UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA PARASITÁRIA
JORGE LUCAS NASCIMENTO SOUZA
PERFIL DE EXPRESSÃO DE CITOCINAS NO TRATO GASTRINTESTINAL DE OVINOS RESISTENTES E SUSCETÍVEIS A INFECÇÕES POR NEMATOIDES
Natal/RN 2020
PERFIL DE EXPRESSÃO DE CITOCINAS NO TRATO GASTRINTESTINAL DE OVINOS RESISTENTES E SUSCETÍVEIS A INFECÇÕES POR NEMATOIDES
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária, como requisito para obtenção do Título de Mestre em Biologia Parasitária na área de Epidemiologia e Controle de Doenças Infecciosas e Parasitárias.
Orientadora: Profª. Drª. Lilian Giotto Zaros de Medeiros
Natal/RN 2020
Souza, Jorge Lucas Nascimento.
Perfil de expressão de citocinas no trato gastrintestinal de ovinos resistentes e suscetíveis a infecções por nematoides / Jorge Lucas Nascimento Souza. - Natal, 2020.
100 f.: il.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária.
Orientadora: Profa. Dra. Lilian Giotto Zaros de Medeiros.
1. Animais de produção Dissertação. 2. Citocinas -Dissertação. 3. Expressão gênica - -Dissertação. 4. Resposta imune - Dissertação. I. Medeiros, Profa. Dra. Lilian Giotto Zaros de. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título.
RN/UF/BSE-CB CDU 636.03 Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN
Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Leopoldo Nelson - -Centro de Biociências - CB
PERFIL DE EXPRESSÃO DE CITOCINAS NO TRATO GASTRINTESTINAL DE OVINOS RESISTENTES E SUSCETÍVEIS A INFECÇÕES POR NEMATOIDES
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, para obtenção do Título de Mestre em Biologia Parasitária na área de Epidemiologia e Controle de Doenças Infecciosas e Parasitárias.
Aprovada em 06 de Março de 2020 Banca examinadora
Aos meus pais, João Câmara e Rosa Maria
Por sempre me guiarem e me ensinar a fazer sempre o certo;
Pelo exemplo de dedicação, amor e respeito com os filhos a ser seguido pelo resto da minha vida;
Por comemorar minhas vitórias como se elas fossem as próprias, até porque as aflições dessa fase eu não vivi sozinho. Obrigado por serem meus primeiros assistentes de laboratório.
Aos meus avós, Juvenal Ferreira e Sebastiana Penha (In memoriam)
Pelos momentos de felicidade, tristeza, aprendizado, amizade e, principalmente, amor; Por sempre me apoiarem e por desejarem ao máximo ver o neto mais velho chegando aonde chegou;
Por sempre me ensinarem que tudo na nossa vida, quando gostamos, tem que ser feito com muito amor e dedicação.
Aos meus familiares
Por sempre torcerem por mim;
Me empolgar com as perguntas, muitas vezes desafiadores, sobre a vida;
Me ajudar a observar melhor a vida como ela é, e consequentemente, me entusiasmar em sempre querer estudar mais a vida.
Aos amigos
Por serem meus psicólogos, amigos, irmãos e professores;
Por nunca me fazerem desistir e sempre me apoiarem, mesmo depois de ouvir as mesmas histórias;
Especialmente por sempre me deixar feliz nos momentos que mais precisei.
Em primeiro lugar, e sempre, agradeço ao meu bom Deus, ser supremo, pelo dom da vida. A ele que sempre me fortaleceu, extendeu a mão e sempre foi meu ombro nas horas mais difíceis. A ele que me concedeu forças, muita saúde e permissão para que eu chegasse até aqui, mesmo com todas as turbulências vividas, tornou-me merecedor e capaz de continuar e cumprir com mais uma etapa tão esperada e ao mesmo tempo árdua da minha vida.
Á minha mãe do Céu, Nossa Senhora, por sempre ter intercedido por mim em minhas orações e, com certeza, me ajudando nos momentos que mais precisei.
Não só a dedicatória, mas também agradecer a eles, que a vida toda fizeram o possível e o impossível por mim. Obrigado por serem meu principal alicerce. Com certeza estão mais que orgulhosos nesse momento. Aos meus pais João Batista e Rosa Maria, por sempre me aturarem, por suportarem meus estresses, por conseguirem tirar forças de onde não tinham mais ao presenciar minhas “quedas” e sempre me ajudarem a erguer com aquela persistência, por serem meus amigos, inimigos, motoristas, cozinheiros (naqueles dias após passar 12, 24 horas ou mais fora de casa, pela comida), heróis, companheiros, ouvintes e, principalmente, por todo amor e carinho ao longo de todos os anos, especialmente nos últimos meses, onde enfretamos juntos nosso maior trauma e maior dificuldade e, mesmo assim, continuamos firmes e fortes. Resumindo, por terem vivido o mestrado comigo. Além do bem mais precioso que os pais podem deixar para seus filhos: a educação. Amo vocês, hoje e sempre! Essa vitória, com certeza, não será só minha, será de vocês também.
Além deles, não poderia deixar de agradecer aos meus segundos pais, meus avós
Juvenal Nascimento e Sebastiana Penha (minha eterna alemã) – In memoriam – por
sempre serem os melhores exemplos que tive de força, garra e luta. Obrigado por sempre me ensinarem o que é ser nordestino de coração. Por terem dedicado boa parte de suas vidas a cuidarem de mim, a oferecem o que podiam oferecer, e sempre estarem presentes nos momentos mais felizes e mais tristes da minha vida. Obrigado por sempre me apoiarem com as minhas escolhas, obrigado por sempre me fazerem rir nos
momentos mais desesperadores da minha vida. E o principal, obrigado por terem contribuído com o ser que sou hoje. Levarei vocês para sempre no meu coração, onde quer que vocês estejam. Pena não estarem aqui para ver o primeiro neto se tornar mestre, mas essa vitória é de vocês também – Für immer.
Gratidão imensamente sem fim a minha orientadora Profª. Drª. Lilian Giotto
Zaros por ter sido mais que uma orientadora e exemplo de professora. Imensamente
grato por ter depositado toda sua confiança em mim, aquele garoto de somente 17 anos em 2014, que tinha tudo para ser só mais um aluno no laboratório e a senhora só a minha possível orientadora por um curto intervalo de tempo. Porém, de uma simples iniciação científica, hoje quase mais um mestre que a senhora forma. Sou imensamente grato por todas as oportunidades no departamento. Além de professora ganhei uma amiga, irmã, psicóloga, colega de laboratório e, principalmente, uma terceira mãe. Não tenho palavras para agradecer tudo que a senhora já fez por mim, apenas mostrar meu desempenho como quase mestre como consequência de toda formação desses últimos 6 anos. Como mãe acadêmica, mostrou-me o caminho, fortaleceu minhas escolhas, SEMPRE me aconselhou, foi a pessoa mais paciente do mundo, direcionou-me e me mostrou que cada vez mais nós somos capazes de conquistar nossos sonhos, basta querermos e ter força de vontade. Deu-me oportunidades que jamais eu esperaria adquirir ao longo da minha vida acadêmica. Sou eternamente grato por me proporcionar todas as experiências nas mais variadas áreas da biologia, pois além da parasitologia, mostrou-me o que é ser professor nos projetos de extensão e nas monitorias; mostrou-me o que é se desesperar por causa de 1mL de reagente e como ser um bom gestor de laboratório para que no final tudo dê certo (e no final eu realmente vi o quanto isso faz a diferença); mostrou-me o que é poder ser um “geneticista” com a biologia molecular e como tomar decisões difíceis podem ser mais fáceis do que esperamos, basta querer. Obrigado por me proporcionar momentos divertidos ao sentar na bancada comigo e me ensinar o que jamais outra pessoa ensinaria e por dividir desesperos, como não ter mais gelo para os procedimentos e improvisar em menos de 1 minuto. Além disso, me mostrar que biólogo, não é só ser biólogo, mas também é ser arquiteto, desenhista, engenheiro, psicólogo, administrador, contador e economista. Muitíssimo obrigado mesmo por sempre me apoiar, ensinar a
Não poderia deixar de agradecer a família LabHelminto e a todas as gerações que já passei pelo laboratório, em especial a minha primeira mestranda, minha querida zootecnista MScª. Fernanda Cavalcante por ter me acolhido de braços abertos e por sempre confiar em mim, além de ter sido uma das responsáveis pelo meu crescimento profissional e como pesquisador, por me mostrar o que é trabalhar em equipe e pela contribuição de seus dados para execução deste trabalho e ao biólogo Raí Lima e MScª.
