Resposta imunológica às infecções por nematoides gastrintestinais em

pequenos ruminantes

A resistência do hospedeiro aos nematoides inclui desde o início da resposta imunológica até a manutenção desta, que inclui a prevenção, redução de danos e até mesmo a eliminação da infecção, promovendo redução da carga parasitária efetiva quando comparado aos suscetíveis (KELLY; KAHN; WALKDEN-BROWN, 2013). A imunidade inata, constituída pelas as barreiras físicas ou químicas e, adaptativa, que se desenvolvem por meio de respostas imunológicas produzidas contra às infecções, impedem o parasitismo bem sucedido e também são englobados no contexto da resistência (SADDIQI et al., 2011).

Já a resiliência consiste na capacidade do animal em ser produtivo mesmo com os efeitos negativos da infecção, altos valores de ovos por grama (OPG) de fezes e manutenção das suas características físicas e hematológicas (SADDIQI et al., 2011; PEREIRA et al., 2016). Diversos estudos devem ser realizados a fim de definir melhor o papel do animal resistente e resiliente na produção, uma vez que esse papel ainda não é tão claro.

Os mecanismos do sistema imunológico envolvidos nesses perfis de resistência, resiliência e suscetibilidade em animais com mesmas condições de sobrevivência e mesma raça, ainda não são bem esclarecidos (STORILLO, 2016).O envolvimento dos linfócitos T CD4+_{, também conhecidos como T auxiliares ou T helper (Th), e seus}

respectivos conjuntos de subpopulações, tem se mostrado críticos para o desfecho clínico nas infecções por helmintos. Apesar de morfologicamente indistiguíveis, quando ativados, secretam distintos padrões de citocinas e, consequentemente, exibem diferentes mecanismos efetores (BELKAID; TARBELL, 2009).

Os linfócitos T CD4+_{, são subdivididos funcionalmente pelo padrão de citocinas}

que produzem e, quando ativados, de acordo com diferentes estímulos fornecidos, podem se diferenciar em diferentes subpopulações, de acordo com os fatores de transcrição ativados e, consequentemente, o perfil de citocinas que elas secretam. As primeiras subpopulações descritas foram Th1 e Th2, seguidas pelas subpopulações Th17e linfócitos T reguladores (Treg) (MESQUITA JÚNIOR et al., 2010).

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Os helmintos são parasitos que apresentam tamanho variado e diferentes estratégias de infecção nos hospedeiros vertebrados. São agentes que também impulsionam a evolução do sistema imune, devido força seletiva que exercem, em especial as respostas do tipo 2 (BOUCHERY et al., 2014). Alguns estudos sugerem que a doença clínica e impacto da infecção está relacionado com o desequilíbrio na resposta mediada pelas subpopulações Th2 (alta Th2) e Th1 (alta Th1), enquanto que a resistência e resiliência aparentam ser determinadas por um equilíbrio nas respostas mediadas pelas células Th1/Th2/Treg (BELKAID; TARBELL, 2009).

Atualmente, o conhecimento da diferenciação das células T em resposta aos helmintos vem sendo desafiado pela descoberta de padrões mais complexos, pois além de Th1, Th2, Th17 e Treg, alguns trabalhos tem mostrado o envolvimento de padrões mais complexos durante a infecção, como Th9 e Th22 (BOUCHERY et al., 2014).

Essa diferenciação pode ocorrer predominantemente pelas citocinas presentes no meio e pela interação com o receptor de célula T (TCR, do inglês T cell receptor) (BOYTON; ALTMANN, 2002). A célula apresentadora de antígeno (APC, do inglês Antigen Presenting Cells) exerce papel fundamental na diferenciação dos Linfócitos T devido aos estímulos fornecidos, tanto na apresentação do antígeno, quanto na expressão de moléculas co-estimulatórias, como na secreção de citocinas (ANSEM; SPILIANAKIS; FLAVE, 2009).

