas, ser rápida, sensível, não necessitar de cultura dos parasitos, adequando-se principalmente ao controle epidemiológico, que necessita de resultados laboratoriais eficientes e rápidos (GOMES et al., 2006).
2.7 Controle
As medidas de controle de LV envolvem fundamentalmente o tratamento de casos humanos, borrifação de casas e peridomicílios com inseticidas de ação residual e identificação com eutanásia de cães sorologicamente positivos. Recomendam-se, também, o destino adequado do lixo e a remoção de entulho e da matéria orgânica do peridomicílio (BRASIL, 2002a).
Há necessidade de expandir as linhas de conduta e estratégias para o controle da leishmaniose visceral, pois apesar das medidas implantadas, os indicadores epidemiológicos revelam que ainda não se obteve impacto positivo no controle da doença (BRASIL, 2002b). Desta forma, estudos sorológicos de cães naturalmente infectados para obtenção de métodos diagnósticos que facilitem a realização de inquéritos epidemiológicos são úteis para se conhecer a distribuição geográfica da LVC no país (REIS, 2001).
Tendo em vista as dificuldades de controle e vigilância da doença, as ações têm se baseado em uma melhor definição das áreas de transmissão ou de risco. O novo enfoque visa incorporar a vigilância dos estados e municípios silenciosos, ou seja, sem ocorrência de casos humanos e em cães, para se evitar ou minimizar os problemas referentes ao agravo em áreas sem transmissão. Nas áreas com transmissão de LVC, após estratificação epidemiológica, as medidas de controle são individualmente distintas e adequadas. Entretanto, é de fundamental importância que as medidas usualmente empregadas no controle da doença sejam realizadas de forma integrada, para que possam ser efetivas (BRASIL, 2003).
animais são extremamente importantes para os seus proprietários tanto pelo aspecto de saúde pública como social que ele desenvolve dentro de uma família (BEAVER, 2005). Segundo Dietze et al (1997), a evolução das taxas de soropositividade em humanos no início e aos 12 meses em duas áreas, uma com eliminação e outra sem eliminação de cães, não revelou diferença significante entre elas.
Em estudo conduzido em um bairro de Teresina no Piauí, 34 lotes foram alocados aleatoriamente com quatro tipos de intervenção: uma com borrifação de inseticidas intradomicilar e de anexos; outra com borrifação intradomicilar associada à eliminação de cães soropositivos; outra com borrifação intradomiciliar, de anexos e eliminação canina e outra com apenas borrifação intradomiciliar. Em comparação com os lotes que receberam apenas borrifação intradomiciliar, a eliminação canina diminuiu em 80% a incidência da infecção. Por outro lado, a borrifação de anexos adicionalmente à borrifação intradomicilar com ou sem eliminação de cães ou com eliminação de cães não se associou significantemente à redução da soroconversão. Os resultados de trabalhos que abordam a eficácia da eliminação dos cães são ainda conflitantes, mostrando que há necessidade de estudos futuros relacionados a esta variável do programa de controle da LVC (COSTA et al., 2007).
Entretanto, apesar da eliminação dos cães infectados não ter sido claramente comprovada como eficaz no controle da doença, o risco para o homem - da manutenção de um cão infectado no domicílio, além da baixa eficiência dos protocolos terapêuticos - justifica, até o momento, o seu uso como método de profilaxia. Um dos maiores desafios para o aprimoramento das estratégias de controle é a identificação de cada elemento da cadeia epidemiológica, bem como seu impacto na transmissão (MESTRE e FONTES, 2007).
outras localidades, contribui para o risco de introdução e difusão da LVC nos municípios(REITHINGER et al., 2002).
Os programas continuados de educação sanitária são essenciais para a informação da população sobre a doença e para a ação conjunta entre a comunidade e os órgãos de saúde municipais (NUNES et al., 2005). Programas educativos devem ser implementados em escolas e associações de moradores, alertando a população para os sinais clínicos mais comuns da doença e para os métodos de prevenção(DNDI, 2007). A posse responsável de animais deve ser enfatizada, pois, mesmo em áreas endêmicas para a LVC, a taxa de reposição canina é extremamente elevada após a retirada dos cães positivos para eutanásia (ROSA et al., 2005). Em estudo realizado em Araçatuba-SP, área endêmica para LVC, estimou-se a reposição da população canina e analisaram-se também os motivos que levaram os proprietários a adquirirem ou não novos cães. Houve reposição em 44,5% dos casos, principalmente devido à necessidade de companhia ou guarda, enquanto que o temor da doença foi o principal motivo para a não aquisição de novos cães (NUNES et al, 2007).
