PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE MARIANA PEREIRA DE SOUZA GOLDIM
ESTUDO DO COMPORTAMENTO DOENTIO NA SEPSE EXPERIMENTAL E O ENVOLVIMENTO DA DISFUNÇÃO CEREBRAL E ATIVAÇÃO MICROGLIAL
Tubarão 2018
ESTUDO DO COMPORTAMENTO DOENTIO NA SEPSE EXPERIMENTAL E O ENVOLVIMENTO DA DISFUNÇÃO CEREBRAL E ATIVAÇÃO MICROGLIAL
LINHA DE PESQUISA: NEUROCIÊNCIAS
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde para obtenção do título de Doutora em Ciências da Saúde.
Orientadora: Profa. Fabricia Petronilho, Dra.
Tubarão 2018
À minha orientadora, Profa. Dra. Fabricia Petronilho, pela confiança e competência, pelo exemplo de pessoa e profissional que tu és, que contribuíram para o meu crescimento; foi uma honra ser a tua primeira doutoranda.
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde (PPGCS/UNISUL), por proporcionar um ambiente que propicia a troca de conhecimento e o crescimento profissional e acadêmico.
Aos colegas do mestrado e doutorado da turma de dezembro de 2014, pelo convívio nas disciplinas, que às tornaram muito mais alegres.
À Lucinéia Gainski Danielski, pelos anos de parceria em laboratório, por ter me apresentado a Profa. Fabricia e incentivado a fazer doutorado na UNISUL.
Às minhas colegas de doutorado, Aline Haas de Mello, Amanda Della Giustina, Morgana Prá e Naiana da Rosa, pela amizade e convívio durante esses quatro anos de doutorado.
Aos alunos do grupo de pesquisa NEUROIMET – núcleo Sepse, pela dedicação e envolvimento na pesquisa que foram fundamentais para o sucesso deste projeto.
Ao meu marido, Fabrício, pelo companheirismo durante toda essa trajetória e pelo incentivo a seguir os meus objetivos.
Aos meus pais, Susana e José Roberto, a minha madrasta, Márcia, e aos meus irmãos, Laura e Alberto, pelo amor e pela compreensão nos meus momentos de ausência.
Às minhas famílias, Pereira de Souza, Goldim e Born, pelo apoio ao longo de minha vida, em especial nos últimos quatro anos.
A CAPES, pelo apoio financeiro a pesquisa e a bolsa de estudos que possibilitou a minha dedicação ao doutorado.
Introdução: Alterações comportamentais e fisiológicas ocorrem em resposta ao processo inflamatório, caracterizadas como comportamento doentio. A sepse é uma resposta inflamatória sistêmica exacerbada devido à infecção, gerando consequências em diversos órgãos, inclusive ao cérebro, causando alterações neurológicas e dano cognitivo.
Objetivo: Investigar o comportamento doentio e o envolvimento da neuroinflamação e dano cognitivo na sepse experimental.
Métodos: Ratos Wistar machos de dois meses de vida foram submetidos ao modelo de sepse por ligação e perfuração cecal (grupo CLP) ou somente laparotomia (grupo sham). Os animais foram avaliados para a presença do comportamento doentio no momento da indução da sepse, 6h, 12h e 24h após, para avaliação aguda da neuroinflamação e dano à barreira hematoencefálica (BHE) nas estruturas amígdala, núcleo accumbens, hipocampo e córtex pré-frontal em 24h após CLP. Ou diariamente durante oito dias nos experimentos para avaliação a longo prazo da neuroinflamação e dano cognitivo. Sendo o comportamento doentio determinado pelos seguintes critérios: hipotermia, anorexia, adipsia, anedonia e letargia. Foi estabelecida a escala de comportamento doentio (SBS) a partir da alteração do comportamento saudável dos animais prévio à sepse. Também foi avaliado o envolvimento da ativação microglial, através da inibição da micróglia M1 com o uso da minociclina.