Iasmim Mangabeira, pela companhia, companheirismo, trocas de experiência. A vocês,
meu muito obrigado.
Não poderia deixar de expressar minha eterna gratidão pela minha companheira de sempre, bióloga, e minha caloura do mestrado, Carlikelly Silva, por todo trabalho executado, por toda troca de experiência, por todas as conversas e companheirismo nas bancadas e nos congressos. O Brasil é nosso! Obrigado por me fazer sempre confiar em você e poder contar contigo sempre nos momentos mais difíceis na nossa jornada no LabHelminto.
Não podendo esquecer de todos os colegas que dividiram bancadas e diversos trabalhos comigo ao longo desse tempo: Ana keila, por sempre tirar meu juízo, pelas sobremesas nas reuniões, pelas conversas na copa do DMOR com as técnicas saboreando as suas receitas, por continuar comigo na jornada desde 2014 até 2017 no laboratório e pelas ligações na madrugada; À Elyelton Bezerra, um dos I.Cs que permenaceram no laboratório, pelos auxílios nas extrações de RNA aos finais de semana, por sempre colocar as músicas repetidas de Pabllo Vittar no ultimo volume do celular; Além dos novatos que chegaram a pouco tempo mas que com certeza me motivaram direta ou indiretamente, Karlinha, Naara, Rebeka, Lucas e Brenda.
Agradeço também a minha companhia desde meu inicio na jornada no lab em 2014, a zootecnista MScª. Jullyanne Batista (JullyAndrews) por tudo que precisei no laboratório, seja água destilada até aquele bom e velho conselho. Obrigado por me mostrar a rotina do laboratório, o funcionamento das coisas, pelos momentos e histórias mais engraçadas e por sempre me socorrer quando precisei. À uma das únicas biólogas do lab, Ana Beatriz (Béa) por sempre compartilhar comigo as aflições dos resultados dos
exames de fezes e as trocas de experiência com os ELISAs. As suas rizadas eram, com certeza, as melhores.
Não poderia deixar de agradecer ao LabHelminto sem falar da família “Anexo do DMP” mais conhecido também por “fofocão”. Obrigado a todas vocês pelas horas felizes e compartilhamento das angústias, sejam com as disciplinas ou com os momentos difíceis do laboratório. Vocês com certeza foram FUNDAMENTAIS em todos os momentos nessa jornada e nossos almoços (quando dava tempo), eram os melhores. À minha querida parasitologista, rainha da malária e da estética, a biomédica Brenna Melo que me acompanha desde a escolinha e hoje dividimos momentos felizes no mestrado. Gratidão por sempre estar ao meu lado, por sempre compartilhar experiências comigo e me ajudar sempre que necessário. Não esquecendo das nossas festinhas juntos para desopilar, com certeza era as melhores; Agradecimento sem fim a melhor microbiologista e parceira que eu poderia ter nos laboratório, a biomédica Isabela Fortaleza(Nardoni) por toda ajuda e horas extras nas bancadas na rotina da biomol. “Jorginho, tem certeza que tem alguma coisa aí?” “Jorginho, me ensina isso aqui” “Jorginho, pode rodar isso que eu compro seu almoço”. Não tenho palavras para agradecer toda ajuda com meus experimentos e pela organização do laboratório. Renê Descartes com certeza fará falta e nossas cantorias de “Dale, dale, dale, da-da-da-le. Quer maixx é?”. À grande parasitologista que tenho a honra de ser amigo, minha veterana em tudo, na biologia e no mestrado, MScª. Ramayana Brito (Ramayanê) por todas as discussões envolvendo imunoparasitologia, momentos felizes e de angústia. Nosso juramente de dividir sala no futuro como professores, ainda tá de pé.
Obrigado as queridas biomédicas da farmacologia Mayara Sâmala e Bia Martins pelas terapias chinesas, almoços, caronas e trocas de experiências. Não posso esquecer também dos lanches e salgados das quintas, FitDance e as festinhas no corredor. Vocês são 10.
Não poderia esquecer de vocês de forma alguma. A minha eterna turma do PPgBP 2018-2019, minha querida imunologista Ana Beatriz (Ãnaa), aos parasitologistas Nathan
e Wilo, aos entomologistas Francilene e Henrique, ao nosso microbiologista Carlos (Pamonha) e ao nosso anexo, Jucélia, minha metade que faltava. Não tenho palavras
nossa turma será lembrada pelo exemplo de dedicação, união e a turma dos momentos dificieis. “Se em mar revolto navegam os melhores marinheiros, em tempos difíceis são formados os melhores parasitologistas”. Amo vocês meus Biomphas famintus, o que os seminários das disciplinas separou, o cuscuz com melancia juntou. Especialmente os que nos deixaram na metade do caminho, mas com certeza fizeram parte de toda essa história, Rayssa, Thaís (Parasitulúgia) e Paulo.
Agradecimento especial a todos os professores do programa que contribuíram diretamente com todos os ensinamentos das mais variadas áreas das doenças infecciosas e parasitárias, em especial à Dra. Janeusa por me fascinar mais ainda com a imunologia e ser base para construção da minha dissertação, ao Dr. Paulo por ser uma grande inspiração no mundo da parasitologia e por todas as trocas de experiências, principalmente na disciplina do campo, e à Dra. Renata por me empolgar muito com a entomologia e tudo relacionado aos vetores e as ciências forenses. À Dra. Vânia por ensinar a beleza da hifa de um fungo, Dra. Celeste por sempre nos ensinar que o CLSI precisa estar atualizado e ao Dr. Josélio por nunca nos fazer esquecer a importância de uma vacina contra raiva e a história da raposa. Meu muito obrigado a todos vocês.
As técnicas do laboratório de ensino de parasitologia, Rízia, Eva e Rayanne, por sempre me socorrerem na hora de preparar soluções, por sempre segurarem a barra nas aulas práticas quando o monitor do horário (eu) não poderia estar presente por causa deste trabalho, e por sempre me incentivar e apoiar.
A técnica do Departamento de Biologia Celular e Genética, Mayara Madja, por sempre me fornecer água mili-q, gelo, potes para descarte e reagentes.
Ao Prof. Dr. Renato Motta Neto, por disponibilizar o Laboratório de Micobactérias (LabMic), e agora “Núcleo de pesquisas em Doenças infecciosas e parasitárias” o qual é responsável juntamente com minha orientadora, para a execução da extração de RNA, cDNA e PCR’s.
Ao Laboratório de Biologia Molecular e Genômica (LBMG), principalmente as minhas amigas e biólogas, Dra. Sinara Araújo, Dra. Danizinha Pinheiro Dra. Lela pela disposição em sempre me ajudar com o Nanodrop na hora de quantificar minhas quase
intermináveis amostras de RNA, muitas vezes aos finais de semana ou às 22:00 horas ou 23:00 horas da noite, ainda, no CB. E pelos auxílios nas análises de PCR em tempo real e pela troca de material, especialmente Syber.
A equipe do Laboratório de Biologia Molecular de Doenças Infecciosas e do Câncer (LADIC) por me receberem de braços abertos, em especial ao Prof. Dr. Josélio
Araújo, responsável pelo laboratório, por permitir usar o espaço para aprendizado de
técnicas em biologia molecular e corridas de PCR em tempo real; a minha biomédica favorita Hannaly Wana (Gam bichinha) por me auxiliar em quase todos os procedimentos, por estar sempre ao meu lado, pelas conversas de aquarianos e por dividir os momentos de angústias e felicidades com os resultados das corridas um do outro. Além da técnica Ingryd Câmara, pela disposição e auxílio com a execução das PCR em tempo real; A melhor doutoranda e pessoa mais calma que já conheci,
Joelminha pelas ajudas fundamentais na PCR em tempo real; A melhor I.C que eu
poderia conhecer e melhor companhia nos congressos, Raíssa (Raissinha) pelas conversas e trocas de experiências, com certeza você vai longe. Minha eterna I.C, atualmente mestranda da medicina tropical e minha grande inspiração,Anne (BB), por proporcionar novas experiências e tornar o dia de trabalho mais divertido e cheio de gordices, mesmo a distância agora.
A Profª. Drª. Fátima Souza, por sempre fortalecer meu aprendizado na parasitologia e pela experiência no estágio a docência nas turmas de Medicina e Enfermagem, por ser uma das inspirações dentro do departamento e pelas diversas caronas no final do dia.
Ao meu irmão Isaac Nascimento, por me ajudar e contribuir diretamente com a padronização das referências deste trabalho.
