TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS MULTIDIMENSIONAIS

A necessidade de atender áreas como a petroleômica, proteômica e metabolômica, e as crescentes exigências para adequada separação, identificação e quantificação de biomarcadores e metabólitos, promoveram uma grande sofisticação instrumental, elevando o poder de resolução para detecção e identificação destes analitos. Na análise de amostras com certo grau de complexidade por técnicas unidimensionais, o poder de separação muitas vezes é insuficiente ou, quando adequado, requer elevado tempo de processamento [81]. Por essas razões, o surgimento de novos sistemas multidimensionais promoveu um salto exponencial na capacidade de análise dessas matrizes [81, 82].

As técnicas multidimensionais podem ser definidas como aquelas onde dois sistemas de separação com seletividades diferentes são combinadas em série, o que aumenta a capacidade de separação, detecção e identificação dos constituintes de uma amostra [83]. Elas podem ser divididas em técnicas multidimensionais abrangentes e não-abrangentes.

Para que seja considerada abrangente, é necessário que, no mínimo uma fração representativa de todos os componentes da amostra sejam separados por duas técnicas de separação com seletividades diferentes, demonstrando assim um perfil distinto de retenção e também que percentagens iguais de todos esses componentes passem por ambas dimensões. Além disso é necessário que os analitos separados em uma das dimensões não sejam recombinados na dimensão seguinte, para que seja mantido o perfil de eluição observado na primeira separação [9, 84, 85].

Na cromatografia multidimensional não-abrangente apenas algumas frações da primeira dimensão são transferidas para o segundo sistema analítico, dessa forma, não representando os componentes da amostra em sua totalidade [86]. Dentre as técnicas de separação multidimensionais não-abrangentes, técnicas hifenadas como a cromatografia gasosa multidimensional de frações parciais (GC-GC ou HC/MDGC, heart-cut multidimensional gas chromatography) é frequentemente utilizada. A Figura 32 ilustra o esquema típico de um sistema GC-GC. Neste sistema, a amostra é introduzida na primeira coluna (também chamada de pré-coluna) e

arrastada por um fluxo de gás, sofrendo a primeira separação cromatográfica, até chegar a interface. Esta interface (modulador) transfere o efluente proveniente da primeira coluna para uma válvula limitadora de fluxo (capilar de restrição desativado), no qual conduz a amostra para um detector ou pequenas e restritas frações para a segunda coluna para que sofra uma segunda separação e chegue ao segundo detector [86, 87].

Figura 32: Típico sistema de cromatografia de frações parciais (GC-GC). ADAPTADO: Seeley (2012) [87].

O aumento da capacidade de separação da cromatografia multidimensional pode ser discutido em termo do incremento na “capacidade de pico” [88]. Idealmente a capacidade de pico de uma sistema unidimensional (1D) tem que exceder o número de analitos de uma matriz, o que raramente ocorre para amostras muito complexas, causando a sobreposição de picos e diminuição da qualidade da análise [9, 89]. Uma alternativa para minimizar este problema é a escolha de uma fase estacionária seletiva. Além disso, aumentar o comprimento e diminuir o diâmetro interno da coluna favorece a resolução dos componentes [90], porém, nessa situação, o tempo de análise aumenta bastante.

A análise multidimensional, proporciona aumento da capacidade de picos em relação a 1_{D. Se por exemplo, a capacidade de pico da} 1_{D for n}

1 e a capacidade

da segunda dimensão (2_{D) “heart-cut” for n}

2, a capacidade total de picos será dada

Injetor

Modulador

Detector 1 Detector 2

por n1 + n2 picos [84, 85]. Dessa forma, o plano de retenção contém maior capacidade,

adaptando-se a misturas um pouco mais complexas. A Figura 33 representa a capacidade de pico em sistemas cromatográficos convencionais, não-abrangentes e abrangentes.

Figura 33: Representação gráfica da capacidade de pico de sistemas cromatográficos convencionais, não-abrangentes e abrangentes.

As técnicas hifenadas do tipo GC-GC são efetivas para uma grande variedade de amostras, sendo que, as áreas que fazem maior uso deste modo de análise, são: petroquímica com a análise de componentes traços [91], albiental [92, 93], e farmacêutica [94, 95]. Porém, muitas vezes não são eficientes na separação de determinadas matrizes altamente complexas. Esses sistemas complexos são comuns em análise de petróleo devido a elevada diversidade estrutural e físico-química dos compostos biomarcadores. Nesses casos, faz-se necessário a utilização de técnicas multidimensionais mais avançadas e abrangentes, tais como a GC×GC.