Resultados: Os animais do grupo CLP apresentaram comportamento doentio acentuado agudo e crônico. Foi observada uma associação entre SBS e dano a BHE, citocina IL-6, corticosterona, BDNF, níveis de nitrito/nitrato e alterações neuroinflamatórias na amígdala. Bem como foi associado os níveis de SBS a longo prazo com o dano cognitivo. A ativação microglial demonstrou estar envolvida no SBS, neuroinflamação e dano cognitivo.
Conclusão: As alterações fisiológicas de comportamento doentio estão associadas a marcadores inflamatórios e de dano no SNC. Podendo este protocolo de avaliação comportamental auxiliar na avaliação de alterações do SNC e investigação de vias relacionadas na sepse.
Introduction: Behavioral and physiological alterations occur due inflammatory process, called as sickness behavior. Sepsis is an overwhelmed systemic inflammation response due an infection, leading to organ damage, including brain, causing neurological alterations and cognitive brain damage.
Objective: Investigate sickness behavior and its involvement with neuroinflammation and cognitive damage in experimental sepsis.
Methods: Male Wistar rats of two months of age were submitted to sepsis model of cecal ligation and puncture (CLP group) or laparotomy only (sham group). Sickness behavior were evaluated prior surgery, 6h, 12h and 24h after, for analysis of acute neuroinflammation and blood-brain barrier (BBB) leakage at brain structures: amygdala, nucleus accumbens, hippocampus and prefrontal cortex at 24h after CLP. Or daily evaluations during eight days for analysis of long term neuroinflammation and cognitive damage. Sickness behavior were determined by the following criteria: hypothermia, anorexia, adipsia, anhedonia and lethargy. The sickness behavior score (SBS) were determined by the alteration of healthy behavior prior sepsis. Also, were evaluated the involvement of microglia activation, by inhibition of M1 microglia by minocycline.
Results: CLP animals showed increased sickness behavior in acute and chronic evaluation. It was observed an association of SBS and BBB leakage, IL-6 cytokine, corticosterone, BDNF, nitrite/nitrate levels and neuroinflammation in amygdala. Chronic SBS was associated with long term cognitive damage. Microglial activation showed to be involved with SBS, neuroinflammation and cognitive damage.
Conclusion: Physiological alterations of sickness behavior are associated with inflammation markers and damage to CNS. Being this protocol of behavioral evaluation help the analysis of CNS alterations and pathways involved in sepsis.
LISTAS
Lista de abreviaturas
ACTH - Hormônio adrenocorticotrófico (do inglês, adrenocorticotropic hormone) ATP – Adenosina trifosfato
AUC – Área sob a curva (do inglês, area under the curve)
BDNF – Fator neurotrófico derivado do cérebro (do inglês, brain-derived neurotrophic factor)
BHE – Barreira hematoencefálica CAT - Catalase
CLP – Ligação e perfuração cecal (do inglês, cecal ligation and puncture) CTE – Cadeia transportadora de elétrons
DCAS – Disfunção cerebral associada à sepse EAS – Encefelopatia associada a sepse
ELISA – Ensaio imuno-enzimático (do inglês, enzyme-linked immunosorbent assay) ERN – Espécie reativa de nitrogênio
ERO – Espécie reativa de oxigênio
FIP - Indução de peritonite fecal (do inglês, fecal induced peritonitis) GPx - Glutationa peroxidase
HPA - Eixo hipotálamo-pituitária-adrenal IC – Intervalo de confiança
IL – Interleucina
ILAS – Instituto Latinoamericano de Sepse i.p. - Intraperitoneal
iNOS – Óxido nítrico sintase induzida (do inglês, inducible nitric oxide synthase) LBP - Proteína ligadora de LPS (do inglês, lipopolysaccharide binding protein) LPS – Lipopolissacarídeo
M-CASS - Avaliação clínica da severidade da sepse em camundongos (do inglês, mouse clinical assessment score for sepsis)