Aos meus amigos de infância (since 1996) e componentes do “casa do seu Zé”,
Liziane e Lorena Ramalho, Surayma Lohanna, Juliana Silva, Gillian Albino e Isaac Emanuel, por sempre me apoiarem, por sempre acreditarem em mim desde quando
éramos crianças que eu já falava em ser biólogo, e pela confiança nas perguntas “Jorge, você que é biólogo, que bicho é esse? Esse antibiótico aqui serve para dengue? Olha o resultado do meu exame? Descobre meu tipo sanguíneo? Jorge, meu cachorro tá assim. O que pode ser? Jorge, me ajuda com bioquímica? O que é Endolimax nana? Me ensina
“não posso por que estou no laboratório” ou “estou ocupado com o mestrado”, vocês são 10 e mais um ano estamos juntos, crescendo, brigando e aprendendo juntos.
Aos amigos que a vida foi trazendo ao longo do tempo, em especial Mizael
Barboza e sua mãe, tia Kátia Martins, por sempre tentarem me distrair em barra do rio
nas folgas e por sempre me acudirem em casa quando minha internet não funcionava e eu necessitava terminar de escrever minhas coisas. À Chiara Lima, Kennedy Júnior,
Cledson, Almir e Marília, por sempre me apoiarem e sempre nas madrugadas falando
frases bonitas de incentivo a sempre continuar. E óbvio, obrigado por sempre me entender quando eu dizia não (quase sempre) para nossas saídas e por sempre serem bons ouvintes, sempre da mesma história/drama.
Não poderia esquecer, de forma alguma, da mulher que depositou sua confiança em mim, mesmo sendo do primeiro período, apenas com 16 anos de idade, sem nenhuma experiência em laboratório, e logo de genética, para ser seu I.C, à minha primeira orientadora, e atualmente orientaora para a vida, Profª. Drª. Patrícia de Abreu, e pela equipe do eterno Lab. Malária Aviária (Mariangela, Marise, Harysson, Lidiane e
Jonatas). Obrigado pela paciência em me ensinar a pipetar, por me enganarem com a
água destilada, por me socorrerem quando me queimei com fenol, e por sempre me autodesafiar em prol do meu crescimento, a ser mais proativo com as coisas e a não ser tão dependente, a arriscar mais e me ensinar a confiar em mim mesmo.
Não só a Profª. Drª. Patrícia de Abreu, mas também a Profª. Drª. Raquel
Cordeiro, por ter sido uma extensão da minha primeira orientação, e pelo
aperfeiçoamento deixando pela Profª. Patrícia. Obrigado por confiar em mim, muitas vezes nos projetos de extensão ou nas apresentações de trabalho das oficinas de microbiologia nos congressos de educação. Obrigado por também me mostrar o que de fato é ser biólogo e cientista.
Agradecimento muito especial ao meu grande amigo MSc. Aquiles Sales. Agredecimento sem fim pelos ensinamentos e trocas de experiências na vida acadêmica e em PCR em tempo real. Obrigado por sempre me motivar a sempre querer mais e me incentivar a crescer e aprender mais. Outro presente também que o DBG me deixou e eu
não poderia deixar de agradecer pelos diversos momentos felizes à Maria Fernanda, outra pessoa que admiro muito e que com certeza vai longe. Saibam que a felicidade de vocês é a minha também. Meu muito obrigado.
Ao mestrando da bioinformática Pitágoras, que acabou se tornando um grande amigo, pelos auxílios nos desenhos dos primers e dicas com o primer blast. Ao IC
Luanderson Cardoso pelas ótimas risadas e momentos de descontração na copa e nos
corredores do departamento.
A todos da minha turma da licenciatura (especialmente Joanny, Mari, João
Matheus, Igo, Sara, Thauanna, Mia, Vitória, Dandara, Canejo, Jane e Kamila) que
me apoiaram demais e me ajudaram a conciliar o mestrado com a 2° graduação. Não tenho palavras para agradecer tudo o que vocês fizeram por mim.
Agradecimento especial a minha eterna turma da graduação da bio 2013.2 que sempre me apoiaram em seguir na carreira acadêmica. Com certeza, essa vitória é de vocês também.
A minha grande amiga Heminelly Holanda por também fazer parte dessa história sempre me apoiando e me acompanhando nas aventuras nos congressos. Aos meus futuros noivos Igor e Lanai por também proporcionarem momentos de descontração e palvras de apoio, terei muito orgulho de ser padrinho de vocês.
A todos da minha família que torcem muito por mim e sempre estão perguntando como andam as coisas. Vocês também foram fundamentais nesse processo.
Não poderia esquecer de forma alguma de uma pessoa da família fundamental, principalmente nessa reta final, onde mais precisei de alguém que estendesse a mão e me ajudasse, à minha tia Roseane (Ziane). Meu muito obrigado por ter estendido a mão e ter ficado do meu lado com toda boa vontade nesses últimos meses que mais precisei, e você sabe o quanto não tem sido fácil. Com certeza sem o seu apoio e boa vontade eu não conseguiria concluir a minha dissertação. Essa vitória também será sua. Obrigado por fazer por mim o que meus avós também sempre fizeram. Te amo incondicionalmente. Agradecimento especial aos funcionários do CB, seu Clóvis, Fátima (fatinha),
Lindaci, Shirley, seu Milton e Berg, os quais sempre me acompanharam desde as 6:30
às 22:00, muitas vezes às 00:00 ou mais e eu ainda perambulando de um lado para o outro nos corredores do departamento e sempre diziam: “força, Jorge. Um dia você chega
Obrigado por se preocuparem e perguntar se as coisas estavam dando certo. Vocês não sabem o quanto isso fazia diferença para mim.
Agradeço imensamente a esta instituição a qual faço parte, a Universidade
Federal do Rio Grande do Norte – UFRN, pela oportunidade de me formar como
bacharel em ciências biológicas, e agora licenciado e pelo mestrado. Obrigado por sempre oferecer um ensino de qualidade com grandes exemplos de professores a serem seguidos, e outros não. Não só ao corpo docente e a absurda qualidade, mas também a estrutura física, em especial aos laboratórios os quais tive oportunidade de estagiar e aprender e a diversidade de pessoas a qual convivi e tive oportunidade de aprender e crescer como ser humano. Sem eles e a experiência adquirida eu não estaria formado e nem muito menos executaria este trabalho.
Obrigado as gestões anteriores do governo federal (até 2015) Lula e Dilma por incentivar, não só a mim, mas outras pessoas a estudar. Obrigado pelos anos de investimento no Ensino Superior e por incentivar a pesquisa. Com certeza sem a minha iniciação científica eu não estaria aqui hoje como aluno de mestrado.
Por ultimo, mas não menos importante, a CAPES, Propesq e Proex por todo apoio financeiro ao longo desses anos. Eternamente grato aos animais experimentais por me ajudarem a dar mais uma resposta às muitas das perguntas que virão e por isso contribuírem com meu entusiasmo pela ciência e pesquisa.
A todos os envolvidos diretamente ou indiretamente neste trabalho Muito obrigado, de coração.