A cromatografia gasosa bidimensional abrangente (GC×GC) foi inicialmente descrita por Liu e Phillips em 1991 [96], que descreveram um sistema

onde duas colunas com diferentes seletividades foram conectadas em série através de uma interface denominada modulador, que continuamente coleta, focaliza e reinjeta frações do eluato da primeira coluna na segunda coluna. Esta é considerada a maior inovação da GC após o desenvolvimento de colunas capilares em 1958, e desde o seu desenvolvimento é considerado uma das técnicas de separação mais poderosas, extensivamente aplicada na separação de matrizes complexas [82].

Os principais atrativos da GC×GC são: i) a elevada capacidade de pico; ii) o aumento do sinal dos analitos devido a reconcentração realizada pelo modulador e iii) a habilidade em produzir um cromatograma estruturado [82, 97]. A Figura 34 representa o sistema cromatográfico bidimensional abrangente.

Figura 34: Representação de um sistema típico e simplificado da cromatografia gasosa bidimensional abrangente. ADAPTADO: Liu e Phillips (1991) [96].

A separação e análise em um sistema bidimensional abrangente é muito mais poderosa do que em um sistema unidimensional ou multidimensional não- abrangente. Se a capacidade de pico da 1_{D for n}

1 e da 2D for n2, a capacidade total

de picos será n1 x n2 picos (Figura 33) [84]. Sendo assim, a capacidade de pico é

exponencialmente maior do que em sistemas unidimensionais ou multidimensionais tipo heart-cut. Além disso, a identificação é confiável já que cada analito apresenta dois tempos de retenção.

Uma boa estruturação do cromatograma é capaz de fornecer informações sobre classes de compostos (séries homólogas, isômeros, etc.) contidas nas amostras (geralmente aglomerados em regiões bem definidas, “clusters”) e fornecer informações qualitativas, já que é possível fazer uma análise visual de grupos de compostos e identificá-los com ajuda de um espectrômetro de massas [10, 82, 97].

Entretanto, para obter um cromatograma bem estruturado é preciso ter uma alta capacidade de pico, ortogonalidade, resolução e sensibilidade, além de uma boa otimização desses parâmetros. Idealmente, para que exista ortogonalidade é necessário que a separação na primeira coluna não seja correlacionada com a separação na segunda coluna [98]. Atenderá a este requisito sistemas multidimensionais que apresentem dois mecanismos de separação diferentes aplicados a toda a amostra [83, 99].

A configuração de um sistema GC×GC é relativamente simples quando considerado o incremento na resolução e detectabilidade [100]. As principais condições operacionais que devem ser otimizadas em GC×GC são o período de modulação ou frequência, escolha da fase estacionária e dimensões da coluna, programação da temperatura e configurações do detector [101].

O período de modulação ou frequência (PM) é o tempo que o modulador

leva para coletar, focalizar e reinjetar uma fração da amostra proveniente da primeira coluna para a segunda coluna e está relacionado ao tempo necessário para que os compostos sejam eluidos na 2_{D. Esse período tem que ser curto o suficiente para que}

a separação da primeira dimensão não seja perdida, ou seja, se o modulador não executasse sua função, quando os analitos separados na primeira dimensão percorressem a segunda coluna, os picos poderiam se sobrepor e coeluiriam, fazendo com que fosse perdido o principal requisito da GC×GC [101]. Além disso, o PM deve

ser constante em toda a corrida. Para não perder a separação, um pico deve ser no mínimo fracionado três vezes [102]. Por exemplo, se um composto demora 24 s para eluir da primeira dimensão, então o período de modulação deve ser de no máximo 8s.

A Figura 35 ilustra um experimento que demonstra a influência do período de modulação na separação cromatográfica [101]. Os autores utilizaram três diferentes períodos de modulação: 6s, 7s, 8s. Com período de modulação de 6s (A) os picos estão visualmente separados. Quando o período de modulação é alterado para 7s (B) e 8s (C), é possível visualizar a coeluição parcial e completa dos compostos, respectivamente. A sobreposição dos compostos é consequência do

longo ciclo de modulação que proporciona tempo suficiente para reunir dois picos parcialmente separados na primeira dimensão.

Figura 35: Influência do período de modulação na separação cromatográfica. Em (A) PM 6s com separação dos compostos; (B) 7s e (C) 8s respectivamente. ADAPTADO: Mostafa et al. (2012) [101].