MMP – Metaloproteinase de matriz (do inglês, matrix metalloproteinases) MSS - escala de sepse para roedores (do inglês, murine sepsis score) NADPH – Fosfato de dinucleotídeo de nicotinamida e adenina
NFκB - Fator nuclear kappa B (do inglês, nuclear factor kappa B) NO - Óxido nítrico (do inglês, nitric oxid)
NN – Nitrito e nitrato
PAMP – Padrão molecular de reconhecimento de patógeno (do inglês, pathogen-associated molecular patterns)
qSOFA – Rápido sistema de pontuação de disfunção orgânica (do inglês, quick Sequential Organ Failure Assessment)
ROC - Característica de Operação do Receptor (do inglês, receiver operating
characteristic)
RRP - Receptores de reconhecimento de padrão
SBS – Escala de comportamento doentio (do inglês, sickness behavior score) SNC – Sistema nervoso central
SOD – Superóxido dismutase
SOFA – Sistema de pontuação de disfunção orgânica (do inglês, sequential organ failure assessment)
SIRS – Síndrome da resposta inflamatória sistêmica (do inglês, systemic inflammatory response syndrome)
TBARS – Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (do inglês, thiobarbituric acid reactive substances)
TLR – Receptor do tipo Toll (do inglês, toll-like receptor)
TNFα – Fator de necrose tumoral alfa (do inglês, tumor necrosis factor alpha) UTI – Unidade de terapia intensiva
Lista de Quadros
Quadro 1 - Sistema de pontuação de disfunção orgânica completo (SOFA) ...19
Lista de Tabelas
Tabela1. Sistema de pontuação de avaliação do comportamento doentio proposto (SBS; do inglês, Sickness Behavior Score)...43
Lista de Figuras
Figura 2. Avaliação da anorexia pelos parâmetros de consumo de ração (A) e
variação do peso corporal (B) prévio a sepse (0 horas) e em 6, 12 e 24 horas após a indução de sepse por CLP. Dados expressos em média ± erro padrão. Comparação entre os grupos e tempos por ANOVA de duas vias e pós teste de Bonferroni. * p<0,0001 entre sham e CLP no mesmo intervalo de tempo. # p<0,0001 grupo sham comparado a 0h. $ p<0,0001 grupo CLP comparado a 0h. Linha pontilhada indica ponto de corte entre comportamento saudável e doentio sendo, 22 g de consumo de ração (A) e 1 g de ganho de peso corporal (B). ... 50 Figura 3. Avaliação da adipsia pelos parâmetros de consumo de líquidos total (água + glicose 1%) no experimento 1 (A) e 2 (B) prévio a sepse (0 horas) e em 6, 12 e 24 horas após a indução de sepse por CLP. Dados expressos em média ± erro padrão. Comparação entre os grupos e tempos por ANOVA de duas vias e pós teste de Bonferroni. # p<0,05 grupo sham comparado a 0h. $ p<0,05 grupo CLP comparado a 0h. Linha pontilhada indica ponto de corte entre comportamento saudável e
doentio sendo, 48 mL de consumo de líquido (A) e 37 mL (B)... 51 Figura 4. Avaliação da anedonia pela diminuição da preferência do consumo de glicose 1% prévio a sepse (0 horas) e em 6, 12 e 24 horas após a indução de sepse por CLP. Dados expressos em média ± erro padrão. Comparação entre os grupos e tempos por ANOVA de duas vias e pós teste de Bonferroni. $ p<0,05 grupo CLP comparado a 0h. Linha pontilhada indica ponto de corte entre comportamento
saudável e doentio sendo, 50%. ... 52 Figura 5. Avaliação da temperatura auricular prévia a sepse (0 horas) e em 6, 12 e 24 horas após a indução de sepse por CLP. Dados expressos em média ± erro padrão. Comparação entre os grupos e tempos por ANOVA de duas vias e pós teste de Bonferroni. # p<0,05 grupo sham comparado a 0h. $ p<0,05 grupo CLP
comparado a 0h. Linha pontilhada indica ponto de corte entre comportamento
saudável e doentio sendo, 32 °C. ... 53 Figura 6. Avaliação da letargia prévia a sepse (0 horas) e em 6, 12 e 24 horas após a indução de sepse por CLP. Dados expressos em média ± erro padrão.