Se o fim é doce, o que importa se o começo amargo fosse? Bem está o que acaba
As infecções causadas por nematoides gastrintestinais levam a prejuízos na produção animal, em especial a ovinocultura, uma importante atividade socioeconômica. Compreender os mecanismos envolvidos na resposta imunológica desses animais a essas infecções são essenciais, uma vez que animais pertencentes a mesma raça e rebanho respondem de formas diferentes às infecções. A carência de trabalhos envolvendo essa diferenciação em ovinos leva a necessidade de compreender melhor esses mecanismos. Nesse sentido, o objetivo deste trabalho foi quantificar a expressão de citocinas (IFN-γ, TNF-α, IL-4, IL-13, IL-9, IL-22, TGF-β e IL-10) envolvidas na resposta imunológica a nematoides gastrintestinais de ovinos classificados fenotipicamente como resistentes e suscetíveis. Para isso foram utilizadas amostras do abomaso (AB), intestino delgado (ID) e grosso (IG) de 12 ovinos mestiços infectados naturalmente por nematoides gastrintestinais, sendo 6 animais resistentes e 6 suscetíveis. A partir dessas amostras, foi realizada a extração de RNA total dos tecidos, sintetizado o cDNA, que foi quantificado por qPCR para a determinação da expressão relativa, utilizando como controle, um gene referência para cada tecido (GAPDH, SDHA e RPL-19) e analisados pelo software REST©. Houve aumento na expressão de IL-4 e IL-13 em todos os tecidos do trato gastrintestinal do grupo resistente as infecções por nematoides comparado aos animais do grupo suscetível. No AB, ID e IG, respectivamente, houve aumento de 2,5x, 2,8x (P<0,017) e 1,3x para IL-4 e 1,1x, 1,3x e 7,0x (P<0,001) para IL-13. Por outro lado TNF-α e IL-9 foram associadas ao perfil de suscetibilidade à infecção, sendo mais expressos em todos os segmentos gastrintestinais dos animais suscetíveis. Nesse grupo, para AB, ID e IG, houve aumento de 1,1x, 5,3x (P<0,001) e 2,2x na expressão de TNF-α e 2,6x, 1,8x e 1,5x para IL-9, respectivamente. Em conclusão, IL-4 e IL-13 foram associadas ao perfil de resistência e TNF-α e IL-9 ao perfil de suscetibilidade. A expressão das outras citocinas variou nos diversos órgãos dos diferentes grupos, provavelmente em virtude da dinâmica e interação dos parasitos em cada tecido
ABSTRACT
Gastrointestinal nematodes infections cause losses in animal production, especially in sheep farming, an important socioeconomic activity. Undestanding the mechanisms involved in the immune response of these animals to these infections is essential, onceanimals belonging to the same breed and herd respond differently to infections. The lack of studies involving this differentiation in sheep leads to the need to better understand these mechanisms. In this sense the aim of this work was to quantify the expression of cytokines (IFN-γ, TNF-α, IL-4, IL-13, IL-9, IL-22, TGF-β and IL-10) involved in the immune response to gastrointestinal nematodes in sheep phenotypically classified as resistant and susceptible. Abomasum (AB), small (SI) and large intestine (LG) samples from 12 crossbred sheep naturally infected by gastrointestinal nematodes, 6 resistant (RG) and 6 susceptible (SG) animals were used. From these samples, total RNA was isolated from the tissues, cDNA synthesized and quantified by qPCR to determine relative expression, using na ideal reference gene for each tissue (GAPDH, SDHA and RPL-19) and analyzed by REST© software. There was increase in the expression of IL-4 and IL-13 in all tissues
of gastrointestinal tract in resistant group to nematode infections compared to animals in the susceptible group. In AB, SI and LG, respectively, there was an increase to 2,5x, 2,8x (p<0,017) and 1,3x to IL-4 and 1,1x, 1,3x and 7,0x (p<0,001) of IL-13. On the other hand, TNF-α and IL-9 were associated with the profile of susceptibility to infection, being more expressed in all gastrointestinal segments of susceptible animals. In this group, AB, SI and LG there was increase of 1,1x, 5,3 (p<0,001) and 2,2x in TNF-α and 2,6x, 1,8x and 1,5x of IL-9. In conclusion, IL-4 and IL-13 were associated with resistance profile and TNF-α and IL-9 with susceptibility profile. The expression of the other cytokines varied in the different organs of the different groups, probably due to the dynamic and interation of parasites in each tissue.
Figura 1. Ciclo de vida dos principais nematoides gastrintestinais que infectam pequenos ruminantes... 30
Figura 2. Organograma esquematizando as principais etapas da metodologia deste trabalho... 47 Figura 3. Contagem média de OPG (ovos/g de fezes) dos animais
pertencentes ao grupo resistente e suscetível durante 33 semanas de período experimental... 55 Figura 4. Resultado da carga parasitária a partir da recuperação dos
parasitos adultos na necropsia nos animais classificados como resistentes e suscetíveis... 57
Figura 5. Verificação dos produtos de RT-PCR em gel de agarose 2%. A primeira banda refere-se ao marcador molecular 100 pb ladder, a segunda ao gene alvo (A: IFN-γ; B: TNF-α; C: IL-4; D: IL-13; E: IL-9; F: IL-22; G: TGF-β; H: IL-10; I: GAPDH; J: SDHA; K: RPL-19) e a última ao branco.... 58
Figura 6. Curva de melting dos genes. O eixo y representa a primeira derivada negativa da fluorescência durante cada ciclo e o eixo x a temperatura de melting. Cada linha representa uma amostra cuja expressão foi quantificada. A: IFN-γ; B: TNF-α; C: IL-4; D: IL-13;
E: IL-9; F: IL-22; G: TGF-β; H: IL-10; I: GAPDH; J: SDHA; K:
RPL-19... 59
Figura 7. Curvas de diluição geradas a partir dos valores de Ct na PCR em tempo real para os iniciadores GAPDH, SDHA, RPL-19 e IFN-γ. Os resultados das análises de regressão (equações e valores de R2) e a eficiência de amplificação são mostrados à esquerda do
gráfico... 61 Figura 8. Curvas de diluição geradas a partir dos valores de Ct na PCR em
tempo real para os iniciadores TNF-α, IL-4, IL-13, IL-9, IL-22, TGF-β e IL-10. Os resultados das análises de regressão (equações e valores de R2) e a eficiência de amplificação são mostrados à
Figura 9. Razão da expressão gênica no abomaso para os genes referência GAPDH, SDHA e RPL-19 entre os grupos resistente (GR) e suscetíveis (GS) (GR/GS)... 63
Figura 10. Razão da expressão gênica no intestino delgado para os genes
referência GAPDH, SDHA e RPL-19 entre os grupos resistente (GR) e suscetível (GS) (GR/GS)... 63 Figura 11. Razão da expressão gênica no intestino grosso para os genes
referência GAPDH, SDHA e RPL-19 entre os grupos resistente (GR) e suscetíveis (GS) (GR/GS)... 64 Figura 12. Razão da expressão gênica no abomaso para os genes GAPDH,
IFN-γ, TNF-α, IL-4, IL-13, IL-9, IL-22, TGF-β, IL-10 entre os grupos resistente (GR) e suscetíveis (GS) (GR/GS) normalizados para o GAPDH... 65 Figura 13. Razão da expressão gênica no Intestino Delgado para os genes
SDHA, IFN-γ, TNF-α, IL-4, IL-13, IL-9, IL-22, TGF-β, IL-10 entre os grupos resistente (GR) e suscetíveis (GS) (GR/GS) normalizados para o SDHA... 66 Figura 14. Razão da expressão gênica no Intestino Grosso para os genes
SDHA, IFN-γ, TNF-α, IL-4, IL-13, IL-9, IL-22, TGF-β, IL-10 entre os grupos resistente (GR) e suscetíveis (GS) (GR/GS) normalizados para o SDHA... 67
Tabela 1. Genes, sequências dos iniciadores, tamanho do produto
amplificado e referência... 51
Tabela 2. Condições ideais para as reações de PCR em tempo real para cada
gene... 53
Tabela 3. Médias e observações máximas e mínimas da contagem de OPG
(ovos/g fezes) de cada animal pertencente ao grupo resistente e suscetível... 56
LISTA DE ABREVIATURAS
°C Graus Celsius
µL Microlitro
μg Micrograma
APC Célula Apresentadora de antígenos
ATRA Tetrinoína ou Ácido Retinóico Trans
CB Centro de Biociências
CD206 Receptor de manose
CEUA Comitê de Ética para Uso de Animais
CIP Controle Integrado de Parasitos
CLDN2 Claudina-2
cm Centímetros
Ct Ciclo limiar
DBG Departamento de Biologia Celular e Genética
DEPC Diethyl pyrocarbonate
DMP Departamento de Microbiologia e Parasitologia
DNA Ácido desoxirribonucleico
ECC Escore da Condição Corporal
ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay ERN Espécies Reativas de Nitrogênio
EROs Espécies Reativas de Oxigênio
FOXP3 Forkhead Box
GAPDH Gliceraldeído fosfato desidrogenase
GATA-3 Fator de transcrição para diferenciação de células Th2
GEFOR Grupo de Estudo em Forragicultura
GR Grupo resistente
GS Grupo suscetível
IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
ILCs células Linfóides Inatas
IRF4 Fator Regulador de Interferon 4
kg Quilograma
L1 Larva de primeiro estádio
L2 Larva de segundo estádio
L3 Larva de terceiro estádio
L4 Larva de quarto estádio
L5 Larva de quinto estádio
LabMic Laboratório de Micobactérias
LADIC Laboratório de Biologia Molecular de Doenças Infecciosas e do Câncer
LBMG Laboratório de Biologia Molecular e Genômica
LTi Células Indutoras de Tecido Linfóide
mg Miligrama
mL Mililitro
mm Milímetros
mRNA RNA mensageiro
ng Nanograma
NK Células Natural Killers
OPG Ovos por grama
pb Pares de bases
PCR Reação em cadeia da Polimerase
PGE2 Prostagladina E2
PIB Produto Interno Bruto
Pmol Picomol
PV Peso vivo
qPCR Quantitative Polymerase Chain Reaction REST Relative Expression Software Tool RN Rio Grande do Norte
RORγt Retinoid-Related Orphan Receptor RPL-19 L19 Ribosomal protein
RT-PCR Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction
RT-qPCR Reverse Transcription Quantitative Polymerase Chain Reaction SDHA Succinate dehydrogenase complex subunit A
Spp. Espécies
STAT Fator de transdução e ativação da transcrição
T CD4+ Linfócito T com marcador CD4+ T CD8+ Linfócito T com marcador CD8+
T-bet Fator de transcrição para diferenciação de células Th1
TCR Receptor de célula T
TGF-β Fator de Transformação do Crescimento Beta
Th Linfócito T helper
Th1 Linfócito T helperda subpopulação 1
Th2 Linfócito T helper da subpopulação 2
Th9 Linfócito T helper da subpopulação 9
Th17 Linfócito T helper da subpopulação 17
Th22 Linfócito T helper da subpopulação 22
Tm Temperatura de Melting
TNF-α Fator de Necrose Tumoral Alfa
Treg Linfócito T regulador
UAECIA Acadêmica Especializada em Ciências Agrárias
UFRN Universidade Federal do Rio Grande do Norte
1. INTRODUÇÃO... 24 1.1 Ovinocultura: importância econômica, perspectivas e problemas
associados... 1.2 Helmintose e biologia de nematoides gastrintestinais em ovinos... 1.2.1 Haemonchus spp. ... 1.2.2 Trichostrongylus spp. ... 1.2.3 Strongyloides spp. ... 1.2.4 Oesophagostosmum spp. ... 1.2.5 Trichuris spp. ...
