TÉCNICAS

3.5.1 Avaliação do comportamento doentio

O comportamento doentio foi avaliado através da observação dos seguintes comportamentos: hipotermia, anorexia, anedonia, adipsia e letargia, utilizando a tabela de avaliação que consta no Apêndice A. A hipotermia foi determinada pela aferição da temperatura corporal com o uso de um termômetro digital auricular (G- Tech-Accumed)148_{. A anorexia foi avaliada através da pesagem dos animais, para}

determinação da variação do peso corporal, e da pesagem diária da ração ofertada aos animais, para terminação do consumo diário de ração149_{. A anedonia foi avaliada}

pela preferência do consumo de solução de glicose 1% ou água130_{, que foi}

determinado pela pesagem diária das duas garrafas de líquidos ofertadas (solução de glicose 1% e água) para a determinação do consumo (densidade do líquido de 1g/mL). A adipsia foi determinada pelo consumo diário de líquidos (água + glicose 1%). A letargia foi avaliada através da movimentação dos animais na caixa de alojamento, considerando três critérios: exploração do ambiente, fugir da mão do pesquisador e resistir quando pego137,138_{. As avaliações foram realizadas por dois pesquisadores}

simultaneamente para a confirmação dos sintomas clínicos de letargia e também para a melhor manipulação dos animais na realização das pesagens e aferição da temperatura auricular.

As avaliações do comportamento doentio também foram realizadas durante os dois dias prévios à indução de sepse, para a determinação do comportamento saudável dos animais e para que os animais estivessem aclimatados com a manipulação150_{. O comportamento saudável de consumo de líquidos e de ração foi}

determinado pelo intervalo de confiança da média dos dias prévios a indução a sepse. Cada animal foi avaliado diariamente utilizando a tabela de avaliação (Apêndice A) intercalando-se os grupos (sham e CLP). Sendo assim, os dados foram convertidos

para o sistema de pontuação do comportamento doentio aqui proposto (SBS; do inglês, Sickness Behavior Score), de acordo com a presença ou ausência de cada um dos parâmetros, conforme a Tabela 1. Ao apresentar um dos parâmetros de comportamento doentio, o animal recebeu um ponto, podendo, no máximo, receber seis pontos por avaliação.

Tabela1. Sistema de pontuação de avaliação do comportamento doentio criado (SBS; do inglês, Sickness Behavior Score).

Comportamento doentio Pontuação 1 Pontuação zero

Anorexia Não ganhar peso ou perder peso Ganho de pelo menos 1g

Peso corporal

Anorexia Consumo menor que o consumo

saudável

Consumo saudável* Consumo de ração

Anedonia Preferência pelo consumo de água Preferência pelo consumo da

solução de glicose 1% Preferência por glicose

Adipsia Consumo menor que o consumo

saudável

Consumo saudável* Consumo de líquidos

Febre/hipotermia Alteração da temperatura saudável Temperatura saudável**

Temperatura corporal

Letargia Diminuição dos movimentos, não

explorar a caixa ou não resposta a estímulos

Movimentação normal,

exploração da caixa e resposta a estímulos

Movimentação

*consumo saudável foi determinado pelo consumo médio dos animais previamente a indução da sepse.

** temperatura saudável foi determinada pela temperatura média prévia a indução da sepse.

3.5.2 Permeabilidade da barreira hematoencefálica

A avaliação da permeabilidade da barreira hematoencefálica (BHE) foi determinada pela quantidade de azul de Evans extravasado151_{. Todo o procedimento}

mg/kg) via intraperitoneal. Brevemente, 3 mL/kg do corante azul de Evans 2% é administrado na veia femoral. Após 1h os animais foram perfundidos a 110 mmHg com 250mL de solução salina 0,9% através do átrio esquerdo até que não seja observada coloração no átrio direito. A coloração das estruturas cerebrais é determinada por fluorimetria (excitação em 620 nm e emissão em 680 nm). Os resultados foram expressos em ng/mg de tecido cerebral.