Comparação entre os grupos e tempos por ANOVA de duas vias e pós teste de Bonferroni. *p<0,0001 entre sham e CLP no mesmo intervalo de tempo. # p<0,0001 grupo sham comparado a 0h. $ p<0,0001 grupo CLP comparado a 0h. Linha
pontilhada indica ponto de corte entre comportamento saudável e doentio sendo, um sintoma de letargia. ... 54 Figura 7. Avaliação da escala global de comportamento doentio (SBS) em 24 horas após a indução de sepse por CLP. Dados expressos em média ± erro padrão.
Comparação entre os grupos por Mann-Whitney. *** p<0,001 entre sham e CLP. ... 55 Figura 8. Associação entre a pontuação de comportamento doentio (SBS) com alteração da barreira hematoencefálica pela técnica de extravasamento de azul de Evans nas estruturas cerebrais: amígdala (A), núcleo accumbens (B), hipocampo (C) e córtex pré-frontal (D) em 24h após a indução de sepse. Correlação de Spearman. ... 56 Figura 9. Associação entre a pontuação de comportamento doentio (SBS) e níveis da citocina pró-inflamatória IL-6 no soro (A) e líquor (B) em 24h após a indução de sepse. Correlação de Spearman. ... 57
Figura 10. Associação entre a pontuação de comportamento doentio (SBS) e
marcadores de estresse: peso da glândula adrenal (A) e níveis de corticosterona no soro (B) em 24h após a indução de sepse. Correlação de Spearman. ... 58 Figura 11. Associação entre os dois marcadores de estresse avaliados: peso da glândula adrenal e níveis de corticosterona no soro em 24h após a indução de sepse. Correlação de Spearman. ... 59 Figura 12. Associação entre a pontuação de comportamento doentio (SBS) e dano oxidativo em lipídeos nas estruturas cerebrais: amígdala (A), núcleo accumbens (B), hipocampo (C) e córtex pré-frontal (D) em 24h após a indução de sepse. Correlação de Spearman. ... 60 Figura 13. Associação entre a pontuação de comportamento doentio (SBS) e dano oxidativo em proteínas nas estruturas cerebrais: amígdala (A), núcleo accumbens (B), hipocampo (C) e córtex pré-frontal (D) em 24h após a indução de sepse.
Correlação de Spearman. ... 61 Figura 14. Associação entre a pontuação de comportamento doentio (SBS) e níveis de nitrito e nitrato nas estruturas cerebrais: amígdala (A), núcleo accumbens (B), hipocampo (C) e córtex pré-frontal (D) em 24h após a indução de sepse. Correlação de Spearman. ... 62 Figura 15. Avaliação da anorexia pelo parâmetro de consumo de ração prévio a sepse (0 horas) e durante oito dias após a indução de sepse por CLP. Dados expressos em média ± erro padrão. Comparação entre os grupos e tempos por ANOVA de duas vias e pós teste de Bonferroni. * p<0,0001 entre sham e CLP no mesmo intervalo de tempo. # p<0,0001 grupo sham comparado a dia 0. $ p<0,0001 grupo CLP comparado a dia 0. Linha pontilhada indica ponto de corte entre
comportamento saudável e doentio sendo, 18 g de consumo de ração. ... 63 Figura 16. Avaliação da anorexia pela variação do peso corporal prévio a sepse (0 horas) e durante oito dias após a indução de sepse por CLP. Dados expressos em média ± erro padrão. Comparação entre os grupos e tempos por ANOVA de duas vias e pós teste de Bonferroni. * p<0,0001 entre sham e CLP no mesmo intervalo de tempo. # p<0,0001 grupo sham comparado a dia 0. $ p<0,0001 grupo CLP