1.3 Resposta imune às infecções por nematoides gastrintestinais em pequenosruminantes...
1.3.1 Resposta Th1 e o papel em infecções contra helmintos em pequenos ruminantes... 1.3.2 Resposta Th2 e o papel em infecções contra helmintos em
pequenos ruminantes... 1.3.3 Resposta Th17 e Treg e o papel em infecções contra helmintos
em pequenos ruminantes... 1.3.4 Resposta Th9 e Th22 e o papel em infecções contra helmintos
em pequenos ruminantes... 24 29 31 32 34 35 36 38 40 41 42 44 2. OBJETIVOS... 2.1 Objetivo geral... 2.2 Objetivos específico... 45 45 45
3. MATERIAIS E MÉTODOS... 3.1 Animais experimentais... 3.2 Extração de RNA total e Síntese de cDNA... 3.3 Escolha dos genes e desenho dos iniciadores... 3.4 Especificidade dos iniciadores e eficiência de amplificação ... 3.5 Reações de RT-PCR em tempo real (RT – qPCR)... 3.6 Quantificação relativa da expressão de RNAm... 3.7 Escolha dos genes referência...
46 46 48 50 52 52 53 54 4. RESULTADOS...
4.1 Avaliação fenotípica do perfil de resistência e suscetibilidade dos animais pelos exames parasitológicos... 4.2 Extração de RNA total... 4.3 Especificidade dos iniciadores... 4.4 Eficiências de amplificação... 4.5 Escolha dos genes referência... 4.6 Quantificação relativa da expressão de RNAm nos diferentes tecidos... 55 55 57 57 61 62 64 5. DISCUSSÃO... 68 6. CONCLUSÃO... REFERÊNCIAS... 77 78
1. INTRODUÇÃO
1.1 Ovinocultura: importância econômica, perspectivas e problemas
associados
Os ovinos se destacam como uma das primeiras espécies de animais domesticadas. A sua criação garantie carne, laticínios, lã e couro; sendo uma das principais fontes econômicas, alimentícia e de proteção contra intempéries do ambiente para a população. Devido a capacidade de adaptação a diferentes climas, relevos e tipos de vegetações, esses animais encontram-se amplamente distribuídos mundialmente, e, portanto, pode-se dizer que a ovinocultura está presente em praticamente todos os continentes (VIANA, 2008; SOUZA, 2011).
A ovinocultura configura-se como uma atividade de grande importância socioeconômica, especialmente nas regiões áridas e semiáridas do Brasil com concentração no Nordeste (MAGALHÃES, 2017; FERREIRA et al., 2019). Nacionalmente, são aproximadamente 17.976.367 cabeças, das quais 62% concentram-se na região Nordeste (IBGE, 2017). Respectivamente, Bahia, Ceará, Piauí, Pernambuco e Rio Grande do Norte são os estados com maior representatividade dessa atividade no país (MAPA, 2019).
A prática, cada vez mais em expansão e, com perspectivas positivas para o futuro, vem passando por transformações desde a década de 1990, graças ao aumento do poder aquisitivo, a abertura do comércio internacional, estabilidade monetária e uso de tecnologias que contribuem com o aumento significativo da produtividade, tornando-se um cenário favorável para o desenvolvimento da atividade (VIEIRA, 2007; VIANA, 2008; MAGALHÃES, 2017).
Além disso, a carne ovina possui alto valor biológico proteico e valores de colesterol e gorduras reduzidos em comparação à carne bovina e de algumas aves, o que também tem contribuído com o aumento do consumo nas últimas décadas (MUSHI et al., 2010; PESSOA et al., 2018). A produção ainda contribui com o melhoramento da dieta alimentar da população e, aumenta a renda do pequeno produtor, além de ser um
25
atrativo na ocupação de pessoas para mão de obra, contribuindo com a permanência na área, principalmente no Nordeste (AHID et al., 2007).
Dessa forma, a prática se expandiu para diversas localidades, até mesmo as quais não havia tradição e nem interesse nesse tipo de criação. A tendência é aumentar sua contribuição para a composição do Produto Interno Bruto (PIB) do agronegócio brasileiro (OLIVEIRA; MOURA; BARBOSA., 2011). Atualmente, do ponto de vista das articulações políticas, houve um avanço importante incluindo grande financiamento da retenção de matrizes ovinas (MAGALHÃES, 2017).
Entretanto, o desenvolvimento da criação de pequenos ruminantes é gravemente afetada por inúmeros fatores (SILVA, 2016), dentre eles, perdas significativas nos rebanhos decorrentes de patologias, como é o caso de infecções causadas por nematoides gastrintestinais, que leva a perda de peso dos animais e queda na produtividade, podendo evoluir para o óbito; causando considerável impacto econômico no setor de agornegócio (IDRIS et al., 2012; CHAGAS et al., 2013; TOSCANO et al., 2018). As regiões tropicais são as mais afetadas graças ao favorecimento das condições climáticas de inúmeras espécies de endoparasitos simultâneos e, no desenvolvimento do pasto (SANTOS; AHID; SUASSUNA et al., 2006; COSTA et al., 2011).
Em um sistema de criação, são necessários a adoção de um conjunto de medidas integradas de controle contra endoparasitoses gastrintestinais, das quais, quando associadas, devem ser capazes de controlar e conter a infecção no rebanho (SILVA, 2016). Essas medidas são definidas pelo Controle Integrado de Parasitos (CIP) e visam, principalmente, reduzir a infecção dos animais e, consequentemente, a contaminação da pastagem, sendo a mais utilizada, a administração de fármacos antiparasitários (COSTA et al., 2011).
Entretanto, na maioria das vezes, a prática é feita de forma inadequada. O uso indiscriminado de vermífugos vem sendo realizada com rápida alternância de grupos químicos sem orientação técnica e, sem levar em consideração a dinâmica populacional das espécies prevalentes na região nas diferentes épocas do ano. Isso contribui com o aumento dos custos com tratamento dos animais e prejuizos que podem chegar a bilhões. Além disso, o desenvolvimento de resistência parasitária é um dos principais fatores limitantes na produção animal e tem tido reflexo negativo nos índices produtivos e
obstáculo no controle estratégico das verminoses na ovinocultura, bem como o risco de que concentrações de resíduos químicos no meio ambiente, leite e carne desses animais, aumente (MOLENTO et al., 2004; YAMAMOTO et al., 2004; VIEIRA; CHAGAS; MOLENTO, 2009; SOUZA et al., 2012; LINO; PINHEIRO; ORTUNHO, 2016).
Já é comprovada a resistência desses parasitos a todas as principais classes de drogas existentes como os benzimidazois, salicilanilidas, organofosfatos, imidazotiazois, Lactonas macrocícilas e derivados de amino acetonitrila (SPINOSA; GÓRNIAK; BERNARDI 2002; DURO, 2010; ALMEIDA et al., 2010; SCZESNY-MORAES et al., 2010; VOIGT; SCHEUERLE; HAMEL, 2012; MCMAHON et al., 2013; CHANDRAWATHANI et al., 2013; PEREIRA et al., 2013; SCOTT et al., 2013; GEURDEN et al., 2014; WAGHORN; KNIGHT; LEATHWICK, 2014; LOPES et al., 2014; HOLSBACK et al., 2015; KOTZE; PRICHARD, 2016; SILVA et al., 2018).