3.5.3 Marcadores inflamatórios e de estresse

Foram dosados em soro e em líquor o marcador inflamatório IL-6 e o marcador de estresse, corticosterona em soro, utilizando a técnica de ELISA16,152–154.

Para a avaliação dos níveis de IL-6 em soro e em líquor, as amostras foram diluídas 1:2 com Assay Diluent RD1W e o protocolo da reação seguiu conforme as indicações do kit comercial IL-6 Quantikine ELISA (R&D Systems). A leitura foi realizada na absorbância de 450 nm em leitor de placa. Os resultados foram expressos em pg/mL.

Para a avaliação dos níveis de corticosterona no soro, as amostras foram diluídas 1:100 com Diluient M e o protocolo da reação seguiu conforme as indicações do kit comercial Corticosterone ELISA (Abcam). A leitura foi realizada na absorbância de 450 nm em leitor de placa. Os resultados foram expressos em ng/mL.

O peso da glândula adrenal foi avaliado como indicativo da ativação do eixo HPA102_{. Logo após a morte dos animais, foi feita a dissecação dos órgãos e a coleta}

da glândula adrenal. A pesagem foi realizada imediatamente após em balança analítica.

3.5.4 Marcadores de dano oxidativo

Foram dosados os seguintes marcadores para verificação do dano oxidativo nas estruturas cerebrais:

3.5.4.1 Dano aos lipídios

O dano aos lipídios foi quantificado pela determinação dos níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS)155_{. Brevemente, as amostras}

tricloroácetico 10% (Vetec) com centrifugação à 1.000rpm, por 10min. A reação ocorre ao adicionar ácido tiobarbitúrico (0,67%) ao sobrenadante e aquecido à 100°C por 30min. A absorbância foi determinada em 532nm em espectrofotômetro utilizando 1,1,3,3-tetrametoxipropano (Sigma-Aldrich) como padrão externo. Os resultados foram expressos em nmol de malondialdeído equivalente/mg de proteína.

3.5.4.2 Dano às proteínas

O dano oxidativo às proteínas foi quantificado pela determinação dos níveis de grupos carbonilas, através da reação com dinitrofenilhidrazina (Sigma-Aldrich)156_.

Brevemente, as proteínas foram precipitadas com ácido tricloroácetico 20% (Vetec) e redissolvidas em dinitrofenilhidrazina (Sigma-Aldrich). A absorbância foi determinada em 340nm em espectrofotômetro. Os resultados foram expressos em nmol/mg de proteína.

3.5.4.3 Nitrito e Nitrato (N/N)

A concentração de N/N foi determinada pela reação de Griess157_{. Brevemente,}

a reação foi realizada pela adição do reagente de Griess (0,1% naphthylethylendiamide dihydrochloride e 1% sulfanilamida, proporção 1:1; Synth) e cloreto de Vanadium(III) (Sigma-Aldrich) à estrutura cerebral previamente homogeneizada em tampão fosfato (Nuclear). Após 1h de incubação em temperatura ambiente ao abrigo da luz, a absorbância foi determinada a 540nm em espectrofotômetro. Os resultados foram expressos em nmol/mg de proteína.

3.5.5 Fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF)

Os níveis de BDNF nas estruturas cerebrais foram determinados por ELISA com anticorpo anti-BDNF80_{. As amostras de tecidos cerebrais foram homogeneizadas}

(Dounce Tissue Grinders, Omni International) em tampão fosfato salina (PBS) contendo: 0,05% Tween 20, 0,1 mM phenylmethylsulphonyl fluoride (PMSF), 10mM EDTA, 2 ng/mL Aprotinin e 0,1 mM Cloreto de benzetônio. Os homogenatos foram centrifugados por 10 min, em 6900 rpm, a 4 °C. O protocolo da reação seguiu conforme as indicações do kit comercial Human/Mouse BDNF DuoSet ELISA (R&D Systems). A leitura foi realizada em 450 nm em leitor de placa. A normalização dos

resultados foi realizada pela quantificação de proteínas. Os resultados foram expressos em pg/mg de proteína.