comparado a dia 0. Linha pontilhada indica ponto de corte entre comportamento saudável e doentio sendo, 1 g de ganho de peso corporal. ... 64 Figura 17. Avaliação da adipsia pelo consumo de líquidos (água + solução de glicose 1%) prévio a sepse (0 horas) e durante oito dias após a indução de sepse por CLP. Dados expressos em média ± erro padrão. Comparação entre os grupos e tempos por ANOVA de duas vias e pós teste de Bonferroni. * p<0,0001 entre sham e CLP no mesmo intervalo de tempo. # p<0,0001 grupo sham comparado a dia 0. $ p<0,0001 grupo CLP comparado a dia 0. Linha pontilhada indica ponto de corte médio entre comportamento saudável e doentio sendo, 47 mL de consumo de líquido. ... 65 Figura 18. Avaliação da anedonia pela diminuição da preferência do consumo de glicose 1% prévio a sepse (0 horas) e durante oito dias após a indução de sepse por CLP. Dados expressos em média ± erro padrão. Comparação entre os grupos e tempos por ANOVA de duas vias e pós teste de Bonferroni. * p<0,0001 entre sham e CLP no mesmo intervalo de tempo. # p<0,0001 grupo sham comparado a dia 0. $
p<0,0001 grupo CLP comparado a dia 0. Linha pontilhada indica ponto de corte médio entre comportamento saudável e doentio sendo, 50%. ... 66 Figura 19. Avaliação da temperatura auricular prévia a sepse (0 horas) e durante oito dias após a indução de sepse por CLP. Dados expressos em média ± erro padrão. Comparação entre os grupos e tempos por ANOVA de duas vias e pós teste de Bonferroni. * p<0,0001 entre sham e CLP no mesmo intervalo de tempo. # p<0,0001 grupo sham comparado a dia 0. $ p<0,01 grupo CLP comparado a dia 0. Linha pontilhada indica ponto de corte médio entre comportamento saudável e doentio sendo, 35,7 °C. ... 67 Figura 20. Avaliação da letargia prévia a sepse (0 horas) e durante oito dias após a indução de sepse por CLP. Dados expressos em média ± erro padrão. Comparação entre os grupos e tempos por ANOVA de duas vias e pós teste de Bonferroni.
*p<0,0001 entre sham e CLP no mesmo intervalo de tempo. # p<0,0001 grupo sham comparado dia 0. $ p<0,0001 grupo CLP comparado dia 0. Linha pontilhada indica ponto de corte médio entre comportamento saudável e doentio sendo, um sintoma de letargia... 68 Figura 21. Análise de poder discriminativo da escala global de comportamento doentio entre animais sépticos e controles pelo teste curva ROC. ... 69 Figura 22. Avaliação da escala global de comportamento doentio (SBS) durante oito dias após a indução de sepse por CLP. Dados expressos em média ± erro padrão. Comparação entre os grupos por ANOVA de duas vias e pós teste de Bonferroni. *p<0,001 entre sham e CLP no mesmo intervalo de tempo. # p<0,0001 grupo sham comparado a dia 0. $ p<0,0001 grupo CLP comparado a dia 0. Linha pontilhada SBS=2, indica ponto de corte para comportamento doentio leve. Linha pontilhada SBS=3, indica ponto de corte para comportamento doentio severo. ... 70 Figura 23. Somatório dos oito dias de avaliação do comportamento doentio com a escala global de comportamento doentio (SBS). Barras indicam média ± erro padrão. **p<0,001 comparado sham e CLP por Mann-Whitney. ... 71 Figura 24. Associação entre o somatório de oito dias de avaliação da pontuação de comportamento doentio (SBS) e níveis da citocina pró-inflamatória IL-6 no soro (A) e líquor (B) em 10 dias após a indução de sepse. Correlação de Spearman. ... 72 Figura 25. Associação entre o somatório de oito dias da pontuação de
comportamento doentio (SBS) e níveis séricos de corticosterona em 10 dias após a indução de sepse. Correlação de Spearman. ... 73 Figura 26. Associação entre o somatório de oito dias da pontuação de
comportamento doentio (SBS) e dano oxidativo em lipídeos nas estruturas cerebrais: amígdala (A), núcleo accumbens (B), hipocampo (C) e córtex pré-frontal (D) em 10 dias após a indução de sepse. Correlação de Spearman. ... 74 Figura 27. Associação entre o somatório de oito dias da pontuação de