Não se recomenda o tratamento de cães, pois há controvérsias em relação à cura parasitológica, a despeito da aparente cura clínica. Embora os sinais clínicos sejam minimizados ou eliminados após o tratamento, os cães podem permanecer ainda como fontes de infecção. Com efeito, na vigência de cães sorologicamente positivos, recomenda-se a eutanásia humanitária, segundo o Manual de Vigilância e Controle da Leishmaniose Visceral do Ministério da Saúde, 2003 (BRASIL, 2003).
A análise por PCR de amostras de pele, aspirados de linfonodo e de sangue de cães infectados tratados durante dois anos revelou que, em todos os animais, pelo menos uma das amostras foi positiva. Os cães apresentaram recidivas revelando PCR positivas em algum dos três tipos de amostras. Em animais clinicamente saudáveis, a análise da PCR de pele e linfonodos foram positivas (MANNA et al., 2004).
Verificou-se que a vacina produzida a partir de antígenos naturalmente secretados e excretados, facilmente purificados do sobrenadante de culturas de promastigotas de L. infantum, foi capaz de conferir 92% de proteção em cães residentes em área endêmica. Além disso, o uso dessa vacina para o tratamento de cães infectados resultou em melhora clínica duradoura. Esse tipo de antígeno resultou em aumento significativo dos títulos de IgG2 e, interessantemente, esses anticorpos não estão presentes em cães naturalmente infectados. Sugere-se, portanto, que cães incapazes de controlar a infecção por L. infantum não desenvolvem esse tipo de resposta imune humoral. Parece que o aumento dos títulos de IgG2 está associado com a expansão da produção de interferon-gama e interleucina-2 pelas células T helper1, promovendo, conseqüentemente, proteção e resistência (LEMESRE et al., 2005).
O protocolo de vacinação é composto por três doses, em intervalos de 21 dias entre as aplicações. A revacinação é feita um ano após a primeira dose e repetida anualmente, proporcionando a manutenção da resposta imune. O cão somente é considerado protegido 21 dias após a terceira dose da vacina. Portanto, é possível que se infecte durante o programa de vacinação, e até mesmo alguns dias após a terceira dose, caso seja picado por um mosquito infectado. Nesse caso, a vacinação não impede o desenvolvimento da doença ou o aparecimento dos sintomas. A resposta imune IgG-mediada é indistinta daquela induzida pela infecção natural, quando utilizadas técnicas sorológicas tradicionais para o diagnóstico. Todavia, atualmente estão sendo desenvolvidas novas técnicas baseadas em citometria de fluxo, capazes de diferenciar a infecção natural da vacinação por meio da distinção entre os títulos de IgG1 e de IgG2.
coleiras como método de controle complementar não foram conclusivos (GLASSER, 2005).
3 OBJETIVOS
Levando-se em consideração os aspectos apresentados os objetivos do estudo foram:
1. Comparar os resultados da RIFI, ELISA, exame parasitológico direto corado ao Giemsa a partir de punção aspirativa de linfonodos, bem como pela técnica de reação em cadeia pela polimerase (PCR);
2. Verificar a sensibilidade, especificidade e concordância dos exames utilizados, como contribuição para o controle da enfermidade, principalmente em áreas endêmicas.
4 MATERIAIS E MÉTODOS
Todos os procedimentos laboratoriais foram realizados nos laboratórios do Núcleo de Pesquisas em Zoonoses do Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública, da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Unesp de Botucatu - SP. O experimento foi aprovado pela Câmara de Ética em Experimentação Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – Universidade Estadual Paulista – Botucatu – SP, protocolo número 04/2006 CEEA.
4.1 MUNICÍPIO DE BAURU (ÁREA ENDÊMICA)
Segundo o IBGE, Bauru está localizado na região centro-oeste do estado de São Paulo, distante 345 km da capital, na latitude de 22º 18’ 54” S e longitude 49º 03’ 29” O (Figura 1).
FIGURA 1 Localização do município de Bauru no estado de São Paulo e do
Localizado numa altitude de 525 metros acima do nível do mar, possui clima tropical de altitude, com média de temperatura anual de 22ºC e índice pluviométrico de 1500 mm. Possui um território de 673,5 kilômetros2 de extensão fazendo limite com os municípios de Arealva, Reginópolis, Piratininga, Agudos, Pederneiras e Avaí (WIKIPEDIA, 2007a). Possui aproximadamente 350 bairros divididos em 8 administrações regionais (WIKIPEDIA, 2007b).