O PM poder ser estendido de 2s até 12s. Utilizar um PM curto, é vantajoso

para aqueles compostos que não se sobrepõem na 1_{D, mas que tem o mesmo tempo}

de retenção na 2_{D, entretanto, sua maior desvantagem, é que períodos curtos, afetam}

compostos que tem maior interação com a 2_{D, podendo ocorrer picos fora do ciclo de}

modulação (wrap-around). Este fenômeno ocorre quando um composto apresenta um tempo de eluição na 2_{D superior ao período de modulação, fazendo com que a}

estrutura do cromatograma seja modificada. Este fato deve ser considerado um problema quando há sobreposição de picos, pois, a identificação torna-se praticamente impossível [101]. A Figura 35 no item A, ilustra um exemplo claro de “wrap-around” para o pico 3. A separação obtida na 1_{D deve ser mantida na} 2_{D, mas}

para que isto ocorra, o modulador tem que ser frio o suficiente para que compostos não escapem da coleta e saiam fora de ciclo.

Outro parâmetro a ser estudado são as dimensões da coluna. Para que a separação na primeira coluna não seja perdida, a separação na segunda dimensão deverá ser suficiente rápida para que as frações injetadas pelo modulador não se sobreponham. Para isto é necessário que o mecanismo de separação na 2_{D seja tão}

rápido quanto o período de modulação, ou seja, colunas muito longas, poderiam levar a sobreposição de compostos. Em geral, a primeira dimensão é sempre nas medidas que já eram utilizadas para a sua análise unidimensionais por GC [81]. A escolha das

dimensões da segunda coluna, dependerá da velocidade com que os analitos saem para o detector, mas em geral as dimensões variam de 0,5 m a 2,0 m de comprimento [81].

Além das dimensões do conjunto de colunas, o sucesso da separação por GC×GC depende diretamente das diversas fases estacionárias que as compõe. A otimização da fase estacionária para separações de misturas complexas, é praticamente impossível sem a prévia análise no sistema cromatográfico convencional. Isto acontece devido a imensidão de compostos com diversas estruturas e polaridades presentes em amostras complexas.

O conjunto mais utilizado em GC×GC é feito com fases estacionárias apolares + polares, ditas como conjuntos “normais”. Existe ainda os tipos reversos, menos utilizados, no qual o conjunto de colunas é composto primeiramente por uma coluna polar ou de alta polaridade, e uma segunda coluna apolar ou de média a baixa polaridade. A Figura 36 ilustra duas separações obtidas por um conjunto normal (A; apolar + polar) e um conjunto reverso (B; polar + média polaridade). Neste caso, a utilização de um conjunto reverso, proporcionou uma melhor resolução dos componentes aromáticos da amostra, permitindo a quantificação de analitos dentre as classes dos monoaromáticos e diaromáticos [103].

Figura 36: Separações cromatográfica utilizando um conjunto apolar + polar (a) e polar + apolar (b). ADAPTADO: Mondello (2011) [103].

Colunas do tipo de líquido iônico, estão sendo cada vez mais utilizadas principalmente por possuir um alto limite de temperatura e por sua fase estacionária ser de alta polaridade, que proporciona uma maior seletividade por manter interações específicas entre analitos de alta polaridade [104]. Diferenciando-se assim, das colunas polares normais que geralmente possuem baixo limite de temperatura [105]. Dessa forma, espera-se que seja altamente seletiva para alcalóides, flavonoides e compostos polares em geral e menos seletivas para terpenóides, por exemplo. Ragonese et al. (2012) [106], fez uma breve revisão sobre a utilização de colunas de liquido iônico para diversos tipos de análises por GC×GC, a qual observou que a maior eficiência deste tipo de coluna foi obtida para a análise de ésteres metílicos de ácidos graxos.

Apesar da elevada importância dos demais componentes da GC×GC, o modulador é considerado o coração da técnica, é a interface que interliga a 1_{D à} 2_D.

As principais funções de um modulador são: acumular continuamente ou “aprisionar” pequenas frações provenientes da primeira separação, também chamada de fase de coleta, reconcentrar (focagem) as frações eluídas no espaço ou tempo, e reinjetar estas frações com pulsos rápidos (frações de segundos) e periódicos na segunda dimensão [89, 98]. Normalmente a separação na segunda dimensão termina antes que a próxima fração reconcentrada é injetada [81]. Consequentemente, o modulador é o maior responsável pela eficiência da 2_{D (se os analitos não forem remobilizados}

de maneira rápida e eficaz, haverá um alargamento dos picos adicional ao causado pela segunda separação) [105].