3.5.6 Normalização das dosagens

A quantificação de proteínas totais foi realizada para normalização das dosagens realizadas. O método utilizado foi o proposto por Lowry et al., que utiliza albumina bovina sérica como padrão158_{. A absorbância foi realizada em 700nm. Os}

resultados foram expressos em mg de proteínas.

3.5.7 Avaliação de dano cognitivo

O dano cognitivo a longo prazo foi avaliado pelos testes comportamentais: campo aberto, memória de reconhecimento de objetos e esquiva inibitória.

O teste de campo aberto foi realizado para avaliação da memória espacial. Para esta avaliação os animais foram colocados na caixa de campo aberto de 40x60cm com o piso dividido em 12 quadrados iguais delimitados por linhas pretas. As quatro paredes da caixa são com 50cm de altura, sendo três paredes de madeira e uma de vidro transparente. Na sessão de treino, os animais foram cuidadosamente colocados no quadrado do canto posterior esquerdo do aparato, onde puderam explorar individualmente o ambiente durante cinco minutos. Imediatamente após, os animais voltaram para a caixa de alojamento. A sessão de teste foi realizada 24 horas após o treino, na qual se repetiu o mesmo procedimento. Os números de cruzamentos através das linhas pretas foram avaliados em ambas sessões43_.

O teste de memória de reconhecimento de objetos foi utilizado para verificar a memória declarativa de curta e longa duração ao reconhecimento de objetos. Os animais foram colocados individualmente no equipamento de campo aberto contendo dois objetos iguais (A1 e A2) e foi observada a exploração dos objetos pelo animal por cinco minutos. Após 1h30min, o animal retornou ao equipamento, mas o objeto A2 foi trocado por um novo (B), e foi avaliada a memória de curta duração através do tempo de exploração do objeto conhecido A e do objeto B, durante cinco minutos. Para avaliação da memória de longa duração, após 24h foi feito o mesmo procedimento trocando o objeto B por um novo objeto C. Os objetos tinham tamanho semelhante, mas cores e formatos diferentes. Entre as seções de reconhecimento, todos os

aparatos foram limpos com etanol 70% para evitar que algum cheiro influenciasse nos resultados. A exploração do objeto foi definida através do comportamento de encostar ou cheirar o objeto. O tempo de exploração dos objetos foi analisado através do seguinte cálculo: TB/(TA+TB) para memória de curta duração e TC/(TA+TC) para memória de longa duração; sendo TA=tempo de exploração do objeto A, TB=tempo de exploração do objeto B, e TC=tempo de exploração do objeto C44,159_.

O teste de esquiva inibitória ativa foi utilizado para avaliar a memória aversiva. Foi utilizada uma caixa retangular acrílica de 30x33x54cm (Insight), dividida em duas salas (uma clara e outra escura) onde no chão contém barras paralelas de ferro (1mm de diâmetro) com espaçamento de 1cm. Na seção de treino os animais são colocados na sala clara e ao entrar na sala escura o animal recebia um choque pelas barras de ferro de 0,4mA até que o animal retornasse a sala clara. Após 1,5h os animais retornaram ao aparato, e foi verificado o tempo que o animal permaneceu na sala escura, como indicativo da memória aversiva de curto prazo. E após 24h, foi realizado o mesmo procedimento, para verificar a memória a longo prazo. Cada seção teve a duração máxima de cinco minutos160_.

3.5.8 Avaliação de comportamento do tipo depressivo

O teste de nado forçado foi utilizado para avaliar o comportamento do tipo depressivo. Foi utilizado um tanque cilíndrico de 80cm de altura por 50cm de diâmetro, contendo água morna (22-23°C), com profundidade de 40cm. A água foi trocada para cada um dos animais. O teste foi realizado em dois momentos. No primeiro momento, os animais foram colocados no tanque por 15min (pré-teste). Após 24 horas, os animais retornaram ao tanque por cinco minutos (teste). Nesse momento foi avaliado o tempo em que os animais nadaram e o número de pulos (tentativas de sair da água)43,161_.

3.5.9 Análise de sobrevida

Os animais foram observados diariamente, durante 10 dias após a indução de sepse, para a determinação da taxa de sobrevida162_.