comportamento doentio (SBS) e dano oxidativo em proteínas nas estruturas
cerebrais: amígdala (A), núcleo accumbens (B), hipocampo (C) e córtex pré-frontal (D) em 10 dias após a indução de sepse. Correlação de Spearman. ... 75
Figura 28. Associação entre o somatório de oito dias da pontuação de
comportamento doentio (SBS) e níveis de nitrito/nitrato nas estruturas cerebrais: amígdala (A), núcleo accumbens (B), hipocampo (C) e córtex pré-frontal (D) em 10 dias após a indução de sepse. Correlação de Spearman. ... 76 Figura 29. Associação entre o somatório de oito dias da pontuação de
comportamento doentio (SBS) e níveis de BDNF nas estruturas cerebrais: amígdala (A), núcleo accumbens (B), hipocampo (C) e córtex pré-frontal (D) em 10 dias após a indução de sepse. Correlação de Spearman. ... 77 Figura 30. Associação entre o somatório de oito dias da pontuação de
comportamento doentio (SBS) e dano cognitivo número de cruzamento no teste de campo aberto (A); número de pulos (B) e tempo nadando (C) no teste de nado forçado; tempo de latência (D) no teste de esquiva inibitória; e % de exploração do objeto novo na avaliação de memória de objeto a curto prazo (E) e a longo prazo (F). Correlação de Spearman. ... 79 Figura 31. Curva de sobrevida dos animais sham e CLP durante 10 dias de
experimento. Sobrevida de 100% no grupo sham e 70% no CLP... 80 Figura 32. Avaliação da escala global de comportamento doentio (SBS) dos animais CLP sobreviventes (S) e não sobreviventes (NS) durante os seis dias após a indução de sepse. @p<0,001 comparado ao dia 0 (CLP S e NS); &p<0,001 comparado ao dia 1 (CLP S). ... 81 Figura 33. Avaliação da escala global de comportamento doentio (SBS) dos animais controle (sham), sépticos (CLP) e sépticos com inibição da micróglia (mino). Dados expressos em média ± erro padrão. Comparação entre os grupos por ANOVA de duas vias e pós teste de Bonferroni. *p<0,001 sham comparado aos outros grupos no mesmo intervalo de tempo. $p<0,001 entre CLP e mino no mesmo intervalo de tempo. ... 82 Figura 34. Avaliação da escala global de comportamento doentio (SBS) dos animais controle (sham), sépticos (CLP) e sépticos com inibição da micróglia (mino). Dados expressos em média ± erro padrão. Comparação entre os grupos por ANOVA de duas vias e pós teste de Bonferroni. *p<0,001 comparado ao dia 0 de cada grupo. 83 Figura 35. Somatória de oito dias da escala global de comportamento doentio (SBS) dos animais controle (sham), sépticos (CLP) e sépticos com inibição da micróglia (mino). Dados expressos em média ± erro padrão. Comparação entre os grupos por ANOVA de uma via e pós teste de Bonferroni. *p<0,001 comparado ao grupo sham. ... 84 Figura 36. Associação entre o somatório de oito dias de avaliação da pontuação de comportamento doentio (SBS) dos animais com sepse (CLP e mino) e níveis da citocina pró-inflamatória IL-6 no soro (A) e líquor (B) em 10 dias após a indução de sepse. Correlação de Spearman. ... 85 Figura 37. Associação entre o somatório de oito dias de avaliação da pontuação de comportamento doentio (SBS) dos animais com sepse (CLP e mino) e níveis de corticosterona no soro em 10 dias após a indução de sepse. Correlação de
Figura 38 Associação entre o somatório de oito dias da pontuação de
comportamento doentio (SBS) dos animais com sepse (CLP e mino) e dano
oxidativo em lipídeos nas estruturas cerebrais: amígdala (A), núcleo accumbens (B), hipocampo (C) e córtex pré-frontal (D) em 10 dias após a indução de sepse.