Os animais estudados na pesquisa eram provenientes de 36 diferentes bairros, de acordo com a Tabela 5.
4.2 BOTUCATU (ÁREA NÃO ENDÊMICA)
Segundo o IBGE, a cidade de Botucatu está localizada na região centro-sul do estado de São Paulo, na latitude 22º 52’20” centro-sul e longitude 48º 26’37” oeste) (Figura 2), numa altitude de aproximadamente 780 metros acima do nível do mar e possui uma extensão urbana de 154 km2. O clima é subtropical úmido, com invernos secos e verões chuvosos, mantendo um índice pluviométrico anual de 1.250 mm. A vegetação natural consiste de savanas e florestas ribeirinhas.
4.3 AMOSTRAS BIOLÓGICAS
As amostras foram colhidas de 100 cães capturados pelo Centro de Controle de Zoonoses (CCZ) do município de Bauru, sendo a maioria sorologicamente positiva para leishmaniose pelo método de ELISA, realizado no Instituto Adolfo Lutz (IAL) de Bauru-SP, e alguns deles fortemente suspeitos pelos sinais clínicos. As amostras que representaram os controles negativos foram colhidas de 100 cães recolhidos pela equipe do canil municipal de Botucatu-SP.
As amostras de sangue para obtenção de soro foram colhidas previamente à eutanásia e os linfonodos poplíteos foram retirados a seguir. As amostras foram refrigeradas e transportadas imediatamente para o laboratório onde foram processadas, sempre no mesmo dia da coleta. As eutanásias dos cães foram realizadas pelos médicos veterinários responsáveis dos CCZs. Os animais foram canulados com scalp na veia cefálica, anestesiados com tiopental intravenoso na dose de 20 mg/kg e eutanasiados após atingirem plano anestésico profundo com 1 ml/kg de cloreto de potássio 19,1%.
4.4 COLETA DE SANGUE
A coleta de sangue foi procedida por canulação da veia cefálica utilizando scalp e uma seringa de 10 ml. O sangue foi, colocado em tubo sem EDTA, o qual foi armazenado em caixa térmica com gelo reciclável até o momento da centrifugação. Logo após a chegada no laboratório, as amostras foram centrifugadas a 3000 rpm durante 15 minutos para obtenção de soro, que foram armazenados em microtubos identificados a -20oC até o momento do processamento.
4.5 PUNÇÃO DE LINFONODOS
alterações locais nos membros pélvicos ou próximas a estes. A punção de linfonodos foi realizada no laboratório, em capela de fluxo laminar pré-esterilizada por 15 minutos com lâmpada UV, utilizando-se agulha 30X7, fazendo-se movimentos de leque para a retirada de maior quantidade de material possível. Após a punção, o material foi depositado em microtubos estéreis contendo 1,5 ml solução salina tamponada (PBS) estéril pH 7,2 e armazenados a -20oC até o momento da extração do DNA para a realização da reação em cadeia pela polimerase.
4.6 EXAME PARASITOLÓGICO DIRETO
Com o material obtido da punção de linfonodos, foram realizados três esfregaços (squash) em lâminas com extremidades foscas identificadas como A, B e C. A seguir, foram fixadas em metanol por 5 minutos e coradas pela técnica de Giemsa por 30 minutos. As lâminas foram secas a temperatura ambiente e mantidas em laminários até o momento do exame. Inicialmente utilizou-se aumento de 40X para verificação da qualidade da lâmina e coloração. Em seguida foi procedida a pesquisa de formas amastigotas com aumento de 100X com óleo de imersão. O animal foi considerado parasitologicamente positivo quando apresentou pelo menos uma forma amastigota com núcleo, citoplasma e cinetoplasto visíveis e definidos. Para que o cão fosse considerado parasitologicamente negativo, foram analisadas as três lâminas em toda sua extensão. Após a pesquisa, as lâminas foram arquivadas.