No Brasil, por exemplo, a resistência a todos os grupos de anti-helmínticos já foi relatada nas regiões Sul (MATTOS et al., 2004; CINTRA et al., 2016), Sudeste (CRUZ et al., 2010; ALMEIDA et al., 2010), Centro-Oeste (DURO, 2010; SCZESNY-MORAES et al., 2010) e Nordeste (VIEIRA; CAVALCANTE, 1999; MELO; BEVILAQUA; REIS, 2009; COSTA et al., 2011; ZAROS et al., 2014; SILVA, 2016).
Novas estratégias de controle vem sendo adotadas, dentre elas, a seleção de hospedeiros resistentes ou resilientes às infecções (BRICARELLO et al., 2008; ZAROS et al., 2014). Devido a diferenças genéticas existentes entre os animais, sejam eles pertencentes ao mesmo rebanho e/ou da mesma raça, podem responder de formas diferentes as infecções contra nematoides gastrintestinais, podendo ser classificados como resistentes, resilientes ou suscetíveis as infecções e, por isso, a seleção desses animais é uma importante estratégia de controle (SOTOMAIOR et al., 2009; PEREIRA et al., 2016). Essas diferenças no perfil de resposta pode resultar na rápida eliminação de agentes desprovida de grandes danos, eliminação com danos próprios, coexistência benigna ou ausência de resposta (ZAROS et al., 2007).
Os animais além de não ficarem debilitados, nem necessitarem de grandes quantidades de vermífugos, eliminam menos ovos, o que diminue as taxas de infecção por levar à redução da contaminação larval das pastagens e, consequetemente, beneficia
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todos os animais independentemente do seu estado de resistência (PEREIRA et al., 2016).
Por isso, a seleção de linhagens resistentes às infecções, além de ser um fato bem conhecido como estratégia de controle na produção, tem sido uma alternativa considerada excelente e necessária (ZAROS et al., 2014; TOSCANO et al., 2018). Em ovelhas, algumas raças como as nativas da Flórida (Florida Native) ou nativas da costa do Golfo (Gulf Coast Native) (AMARANTE et al., 1999; MILLER et al., 2006) e Maasai vermelho (Red Massai) (MUGAMBI et al., 2005) tem exibido resistência as infecções.
No Brasil, alguns estudos mostram que a raça Santa Inês exibe maior perfil de resistência, seguida de Morada Nova e Somalis (COSTA; VIEIRA; PANT, 1986, AMARANTE et al., 2004; ZAROS et al., 2014; TOSCANO et al., 2018). Em contrapartida, o maior problema encontrado é que essas raças não possuem os mesmos índices de produtividade desejados quanto as raças suscetíveis (ALBA-HURTADO; MUÑOZ-GUZMÁN, 2013).
Numerosos fatores estão relacionados à resistência dos animais. Estudos relacionados ao sexo demonstram diferenças significativas, pois as fêmeas demonstram ser mais resistentes em relação aos machos devido aos diferentes hormônios que atuam sobre a imunidade. Enquanto o estrogênio exerce efeito estimulador da resposta imunológica, os andrógenos tem efeito oposto (SILVA, 2010; GUO et al., 2016).
Além disso, alguns fatores também estão relacionados a idade, pois animais mais jovens (até 12 meses) são mais suscetíveis em relação aos adultos. Atribui-se esse fator, principalmente, às proporções de células de defesa serem menores em relação aos dos adultos, e também ao estresse relacionado ao desmame, que reflete nas respostas hormonais e, consequentemente, podem interferir mais ainda na proporção de células da imunidade (NIETO et al., 2003; SILVA, 2010; GUO et al., 2016).
Obter animais apenas resistentes às infecções dentro de um rebanho pode exercer pressão seletiva e ocasionar a seleção de parasitos mais resistentes aos fármacos usuais e mais patogênicos. Os animais resilientes não exerceriam essa pressão seletiva, porém permitiria alta contaminação das pastagens com ovos e altas taxas de reinfecção. Isso não seria um problema para um rebanho composto de animais resilientes e resistentes (STORILLO, 2016).
Alguns marcadores fenotípicos, como a determinação do volume globular (VG) a partir do hematócrito (COUTINHO et al., 2015), dosagem de citocinas e imunoglobulinas no soro, contagem de eosinófilos sanguíneos e teciduais (BRICARELLO et al., 2008) e contagem de ovos nas fezes (ZAROS et al., 2010; ZAROS et al., 2014; COUTINHO et al., 2015), são extensamente utilizados na avaliação do desempenho dos animais e para a determinação fenotípica para essa classificação (SOTOMAIOR et al., 2007; ZAROS et al., 2014).
Uma vez que, as endoparasitoses gastrintestinais, em especial as helmintoses, configuram-se como o principal desafio de criadores de pequenos ruminantes, torna-se fundamental conhecer a biologia desses nematoides, bem como as principais características dos principais grupos de parasitos que afetam a ovinocultura e sua biologia (SOUZA JÚNIOR, 2019).
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1.2 Helmintose e biologia de nematoides gastrintestinais em ovinos
As endoparasitoses gastrintestinais, em especial as helmintoses, as quais acometem pequenos ruminantes, são as patologias mais frequentes do sistema digestivo desses animais e uma das enfermidades mais comuns envolvidas nos altos índices de mortalidade (BARBOSA et al., 2011). As helmintoses são infecções parasitárias causadas por animais pertencentes ao grupo dos Plathyhelminthes (vermes achatados) e Nemathelminthes (vermes cilíndricos) sendo os nematoides os principais responsáveis pelas infecções parasitárias e os mais prevalentes afetando diretamente a produção animal (SOUZA, 2011; LINO; PINHEIRO; ORTUNHO, 2016).
Os parasitos do grupo dos nematoides (Filo Nematoda), são representados como animais de simetria bilateral, possuem três folhetos germinativos (Ectoderme, mesoderme e endoderme), pseudocelomados, sem segmentação verdadeira, cilíndricos e alongados com tamanhos variados, sistema digestório completo, corpo revestido de cutícula acelular, lisa e com estriações. Possuem sexos distintos (dioicos), sendo machos menores que as fêmeas, e possuem na extremidade posterior, bolsas copulatórias ou, em outros grupos espículos, enquanto que as fêmeas apresentam extremidade posterior afilada, caracterizando o dimorfismo sexual desses animais (MONTEIRO, 2010; TAYLOR; COOP; WALL, 2016).
Os ovinos, quando acometidos por esses parasitos, sofrem perdas significativas devido as elevadas taxas de mortalidade dos animais (COUTINHO et al., 2015). Além das perdas relacionadas com a morte dos animais, ocorrem também as perdas devido à redução da performance dos sobreviventes, pois podem ser parasitados em todas as faixas etárias e, isso pode interferir diretamente no desenvolvimento corporal, desempenho reprodutivo e produtivo (ZAROS et al., 2007; SILVA, 2016).
Outros sintomas associados a essa enfermidade são: redução do consumo de alimentos, o que interfere no desenvolvimento corporal, intensificando a perda de peso e atraso no crescimento, diminuição da produção de leite, altas taxas de mortalidade em infecções massivas, queda da fertilidade dos rebanhos, anemia, edema submandibular (popularmente conhecido como edema de barbela ou papeira) e diarreia (AMARANTE,
2005; CHAGAS et al., 2007; CAVALCANTE et al., 2009; SCZESNY-MORAES et al., 2010; BARBOSA et al., 2011; COUTINHO et al., 2015).
A maioria dos representantes desses nematoides possuem diferentes estádios larvais, sendo o primeiro chamado de L1, referente ao estágio que eclode do ovo e o segundo de L2, o qual se desenvolve no interior do bolo fecal. Ambos se alimentam de microrganismos e matéria orgânica no ambiente e compõem fase pré-parasitária de vida livre (URQUHART et al., 1998; TAYLOR; COOP; WALL, 2016; EMERY; HUNT; LE JAMBRE, 2016). Em condições ideais como temperatura, pH e umidade, as larvas de L1 e L2 (não infectantes, denominadas de rabdtoide), evoluem para L3 (infectantes denominadas de filarioide) quando infectam um novo hospedeiro a partir da ingestão das larvas presentes em vegetais ou água contaminadas com fezes de outro hospedeiro infectado (GARCIA, 2007; MONTEIRO, 2010). As larvas L3 apresentam cutícula proveniente do estágio anterior, cuja função é proteger contra alterações ambientais e impede a alimentação da larva, tornando-a dependente dos nutrientes acumulados anteriormente (ZAJAC, 2006; EMERY; HUNT; LE JAMBRE, 2016).