Compreender melhor os mecanismos fisiológicos, genéticos e imunológicos envolvidos na resistência do hospedeiro contra infecções causadas por helmintos é essencial (TOSCANO et al., 2018). A compreensão desses mecanismos levaria a possibilidade de novas abordagens terapêuticas e seletivas para um rebanho contribuindo com o melhoramento da produção e melhoraria o entendimento do papel dessas citocinas na resposta imune. Entretanto, os estudos de quantificação da resposta imunológica concentram-se, na sua maioria, em modelos murinos e trabalhos relatando a expressão dessas citocinas e seu papel na resposta imunológica em ovinos resistentes e suscetíveis a essas infecções são escassos, justificando, assim, a relevância de estudos nesta área.

1.3.1 Resposta Th1 e o papel em infecções contra helmintos em pequenos ruminantes

Para que ocorra a diferenciação das células T CD4+ _{em sua sobpopulação Th1 é}

necessário a presença da IL-12 secretada por uma APC e IFN-γ secretado por outra célula como Natural Killers (NK) ou Células Linfóides Inatas (ILC) tipo 1 (COELHO- CASTELO et al., 2009; ZHU; YAMANE; PAUL, 2010; CORDING et al., 2018). A IL-12 promove a ativação do fator STAT-4 (do inglês – Signal Transducer and Activator of Transcription) responsável pela expressão de diversos genes, incluindo IFN-γ, e o IFN-γ externo ativa o fator STAT-1 que induz ativação de T-bet responsável pela expressão do recepetor de IL-12 que potencializa a resposta por intensificar a produção de IFN-γ e antagonizar os mecanismos envolvidos na diferenciação em Th2 (ANSEM; SPILIANAKIS; FLAVEL et al., 2009; ZHU; YAMANE; PAUL, 2010).

A subpopulação Th1, juntamente com as células NK ativadas e macrófagos, são responsáveis pela produção do IFN-γ. Essa produção, juntamente com IL-12 e Fator de Necrose Tumoral Alfa (TNF-α), leva à ativação de outras células fagocíticas, sua potencialização e produção de elevados níveis de espécies reativas de oxigênio (EROs) e de nitrogênio (ERN) e, por esse motivo, estão envolvidas na imunidade celular contra patógenos intracelulares (BOYTON et al., 2002; COELHO-CASTELO et al., 2009; POLLARD; KNOLL; MORDUE, 2009; STURGE; YAROVINSKY, 2014).

A subpopulação Th1 também é caracterizada por secretar grandes quantidades de IL-2, citocina responsável por induzir a proliferação e aumentar a capacidade citotóxica dos linfócitos T CD8+ _{e também a proliferação dos próprios linfócitos T CD4}+

de maneira autócrina. Essa resposta é muito importante, principalmente contra micobactérias, protozoários e fungos (PARKIN; COHEN, 2001; MESQUITA JÚNIOR et al., 2010).

A resposta Th1 tem sido observada em infecções envolvendo helmintos e muitas vezes exibindo equilíbrio Th1/Th2 (ANTHONY et al., 2007). Em pequenos ruminantes, esse equilíbrio na resposta tem sido observado em animais resilientes. Por outro lado uma polarização da resposta Th1 é mais frequente em animais suscetíveis as infecções,

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devido a elevada produção de IFN-γ, menos anticorpos séricos e menos eosinófilos (ALBA-HURTADO; MUÑOZ-GUZMPAN, 2013; AMARANTE; RAGOZO; SILVA, 2014).

Apesar disso, alguns trabalhos mostraram que a resposta Th1 foi necessária para induzir imunidade contra algumas helmintoses como a hemoncose nos estágios iniciais, porém não se demonstrou eficiente para a manutenção da resposta (ALBA-HURTADO; MUÑOZ-GUZMPAN, 2013; SALES, 2016). Outros trabalhos, mostraram que a resposta Th1 estava associada ao perfil de suscetibilidade (PERNTHANER et al., 2005; CLAEREBOUT et al., 2005; MILLER; HOROHOV, 2006; LACROUX et al., 2006; CRAIG et al., 2007; INGHAM et al., 2008; ZAROS et al., 2014). A resposta Th2, além de proteger o hospedeiro contra a infecção, previne ou repara danos teciduais causados pela resposta Th1 (MAIZELS et al. 2004). Em contrapartida, o equilíbrio Th1/Th2 pode permitir a permanência do parasito no hospedeiro (COELHO-CASTELO et al., 2009).