4.7 EXAMES SOROLÓGICOS
4.7.1 RIFI
A seguir, foram lavadas em coplin com PBS 7,2 por 10 minutos, por duas vezes consecutivas, e depois secas em estufa. O conjugado espécie-específico foi diluído, segundo seu título pré-estabelecido, em solução de Azul de Evans a 20 mg% a qual foi previamente diluída em PBS 7,2 na proporção de 1:5. Foram distribuídos 10 µl de conjugado para cada diluição, incubando-se novamente a 37 oC por 30 minutos em câmara úmida. Procedeu-se nova lavagem em coplin com PBS 7,2 por 10 minutos, duas vezes consecutivas, secando-se em estufa. As lâminas foram montadas com glicerina tamponada pH 8,5, cobrindo-se com lamínula 24mmX60mm, examinando-se em microscópio de imunofluorescência com aumento 40X. Após a leitura dos controles, foi procedido o exame das amostras em teste, considerando como título final a maior diluição do soro em que ainda ocorria fluorescência completa na borda de pelo menos 50% das promastigotas.
O antígeno foi preparado a partir de formas promastigotas de L. major, mantidas em tubos rosqueados contendo 10 mL de meio LIT e cinco mL de meio NNN. O repique para manutenção da amostra foi realizado semanalmente. Foi avaliado o crescimento das formas promastigotas e do tubo que apresentou parasitos com melhor motilidade e em maior quantidade, repicou-se 0,5 ml para três novos tubos de meio, procedendo-se, assim uma nova passagem. Os tubos foram mantidos em estufa a 25oC. Em seguida, centrifugou-se 10 ml de LIT a 3000 rpm por 10 minutos. Desprezou-se o sobrenadante e adiciona-se de 2 a 3 ml de solução salina tamponada 0,01M pH 7,2, centrifugando-se novamente a 3000 rpm por 10 minutos, desprezando-se o sobrenadante. O processo deve ser repetido por mais três vezes. Os parasitos foram quantificados em microscopia óptica e utilizados como antígeno quando se obteve de 20 a 30 parasitos por campo.
4.7.2 TESTE IMUNOENZIMÁTICO (ELISA)
4.7.2.1 PREPARAÇÃO DO ANTÍGENO (L. major)
Os parasitos foram cultivados em 40 ml de meio LIT inoculados com 10 mL do repique de cultura anterior, durante sete dias em garrafa de ROUX de um litro, mantida a 25 oC na posição horizontal. O conteúdo da garrafa foi centrifugado a 3000 rpm por 10 minutos em tubo falcon. O sobrenadante foi desprezado e na seqüência foi adicionado 10 ml de PBS homogeneizando-se, centrifugando-se como anteriormente, repetindo-se essa operação por mais duas vezes. A seguir, o sedimento foi homogeneizado em 10 ml de PBS estéril e congelado a -20oC por 24 horas. As formas promastigotas suspensas foram mantidas a -80oC, até o momento da sonicação. Após o descongelamento, a sonicação foi realizada em ciclo de 50%, a 4oC por 30 segundos por seis ciclos, analisando-se ao microscópio para observar se as formas promastigotas foram quebradas em pequenos fragmentos. O material obtido foi imediatamente centrifugado a 5000 rpm por 15 minutos sob refrigeração a 4oC, e o sobrenadante resultante foi utilizado como antígeno, no qual foi adicionado PMSF (Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride) 1mM, que é um inibidor de protease para a conservação das proteínas. Aliquotou-se em frascos para congelamento. A dosagem de proteína foi realizada pelo método de Lowry (1951). O antígeno foi testado com amostras de soro de cães sabidamente positivos e negativos, para testar sua viabilidade.
4.7.2.2 SENSIBILIZAÇÃO DAS PLACAS DE ELISA
com peroxidade (Sigma-Company USA), previamente titulado com soros e conjugado já conhecidos. Após o preenchimento de cada poço com 100µl da solução de PBSCT e conjugado, a placa foi incubada por 30 minutos a 37oC e a seguir lavadas com solução de lavagem por quatro vezes. Foram adicionados 100µl de substrato (5mg de -O-fenilenodiamino -OPD + 4µl de água oxigenada a 30% + 10ml de tampão citrato-fosfato) por orifício, e a placa foi mantida no escuro à temperatura ambiente por 10 minutos. Foram adicionados 30µl/orifício de ácido sulfúrico (H2SO4) 4N para interromper a reação. A leitura foi feita em leitor de ELISA a 492nm. Os resultados foram expressos em valores de densidade óptica (DO).