No momento que a larva infecta seu hospedeiro, a partir de sua ingestão, como acontece na maioria do ciclo dos nematoides de pequenos ruminantes, ela direciona-se até seu órgão de predileção para poder fixar-se evoluindo para L4 e, posteriormente, para L5, se tornando adulta, podendo reproduzir-se e continuar seu ciclo (URQHART et al., 1998; MONTEIRO, 2010; TAYLOR; COOP; WALL, 2016). (Figura 1).
Figura 1. Ciclo de vida dos principais nematoides gastrintestinais que infectam pequenos ruminantes
Fonte: https://pt.slideshare.net/gecoufba/haemonchus-apresentao-final-modo-de-compatibilidade/8?smtNoRedir=1
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Apenas 5% desses parasitos estão em seus hospedeiros pois os outros 95% encontram-se no ambiente na forma de ovos e/ou estágios larvais, o que contribui com o sucesso da disperção dos parasitos e aumento das infecções (BOWMAN et al., 2003). Esses dados se tornam preocupantes e reforçam que seja realizado um controle da contaminação larval no pasto, devido ao reflexo negativo (YAMAMOTO et al., 2004).
Os principais nematoides envolvidos nas infecções são pertencentes a classe Secernetea, ordem Strongylida, família Trichostrongylidae, em especial o Haemonchus contortus e Trichostrongylus colubriformis, pois além de mais prevalentes, são as espécies de maior patogenicidade (MORTENSEN et al., 2003; BENVENUTI, 2011). Além dessas espécies, na região semi-árida do Nordeste elas variam de acordo com o órgão de predileção do parasito, sendo as infecções ocasionadas por H. contortus e T. axei no abomaso; Strongyloides papillousus (Família: Strongyloididea), T. colubriformis, Cooperia sp. e Bunostomum trigonocephalum (Família: Ancylostomatidae) no intestino delgado e Oesophagostomum columbianum (Família: Cyatostomidae), Trichuris spp. (Família: Trichuridae) e Skrjabinema sp. (Família: Oxyuridae) no intestino grosso (VIEIRA; CHAGAS; MOLENTO, 2009).
No Rio Grande do Norte (RN), estudos realizados por Fonseca et al.(2013) notificam que H. contortus (57,23%), T. colubriformis (40,54%) e O. columbianum (1,42%) são os parasitos mais prevalentes. Um estudo mais recente realizado por Silva (2016), além de também encontrar esses parasitos, destacou a incidência de Strongyloides spp. (13,67%), mostrando que a diversidade de nematoides gastrintestinais no RN vem aumentando.
1.2.1 Haemonchus spp.
Os nematoides do gênero Haemonchus Cobb, 1898 são pertecentes a Subfamília Haemonchinae (HOBERG; LICHTENFELS; GIBBONS, 2004; TAYLOR; COOP; WALL, 2016). Na fase adulta parasitam o trato gastrintestinal de ruminantes, especificamente o abomaso e, podem ser visualizados a olho nu, pois, medem cerca de 1,0 a 3,0 cm (SILVA; RAGOZO; AMARANTE,2014). Além de ovinos, caprinos e bovinos, podem infectar outros
artiodáctilos como camelos, antílopes, girafas e cervos (HOBERG; LICHTENFELS; GIBBONS, 2004; TAYLOR; COOP; WALL, 2016).
Reúne espécies hematófagas, altamente prevalentes, patogênicas e de expansão global, sendo no Brasil e no mundo, H. contortus Rudolphi, 1803 a principal espécie envolvida em infecções de pequenos ruminantes, principalmente em regiões tropicais e subtropicais (ALMEIDA et al., 2010; SILVA; RAGOZO; AMARANTE, 2014; EMERY; HUNT; LE JAMBRE, 2016; REINIGER et al., 2017). São capazes de se alimentar de até 30 µL de sangue por dia. Em cargas parasitárias altas, o principal sinal clínico do quadro é anemia grave que pode evoluir para morte subsequente (EMERY; HUNT; LE JAMBRE,2016).
Associado a isso, podem ser observados perda progressiva de peso, inapetencia, hipoproteinemia, edema submandibular, gastroentetite catarral, crescimento tardio dos animais, diminuição da produção de leite e baixa fertilidade (GENNARI; AMARANTE, 2006; COUTINHO et al., 2015). Esta parasitose é considerada, economicamente, a mais relevante (CAVALCANTE et al., 2009; CHAGAS et al., 2013) uma vez que o Haemonchus é o parasito com mais relatos de resistência anti-helmíntica (ALMEIDA et al., 2010; CINTRA et al., 2016; REINIGER et al., 2017).
Dentre os outros nematoides que afetam a ovinocultura, H. contortus é o mais prolífero, e sua fêmea é capaz de liberar entre 5.000 a 15.000 ovos morulados que são eliminados junto com as fezes do hospedeiro para o ambiente. O período pré-patente, ou seja, o tempo decorrido entre a infecção do hospedeiro e a maturidade do parasito, ocorre entre 17 a 21 dias, podendo atingir períodos mais longos de até meses devido a hipobiose. Quando adultos, possuem tempo de vida curto, sobrevivendo por apenas alguns meses (URQUHART et al., 1998; EMERY; HUNT; LE JAMBRE,2016).
1.2.2 Trichostrongylus spp.
Os nematoides do gênero Trichostrongylus Looss, 1905 são pertecentes a Subfamília Trichostrongylinae (RODRIGUES, 2014). Reúne espécies importantes economicamente e são altamente prevalentes em ovinos, sendo o 2° gênero de
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nematoide mais encontrado. Entretanto, alguns estudos evidenciaram sua incidência como sendo maior em relação ao H. contortus (VOIGT; SCHEUERLE; HAMEL, 2012; MCMAHON et al., 2013; GEURDEN et al., 2014). Na fase adulta, não é possível visualizá-los a olho nu no conteúdo gastrintestinal, pois apresentam entre 4 mm a 12 mm (AMARANTE; RAGOZO; SILVA, 2014).
Possuem duas espécies importantes relacionadas as infecções no trato gastrintestinal de pequenos ruminantes, porém com baixa patogenicidade em relação ao gênero discutido anteriormente. A mais importante delas é T. columbriformis (Giles, 1892) Ransom, 1911 responsável por parasitar o intestino delgado (ALMEIDA et al., 2010) seguido do T. axei (Cobbold, 1879) Railliet & Henry, 1909, responsável por parasitar o abomaso, principalmente de bovinos, que apesar de apresentarem baixa intensidade de infecção em ovinos, já foram reportados casos em animais silvestres, equinos, burros, veados e coelhos (STRICKLAND, 2000; RAMOS et al., 2004; RALPH et al., 2006; SANTOS et al., 2011). Além disso já houve relatos de infecção em humanos, principalmente em agricultores que residem em áreas rurais com más condições sanitárias (ADAMS et al., 2005; EL-SHAZLY et al., 2006; GARCIA, 2007).
No estado do Rio Grande do Norte, ainda não foi registrada a incidência de T. axei nos estudos realizados (SOUZA et al., 2012), diferentemente dos estados do Rio Grande do Sul, Santa Catarina, Minas Gerais, Ceará e Bahia que apresentam elevada prevalência e menor frequência em São Paulo (AMARANTE; RAGOZO; SILVA, 2014).
No caso do T. columbriformis, vivem em túneis no epitélio das vilosidades localizados no terço inicial do intestino delgado. O parasito penetra na mucosa abaixo do epitélio, provocando exsudações de proteínas séricas e lesões no tecido. Ao formar esses túneis, os vermes podem causar necrose epitelial, alimentar-se desse conteúdo de células necrosadas e levar a quadros de anemia e diarreia a em infecções maciças, ou ocasionar hipoprotenemia (URQUHART et al., 1998; ANDRONICOS et al., 2012).
Definir uma sintomatologia específica para infecção por T. columbriformis torna-se limitada devido as infecções serem mistas e envolver outros parasitos no mesmo órgão como Cooperia e Strongyloides ou até mesmo parasitos em outros órgãos (VIVEIROS, 2009). Os principais danos causados estão relacionadas com atrofia das vilosidades, espessamento da mucosa e erosão do epitélio. Essas alterações levam ao
comprometimento da digestão e a absorção de nutrientes, resultando também em perda de líquidos tissulares levando a quadros diarreicos e inapetência em infecções massivas (AMARANTE; RAGOZO; SILVA, 2014).
1.2.3 Strongyloides spp.
Outro gênero de importância para os sistemas de criação de pequenos ruminantes, em que todas as espécies são fêmeas partenogenéticas e vivem na mucosa do intestino delgado dos hospedeiros, é o Strongyloides Grassi, 1879 (TAYLOR; COOP; WALL, 2016), e é o único dentre os parasitos de animais domésticos que apresenta alterações de gerações parasitárias e de vida livre (BOWMAN, 2010).