Correlação de Spearman. ... 87 Figura 39. Associação entre o somatório de oito dias da pontuação de
comportamento doentio (SBS) dos animais com sepse (CLP e mino) e dano oxidativo em proteínas nas estruturas cerebrais: amígdala (A), núcleo accumbens (B), hipocampo (C) e córtex pré-frontal (D) em 10 dias após a indução de sepse. Correlação de Spearman. ... 88 Figura 40. Associação entre o somatório de oito dias da pontuação de
comportamento doentio (SBS) dos animais com sepse (CLP e mino) e níveis de nitrito/nitrato nas estruturas cerebrais: amígdala (A), núcleo accumbens (B), hipocampo (C) e córtex pré-frontal (D) em 10 dias após a indução de sepse.
Correlação de Spearman. ... 89 Figura 41. Associação entre o somatório de oito dias da pontuação de
comportamento doentio (SBS) dos animais com sepse (CLP e mino) e níveis BDNF nas estruturas cerebrais: amígdala (A), núcleo accumbens (B), hipocampo (C) e córtex pré-frontal (D) em 10 dias após a indução de sepse. Correlação de Spearman. ... 90 Figura 42. Associação entre o somatório de oito dias da pontuação de
comportamento doentio (SBS) dos animais com sepse (CLP e mino) e desemprenho no teste de esquiva inibitória medido em segundo de latência na avaliação de
memória a curto (A) e a longo (B) prazo em 10 dias após a indução de sepse.
Correlação de Spearman. ... 91 Figura 43. Curva de sobrevida dos animais sham (controle), CLP (sepse) e mino (sepse+minociclina) durante 10 dias de experimento. Sobrevida de 100% no grupo sham, 78% no CLP e 94% no mino. ... 92 Figura 44. Avaliação da escala global de comportamento doentio (SBS) dos animais controle (sham), sépticos (CLP) e sépticos com inibição da micróglia (mino). Dados expressos em média ± erro padrão. ... 92
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 17
1.1. REFERENCIAL TEÓRICO ... 18
1.1.1. Definição e aspectos epidemiológicos da sepse ... 18
1.1.2. Fisiopatologia da Sepse ... 20
1.1.3. Disfunção cerebral associada à sepse ... 22
1.1.3.1. Estresse Oxidativo... 23
1.1.3.2. Barreira Hematoencefálica ... 25
1.1.3.3. Ativação microglial... 26
1.1.3.4. Dano cognitivo ... 27
1.1.3.5. Comportamento doentio ... 28
1.1.3.6. Escalas de avaliação clínica dos animais ... 32
1.1.3.7. Modelo animal de sepse ... 33
2. OBJETIVOS ... 35 2.1 OBJETIVO GERAL ... 35 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 35 3. MÉTODOS ... 37 3.1 TIPO DE ESTUDO ... 37 3.2 EQUIPAMENTOS ... 37 3.3 ANIMAIS ... 37 3.4 DELINEAMENTO DO ESTUDO ... 38
3.4.1 Modelo experimental de sepse ... 41
3.4.2 Morte indolor assistida ... 41
3.4.3 Coleta de amostras biológicas ... 41
3.5 TÉCNICAS ... 42
3.5.1 Avaliação do comportamento doentio ... 42
3.5.2 Permeabilidade da barreira hematoencefálica ... 43
3.5.3 Marcadores inflamatórios e de estresse ... 44
3.5.4.1 Dano aos lipídios ... 44
3.5.4.2 Dano às proteínas ... 45
3.5.4.3 Nitrito e Nitrato (N/N) ... 45
3.5.5 Fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) ... 45
3.5.6 Normalização das dosagens ... 46
3.5.7 Avaliação de dano cognitivo ... 46
3.5.8 Avaliação de comportamento do tipo depressivo ... 47
3.5.9 Análise de sobrevida... 47
3.6 PROCESSAMENTO E ANÁLISE DE DADOS ... 48
3.7 ASPECTOS ÉTICOS DA PESQUISA ... 48
4. RESULTADOS ... 49
4.1 AVALIAÇÃO DO COMPORTAMENTO DOENTIO AGUDO ... 49
4.1.1 Associação do comportamento doentio e permeabilidade da BHE ... 55
4.1.2 Associação entre comportamento doentio e IL-6 ... 56