4.7.2.3 CÁLCULO DO PONTO DE CORTE
Utilizou-se a seguinte fórmula para o cálculo do ponto de corte:
CO = média CN x 2 x 1,2 Onde: CO = Cut-Off
média CN = média da densidade óptica dos orifícios do controle negativo 2 = fator de correção
1,2 = número multiplicado ao valor do cut-off para embutir a zona cinza no ponto de corte
O ponto de corte foi calculado para cada reação, utilizando os resultados das densidades ópticas obtidos de três controles negativos. Esse cálculo é utilizado para a realização do ELISA com o kit EIE-leishmaniose canina-Bio-Manguinhos, segundo o seu respectivo manual. Igualmente, Machado et al. (2007) utilizou o mesmo procedimento para calcular o ponto de corte. Como no presente estudo, Marchi et al. (2007) estabeleceram o ponto de corte do ELISA para cada reação realizada, utilizando a média aritmética de três controles negativos adicionada de um fator de correção.
a infecção por L. chagasi, em testes sorológicos e parasitológicos, e de 71 cães sadios, não infectados, provenientes de áreas não-endêmicas (AGUIAR et al.; 2007).
4.8 REAÇÃO EM CADEIA PELA POLIMERASE
4.8.1 EXTRAÇÃO DO DNA DAS AMOSTRAS
4.8.2 AMPLIFICAÇÃO COM OS PRIMERS LIN 19 E LIN R4
Foram utilizados 5 µl de tampão de PCR (Buffer 10X) (50mmol KCl, 10mmol de Tris-HCl), 1,5 U de Taq-polimerase, 10 pmol de cada primer (LIN R4 e LIN 19), 1,5 UI de MgCl2, e 15,2 µl de água ultra pura, 200mM de oligonucleotídeos e 10 µl da amostra em cada tubo de reação de 0,2 ml. Desta forma, utilizou-se 40 µl do MIX-PCR por amostra e 10 µl do produto de extração do DNA, totalizando um volume de 50 µl.
As condições de amplificação em termociclador (GeneAmp PCR System 9600) foram seguidas conforme descritas por Ikonomopoulos et al (2003), sendo a desnaturação inicial de 95ºC por 3 minutos, seguido de 32 ciclos a 95ºC durante 30 segundos, 58ºC durante 30 segundos e 72ºC durante 1 minuto e uma extensão final de 72ºC durante 7 minutos.
Para amplificação dos fragmentos de minicírculos de KDNA, foram utilizados os iniciadores LINR4 e LIN19, descritos por Ikonomopoulos et al (2003).
LIN19 5´ CAGAACGCCCCTACCCG 3´ LIN R4 5´ GGGGTTGGTGTAAAATAGGG 3´
transiluminador ultravioleta, com filtro de 300nm. Os géis foram fotografados utilizando o sistema fotográfico Polaroid. Foram utilizados como controles positivos produtos da amostra amplificada de Leishmania major, e como negativos o TNE (Tris-NaCl EDTA). Para o padrão de peso molecular, foi utilizado o DNA Ladder 100 pb.
4.8.3 AMPLIFICAÇÃO COM OS PRIMERS RV1 E RV2
As amostras que apresentaram resultado positivo na PCR utilizando os primers gênero específicos LINR4 e LIN19 foram novamente testadas com os primers espécie específicos para L. chagasi. Foram utilizados 5 µl de tampão de PCR (Buffer 10X) (50mmol KCl, 10mmol de Tris-HCl), 1,5 U de Taq-polimerase, 50 pmol de cada primer (RV1 e RV2), 1,5 UI de MgCl2, e 19,7 µl de água ultra pura, 200mM de oligonucleotídeos e 10 µl da amostra em cada tubo de reação de 0,2 ml. Desta forma, foi utilizado 40 µl do MIX-PCR e 10 µl do produto de extração do DNA, totalizando volume de 50 µl.
As condições de amplificação em termociclador (GeneAmp PCR System 9600) foram seguidas conforme descritas por Lachaud et al. (2002), sendo a desnaturação inicial de 94ºC por 4 minutos, seguido de 40 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 59ºC durante 30 segundos e 72ºC durante 30 segundos e uma extensão final de 72ºC durante 10 minutos.
Para amplificação dos fragmentos de minicírculos de KDNA, foram utilizados os iniciadores RV1 e RV2 descritos por Lachaud et al (2002).