O modulador pode estar localizado no final da 1_{D, no início da} 2_{D ou entre}

as duas colunas. Sua importância é tamanha, que na sua ausência, os analitos separados na 1_{D podem sobrepor-se na} 2_{D não obtendo a separação desejada. A}

Figura 37, ilustra o processo básico da modulação, no qual descreve desde a separação unidimensional, até a visualização de um cromatograma GC×GC. O primeiro passo (A), ilustra o processo de modulação no qual vários e rápidos cromatogramas são gerados pela 2_{D lado a lado de acordo com o período de}

modulação (B). O terceiro passo (C), é a transformação dos sinais em um gráfico bidimensional, no qual são representados os tempos de retenção da 1_{D (T}

r1) x tempo

de retenção da 2_{D (T}

r2) x intensidade do pico. A transformação do gráfico com os

tempos de retenção em matrizes é feita geralmente por um software e visualizada em forma de um gráfico de cores (F), de contorno (E) ou um gráfico tridimensional (D).

Figura 37: Ilustração do processo básico de geração de um cromatograma bidimensional. ADAPTADO: Dallüge et al. (2003) [81].

O modulador é a única peça responsável por injetar continuamente o eluato da primeira na segunda coluna e, desde seu surgimento em 1991 [96], assumiram vários formatos e tamanhos. Dentre eles, os que mais se destacam são os baseados em operações pneumáticas (válvulas e fluxo) [107, 108] e os térmicos (criogênicos) [109-112].

Os moduladores criogênicos são baseados na incidência de jatos quentes e jatos resfriados com nitrogênio líquido alternadamente sobre um capilar para a devida compressão da banda cromatográfica e remobilização para a 2_{D . Os}

moduladores de quatro jatos [111] e o modulador de loop [110] são os que mais se destacam nessa função.

Nos moduladores de quatro jatos (Figura 38), os dois estágios de modulação (aprisionamento e dessorção das bandas cromatográficas) são realizadas em locais diferentes, ou seja, no primeiro estágio inicia-se o ciclo de modulação pelo aprisionamento do eluato proveniente da 1_{D com incidência do jato frio enquanto que}

no segundo estágio ocorre a dessorção das bandas pela incidência de um jato quento (Figura 38 – 1). Em seguida, os jatos são invertidos e a incidência de um jato quente

no primeiro estágio faz com que a banda seja dessorvida e focalizada no segundo jato frio (responsável por comprimir a banda antes da remobilização para a 2_{D) (Figura 38}

– 2 e 3). Posteriormente, há novamente a inversão dos jatos e o eluato é remobilizado em uma banda estreira para a 2_{D (Figura 38 – 4). Sua maior vantagem está na}

eficiência em aprisionar os compostos bastante voláteis [113].

Figura 38: Ilustração simplificada do funcionamento de um modulador criogênico de quatro jatos. ADAPTADO: Hantao (2014) [114].

Os moduladores criogênicos de loop são capazes de aprisionar, comprimir a banda cromatográfica proveniente da 1_{D e remobilizar os analitos para a} 2_D

utilizando apenas dois jatos. Para isto, um capilar é posicionado entre as duas colunas e todo o processo de modulação acontece ali, em dois pontos distintos do capilar. O

1 D 1 D 1 D 1 D 2 D 2 D 2 D 2 D F F F F F F F F Q Q Q Q Q Q Q Q

primeiro passo é realizado pelo aprisionamento do eluato proveniente na 1_{D através}

da incidência de um jato criogênico (Figura 39 – 1). Em seguida, o jato quente é acionado para que ocorra a dessorção dos analitos para dentro da alça de modulação ou loop (Figura 39 – 2). A incidência dos jatos frio e quente é realizada alternadamente, até que a banda cromatográfica percorra todo o capilar e alcance a região de modulação onde serão aprisionados novamente (Figura 39 – 3) para posterior transferência para a 2_{D na forma de pulsos estreitos (Figura 39 – 4).}

Figura 39: Ilustração simplificada do funcionamento de um modulador criogênico de loop. ADAPTADO: Hantao (2014) [114].

Neste trabalho, foram realizados testes com moduladores criogênicos de 4 jatos e loop. Os equipamentos utilizados são protótipos desenvolvidos pelo próprio grupo de pesquisa, resfriados com nitrogênio líquido e aquecidos por resistências elétricas, no qual seus funcionamentos foram descritos nas Figuras 38 e 39.