A espécie S. papillosus Wedl, 1856 é uma das mais importantes por apresentar adaptações climáticas ideais para o seu desenvolvimento nas pastagens e por este motivo, apresenta elevada prevalência no Brasil (CAVALCANTE, 2014). Pertence a Ordem Rhabditida, Superfamília Rhabditoidea, Família Strongyloididae (ANDRADE, 2010; ANASTACIO, 2011; RODRIGUES, 2014).
Diferentemente dos outros parasitos discutidos anteriormente, S. papillosus infecta o hospedeiro a partir da penetração ativa das larvas L3 nos tecidos do animal, iniciando então o seu ciclo parasitário até atingir a mucosa duodenal, especificamente as criptas de Lieberkühn, localizadas no intestino delgado, provocando uma série de sinais e sintomas que podem levar a morte súbita (ANDRADE, 2010).
A infecção, além da via percutânea ser a mais relevante na transmissão, também pode ocorrer por via oral e transmamária. As larvas L3 são capazes de penetrar ativamente no hospedeiro através da pele, especificamente aquelas que ficam mais em contato com o solo, comos os espaços interdigitais, abdômen, úbere e axilas. A partir da liberação de enzimas proteolíticas (proteases aspárticas e lisozimas) liberadas pelo parasito, é possível ocorrer a degradação de macromoléculas cutâneas, alcançando assim a circulação venosa e linfática (ANDRADE, 2010; KHUMPOOL, 2012).
Dentre os sinais e sintomas mais comuns da estrongiloidíase, destacam-se inapetência, retração abdominal, diarreia intermitente, prostração e pelos sem brilho.
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Além disso, em infecções massivas, é possível observar dermatite difusa, inflamação cutânea, edemas e urticária como sinais cutâneos e sinais pulmonares como taquipneia, tosse, estertores creptantes e, em alguns casos, quando favorecida por infecções bacterianas secundárias, surgem as pneumonias (TAYLOR; COOP; WALL, 2016). Ainda nessa situação, a estrongiloidíase pode levar a quadros de transtornos digestivos provocados pelo parasito adulto no duodeno e no jejuno. Esses quadros produzem alterações na digestão e absorção de nutrientes levando a atrasos no crescimento e perda de peso, além de ação tóxica devido a excreção de componentes que lesionam a mucosa e favorecem a entrada de bactérias evoluindo para um quadro de enterite severa (AMARANTE, 2005; ANDRADE, 2010).
1.2.4 Oesophagostomum spp.
O gênero Oesophagostomum Molin, 1861 é encontrado mundialmente, especialmente em países tropicais e subtropicais (URQUHART et al., 1998). Reúne espécies de parasitos não hematófagos de intestino grosso de ovinos, caprinos, bovinos e suínos (BROWN et al. 2007; DURO, 2010). São pertencentes a Família Chabertiidae, Subfamília Oesophagostominae (RODRIGUES, 2014).
As principais espécies desse gênero são O. radiatum Rudolphi, 1803, parasito de bovinos, e O. columbianum Curtice, 1890, prevalente em ovinos e caprinos (DURO, 2010). Esses parasitos apresentam grande patogenicidade e causam enfermidades agudas devido ao comportamento histotrófico das larvas, as quais são responsáveis por levar à formação de nódulos no tecido e, por este motivo, recebem o nome de vermes nodulares (AMARANTE, 2005; TAYLOR; COOP; WALL, 2016). Além disso, os principais sinais e sintomas observados são diarreia intensa com coloração esverdeada podendo apresentar estrias de sangue, apatia, anorexia e inapetência (URQUHART et al., 1998).
Os adultos são pequenos, sendo o macho menor que a fêmea, podendo chegar até 17 mm, enquanto que a fêmea pode chegar a 22 mm (TAYLOR; COOP; WALL, 2016). A formação dos nódulos ocorre quando as larvas L3 penetram na parede do intestino delgado e mudam a cutícula para o estágio L4 de cinco a dez dias após a infecção. Após
isso, as larvas que completam seu período de encistamento na parede do intestino delgado, retornam ao lúmen intestinal e migram para o intestino grosso onde algumas iniciarão a segunda fase histotrófica no interior da parede intestinal e, podem ter seu desenvolvimento comprometido devido a formação dos nódulos grandes caseosos, outras desenvolvem-se em adultos sem precisar migrar pelos tecidos desde que o hospedeiro tenha sido previamente sensibilizado (AMARANTE; RAGOZO; SILVA, 2014). Nesse sentido, a mesma larva em diferentes estágios de desenvolvimento pode ser responsável pela formação de dois tipos de nódulos em diferentes regiões do intestino. Poucas larvas dão origem aos adultos em infecções secundárias por permanecerem inibidas no estádio L4 no intestino delgado ou, quando completam essa fase, invariavelmente, entram na segunda fase histotrófica no intestino grosso. Dessa forma, nódulos caseosos são produzidos em reação a presença de larvas L4 sensibilizadas por uma infecção prévia durante a primeira fase histotrófica. As larvas contidas dentro dos nódulos morrem com o passar do tempo e o período pré-patente varia entre 35 a 39 dias nas infecções primárias e nas infecções secundárias de 46 a 47 dias (BRASIL, 2012; AMARANTE; RAGOZO; SILVA, 2014).
Os nódulos variam de tamanho e podem apresentar-se com cor amarelada, hiperêmicos ao redor e centro branco-acinzentados. Os parasitos tendem a ficar encapsulados devido a reação inflamatória exacerbada nos hospedeiros sensibilizados e, com o passar do tempo, esses nódulos caseificam-se e calcificam-se, acarretando em reação granulomatosa típica (EBERHARD; ALCARAZ, 2006; TESSELE; BRUM; BARROS, 2014).
1.2.5 Trichuris spp.
O gênero Trichuris Roederer, 1761 compreende os parasitos do ceco mais prevalentes em pequenos ruminantes independente da idade, sexo ou raça dos hospedeiros (KUCHAI et al., 2013). Desse gênero, as espécies T. ovis Abilgaard, 1795, T. skrjabini Baskakov, 1924 e T. globulosa Linstow, 1901, respectivamente, são as mais prevalentes em ovelhas e comumente encontradas em diversos países (KUCHAI et al.,
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2011; JEGEDE et al., 2015; YEVSTAFIEVA et al., 2018). No Brasil só há registros de infecção pelas espécies T. ovis, T. globulosa e T. discolor Linstow, 1906, sendo essas, respectivamente, as mais prevalentes (AMARANTE; RAGOZO; SILVA, 2014).
São conhecidos por whipworms, ou vermes de chicote, devido a extremidade anterior afilar-se brutalmente atingindo quase que o dobro do comprimento da extremidade posterior espessa (TAYLOR; COOP; WALL, 2016). Taxonomicamente, pertecem a classe Enoplia, ordem Trichocephalida, família Trichuridae (MELO; PINTO, 2016). Existem diversas espécies pertencentes ao gênero Trichuris capazes de parasitar não apenas animais de produção, mas também humanos, primatas não humanos, marsupiais, roedores e coelhos (RAVASI et al., 2012; CALLEJÓN et al., 2015; LEVECKE et al., 2015; ASMAREA et al., 2016; HILLMAN et al., 2017).
A infecção ocorre devido a ingestão de ovos contendo larvas infectantes presentes no solo ou nas pastagens. Os tampões dos polos (espiculos laterais) são digeridos e as larvas são liberadas e atigem o intestino grosso ou as porções finais do intestino delgado. Portanto, além do ceco, são capazes de penetrar nas glândulas das mucosas do íleo distal, cólon e, principalmente, o ceco, e lá desenvolvem-se até atingir a fase adulta onde permanecem com a extremidade anterior inserida nas mucosas (LIU et al., 2012; TAYLOR; COOP; WALL, 2016).
Geralmente a doença não exibe sintomatologia específica e são identificados incidentalmente durante exames de rotina ou em necropsia. Os quadros mais graves acontecem em ovinos jovens ou infecções massivas nos adultos (SINGH; LAL, 2011). Além disso, a permanência dos parasitos na mucosa não levam apenas a danos mecânicos, mas também a alterações histológicas importantes como infiltrado de linfócitos, descamação da mucosa, erosões e hipersecreção das glândulas intestinais, as quais, variam de acordo com a parasitemia (ILIEV et al., 2017). Apesar disso, em comparação as outras espécies de parasitos que afetam a os ovinos, T. ovis é uma das espécies de menor patogenicidade (BUZZULINI et al., 2007).