RV1 5’ CTTTTCTGGTCCCGCGGGTAGG 3´ RV2 5´ CCACCTGGCCTATTTT ACACCA 3´
4.8.4 LIMIAR DE DETECÇÃO
Foi utilizada a amostra de Leishmania chagasi proveniente de repique em meio de cultura LIT e NNN, utilizada na rotina do Serviço de Diagnóstico de Zoonoses da FMVZ – UNESP Botucatu – SP. Foram pipetados 5 ml de meio LIT com formas promastigotas viáveis de dois diferentes tubos de cultura em tubo Falcon de 15 ml. O tubo permaneceu 15 minutos em banho maria a 56 oC para que as promastigotas permanecessem imóveis durante o procedimento de contagem. A amostra foi homogeneizada e parte dela utilizada para contagem dos parasitos em câmara de Neubauer. Foram procedidas seis contagens de cinco dos quadrantes menores, de maneira bem distribuída por toda câmara. A média obtida nos cinco quadrantes foi de 127 formas promastigotas. Para obtenção do número de parasitos por ml de meio de cultura foi utilizada a seguinte fórmula:
no de promastigotas contadas / 0,1 mm3.1. 0,2 = no promastigotas/ml
Sendo: 0,1 a altura da câmara de Neubauer
1 a diluição utilizada na contagem, ou seja, meio de cultura puro 0,2 o número de campos contados dividido pelo número total de campos (5/25)
Então:127/0,02 = 6.350 promastigotas/ml ou seja 6,35x103/ml
Para se obter valores em potências de 10, realizou-se regra de três para obtenção do volume de meio de cultura que possui 1000 formas promastigotas (103):
1 ml ---6.350 x = 0,1575 ml ou 157,5 µl X ml---1.000
produzindo concentrações 102, 101 e 100 formas promastigotas por ml de solução.
Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Cultura pura 842,5 µl água + 100 µl tubo 2 + 100 µl tubo 3 + 100 µl tubo 4 + 157,5 µl cultura 900 µl água 900 µl água 900 µl água 103 102 101 100
As soluções resultantes foram utilizadas para extração do DNA, utilizando o mesmo protocolo de extração das amostras dos aspirados de linfonodos e dos controles positivos. O DNA extraído foi amplificado com os primers LIN R4 e LIN 19, e RV1 e RV2 para que se pudesse obter a concentração mínima de parasitos por ml de amostra detectável nas provas.
Utilizando os primers RV1 e RV2, e LIN R4 e LIN 19, foi possível detectar até 10 parasitos por ml de solução, pois houve formação de banda até a amostra do tubo 4.
4.8.5 CONTROLE DE CONTAMINAÇÃO
O controle de contaminação foi feito utilizando amostras provenientes de meio de cultura com promastigotas de L. chagasi como controle positivo, amostras controles negativos de área não-endêmica e água livre de nucleases. Foi utilizado o produto Go Taq® Green Mater Mix (Promega) que é constituído de nucleotídeos, taq polimerase, cloreto de magnésio, tampão de PCR e tampão de corrida em proporções fixas. Foram utilizados para cada amostra 12,5 µl de green mix, 5,5 µl de água livre de nucleases, 1 µl de cada primer RV1 e RV2 ou 2,5 µl de cada primer LIN R4 e LIN 19 e 10 µl de amostra. Desta maneira, foi possível detectar contaminação nos iniciadores utilizados e desta maneira corrigir o problema.
formaram mais nas reações positivas e as bandas formaram-se da mesma forma que na diluição anterior (50 pmol/reação), exigindo uma concentração menor de primers.
4.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA
A sensibilidade (S), especificidade (E), falsos positivos (FP), falsos negativos (FN), verdadeiros positivos (VP), verdadeiros negativos (VN), valores preditivos positivos (VPP), valores preditivos negativos (VPN), probabilidade de falsos negativos (PFN) e a probabilidade de falsos positivos (PFP) foram calculados utilizando como modelo o esquema da tabela 2x2 (Tabela 1) e as fórmulas de acordo com Pagano e Gauvreau (2004).
TABELA 1 Esquema utilizado para a análise estatística referente a
sensibilidade, especificidade, valores preditivos positivos e negativos, probabilidades de falsos negativos e falsos positivos.
Doença
Resultado do teste Positivo Negativo Total
Positivo a (VP) b (FP) a+b
Negativo c (FN) d (VN) c+d
Total a+c b+d a+b+c+d
S = a/(a+c) E = d/(b+d) VPP = a/(a+b) VPN = d/(c+d) PFN = 1 – S PFP = 1 – E