1.3.2 Resposta Th2 e o papel em infecções contra helmintos em pequenos ruminantes

A subpopulação Th2 é caracterizada pela produção de importantes citocinas associadas a resposta contra helmintos e a alergia, tais como a IL-4 que induz a troca de classe de imunoglobulinas nos linfócitos B para IgE; IL-5 que induz a ativação e migração de eosinófilos e basófilos para sítios de infecção, sendo uma das citocinas que auxiliam na troca de classe de imunoglobulina para IgA, e IL-13 que estimula o peristaltismo e produção de mucinas pelas células caliciformes (MESQUITA JÚNIOR et al., 2010). A mastocitoce e a neutrofilia também tem sido observadas em alguns quadros de infecção por helmintos (ANTHONY et al., 2007; BAMBOU et al., 2013; BOUCHERY et al., 2014).

Este perfil, por sua vez, é ativado pela citocina IL-4, a qual promove a transcrição do fator STAT-6, responsável pela expressão do fator GATA-3 que pode diretamente ativar os genes da IL-4, IL-5 e IL-13, além de inibir os mecanismos de diferenciação do perfil Th1 pela presença de IL-4, e, portanto, são respostas antagonistas entre si (ANSEM; SPILIANAKIS; FLAVEL et al. 2009). Além disso, induzem a secreção de IL-10 e Fator de Transformação do Crescimento Beta (TGF-β – do inglês: Transforming Growth

Factor Beta) pelas células Treg (JACKSON et al. 2009). É importante também citar que a ativação do fator GATA-3 e secreção de IL-4, IL-5 e IL-13, também estão associadas as ILCs tipo 2 (CORDING et al., 2018).

Apesar dos macrófagos serem células convencionalmente associadas as respostas Th1 (MANTOVANI et al., 2005), vários estudos têm mostrado a presença de macrófagos ativados por estímulo de IL-4 e IL-13. Após a ativação, ocorre o aumento da expressão de arginase-1, receptor de manose (CD206) e receptor α para IL-4 (IL-4Rα) e as células são rapidamente recrutadas para os sítios de infecções durante as respostas Th2 (ANTHONY et al., 2007).

1.3.3 Resposta Th17 e Treg e o papel em infecções contra helmintos em pequenos ruminantes

Em estudos envolvendo camundongos, a subpopulação Th17 tem mostrado ser induzida pela presença do TGFβ, a qual induz a ativação de RORγt (ROR – do inglês: Retinoid-Related Orphan Receptor) e a IL-6, responsável pela fosforilação do fator STAT- 3. A IL-21 secretada age de maneira autócrina e contribui com a ampliação da resposta, e IL-23, secretada por APCs, estabiliza o perfil Th17 (PATEL; KUCHROO, 2015).

O perfil Th17 é caracterizado pela secreção de IL-17 e IL-22 e participam na defesa contra bactérias e fungos extracelulares, principalmente na superfície de mucosas (CHEN; LAURENCE; O’SHEA, 2007). Além desses agentes, alguns trabalhos tem associado a resposta Th17 em infecções contra helmintos (BABU; NUTMAN, 2012; LARKIN et al., 2012; BOUCHERY et al., 2014). A ativação de RORγt e secreção de IL- 17 e IL-22 também está presente nas ILCs tipo 3 (CORDING et al., 2018).

No curso da infecção, embora haja uma polarização para um determinado perfil de resposta, é evidente a existência de uma co-evolução, uma vez que a resposta final constitui um balaço entre os mecanismos celulares, humorais e secreção de citocinas pró e anti-inflamatórias (COELHO-CASTELO et al., 2009). Nesse sentido, diante tantos perfis de células T efetoras, é evidente a necessidade da regulação da resposta imunológica para um efetivo controle das infecções e prevenção do aparecimento de doenças

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autoimunes e, portanto, as células Treg exercem papel fundamental na manutenção da homeostase imunológica (VIGNALI et al., 2008; SHEVACH, 2009).

Esse sucesso está associado a secreção de citocinas anti-inflamatórias como IL- 10 e TGF-β produzidas especialmente por células Treg (KOUSER et al., 2017). A subpopulação Treg é ativada por IL-2, TGF-β e tetrinoína ou ácido retinóico trans (ATRA – do inglês: All-trans retinoice acid). A IL-2 induz a ativação de STAT5 que induz a expressão do fator de transcrição FoxP3 (Fox – do inglês: Forkhead Box), o qual tem uma importante função na manutenção deste perfil e secreção de IL-10 e TGF-β (KHATTRI et al., 2003; FONTENOT et al. 2005). ATRA e TGF-β são importantes por aumentarem a expressão de IL-2 e, consequentemente, aumentarem a expressão de FoxP3 (JETTEN, 2009).

As células Treg exercem função supressora sobre as respostas Th1 e Th2 devido a ação efetora das citocinas secretadas (KIM, 2007). As células dendríticas também estão associadas a essa supressão devido a produção de ATRA (IWATA et al., 2003; JETTEN, 2009). Além disso, as Treg também estão associadas a supressão de Th17 (MUCIDA et al., 2007; SUN et al., 2007). Essa supressão está associada a mecanismos dependentes de STAT-5, ativado por IL-2, os quais levam a inibição de RORγt e STAT-4 (IVANOV et al., 2007; LAURENCE et al., 2007; GU et al., 2008; SANJABI; OH; LI, 2017).

O TGF-β também é capaz de inibir a diferenciação de células Th2 por silenciar o GATA3 por meio da expressão do fator de transcrição SOX4. Essa regulação sobre Th1 e Th2 permite a manutenção da homeostase da resposta imunológica e previne eventuais danos decorrentes de severos quadros inflamatórios em resposta do agente (SANJABI; OH; LI, 2017). A IL-10, importante citocina conhecida no controle de respostas, além das Treg, também é secretada por outros tipos celulares como macrófagos, células dendríticas e Th2 (ANDERSON et al., 2007; COUPER; BLOUNT; RILEY, 2008; MITCHELL et al., 2017).

1.3.4 Resposta Th9 e Th22 e o papel em infecções contra helmintos em pequenos ruminantes

Outra citocina, tradicionalmente associada à resposta Th2, a IL-9, exerce efeito em diversas células como mastócitos, eosinófilos, células epiteliais e outras células T (NOELLE; NOWAK, 2010; WIHELM et al., 2012). Porém, já é descrito um subconjunto de células T CD4+ _{com capacidade exclusiva de secretar IL-9, sendo então chamado de}

Th9 (DARDALHON et al., 2008; VELDHOEN et al., 2008).

Essas células são distintas das células Th1, Th2 e Th17 (JONES et al., 2012; YAO et al., 2013). Desempenham papel protetor por atuarem contra tumores, alergias e autoimunidade (ANURADHA et al., 2016). Alguns trabalhos têm mostrado a importância da Th9 na resistência às infecções por helmintos em modelos animais por promover a expulsão dos parasitos (FAULKNER et al., 1997; FAULKNER et al., 1998; RICHARD et al., 2000; VELDHOEN et al., 2008).

Em relação a IL-22, tem sido observado a sua secreção por células T CD4+ na pele humana, chamadas então de Th22 (DUHEN et al., 2009; TRIFARI et al., 2009; EYRICH et al., 2009). Essa citocina, antes associada a resposta Th17, pode ser secretada por células T CD8+_{, NK, células Indutoras de Tecido Linfóide (LTi), ILCs tipo 3}

(SONNENBERG; FOUSER; ARTIS, 2011; CORDING et al., 2018). Envolvida, principalmente, na defesa contra infecções bacterianas, alguns trabalhos tem relatado a sua importância como mediador crítico na imunidade anti-helmíntica (TURNER; STOCKINGER; HELMBY, 2013). Alguns autores tem mostrado que a IL-22 fortalece barreiras epiteliais, medeia mecanismos de reparo e a cicatrização de lesões também em infecções envolvendo T. trichiuria e Necator americanus (BROADHURST et al., 2010; GAZE et al., 2012).

Nesse sentido, o papel da IL-9 e IL-22 não tem sido tão explorado em infecções parasitárias causadas por helmintos. Os trabalhos existentes mostram o papel dessas citocinas em humanos e camundongos. Nenhum trabalho foi encontrado evidenciando o papel dessas citocinas, juntamente com outros perfis de resposta, em ruminantes, em especial, ovinos.

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2. OBJETIVOS