4.1.3 Associação entre comportamento doentio e marcadores de estresse ... 57
4.1.4 Associação entre comportamento doentio e estresse oxidativo ... 59
4.2 AVALIAÇÃO DO COMPORTAMENTO DOENTIO CRÔNICO ... 62
4.2.1 Associação entre comportamento doentio crônico e IL-6 ... 72
4.2.2 Associação entre comportamento doentio crônico e marcador de estresse ... 73
4.2.3 Associação entre comportamento doentio crônico e estresse oxidativo . 73 4.2.4 Associação entre comportamento doentio crônico e BDNF ... 76
4.2.5 Associação entre comportamento doentio crônico e dano cognitivo e comportamento do tipo depressivo ... 77
4.2.6 Associação entre comportamento doentio crônico e sobrevida ... 80
4.3 ENVOLVIMENTO DA ATIVAÇÃO MICROGLIAL NA SEPSE ... 81
4.3.1 Envolvimento da ativação microglial na escala de comportamento doentio ... 81
4.3.2 Associação entre comportamento doentio crônico e IL-6 ... 84
4.3.3 Associação entre comportamento doentio crônico e corticosterona ... 85 4.3.4 Associação entre comportamento doentio crônico e estresse oxidativo . 86
4.3.5 Associação entre comportamento doentio crônico e BDNF ... 89
4.3.6 Associação entre comportamento doentio crônico e dano cognitivo ... 90
4.3.7 Associação entre comportamento doentio crônico e sobrevida ... 91
5. DISCUSSÃO ... 93
5.1 COMPORTAMENTO DOENTIO NA SEPSE ... 94
5.2 ESCALA DE COMPORTAMENTO DOENTIO (SBS) NA AVALIAÇÃO DA SEPSE AGUDA ... 95
5.3 ESCALA DE COMPORTAMENTO DOENTIO (SBS) NA AVALIAÇÃO DA SEPSE A LONGO PRAZO ... 99
5.4 ENVOLVIMENTO DA ATIVAÇÃO MICROGLIAL E ESCALA DE COMPORTAMENTO DOENTIO (SBS) NA AVALIAÇÃO DA SEPSE A LONGO PRAZO ... 101
6. CONCLUSÃO ... 104
6.1 PERSPECTIVAS FUTURAS ... 104
REFERÊNCIAS ... 105
APÊNDICE A – TABELA DE AVALIAÇÃO DO COMPORTAMENTO DOENTIO . 120 ANEXO A - PARECER DE APROVAÇÃO DA CEUA ... 121
1. INTRODUÇÃO
A sepse é uma resposta inflamatória sistêmica à presença de um agente infeccioso resultando em uma disfunção orgânica com risco de vida1. A inflamação é
uma resposta normal do sistema imune quando há uma infecção, porém na sepse, esse processo inflamatório é exagerado ocasionando a síndrome de insuficiência de múltiplos órgãos e em muitos casos, a morte do paciente2,3.
Diversos estudos vêm sendo realizados com a finalidade de compreender melhor o desenvolvimento da doença, para assim, melhorar o tratamento e diminuir a mortalidade dos pacientes4–6. Uma complicação frequente é a disfunção cerebral associada à sepse, que ocorre em até 71% dos pacientes dependendo dos critérios de diagnóstico utilizados7,8. A disfunção cerebral aguda na sepse pode ser verificada
por meio de um conjunto de sintomas, como comportamento do tipo depressivo, distúrbios do sono, fadiga, anorexia e diminuição da interação social, que são características encontradas no chamado “comportamento doentio” (sickness behavior, em inglês)9–11. Adicionalmente, alterações neurológicas e cognitivas também são observadas a longo prazo em pacientes que não apresentam mais alterações em marcadores inflamatórios12.
A fisiopatologia da sepse e suas alterações no sistema nervoso central (SNC) ocorre em decorrência do aumento exacerbado de sinalizadores pró-inflamatórios, como as citocinas. Tais mediadores, com o auxílio da ação de espécies reativas de oxigênio (EROs) e nitrogênio (ERNs), aumentam a permeabilidade da barreira hematoencefálica (BHE), deixando o SNC mais exposto à mediadores inflamatórios periféricos, ocasionando uma resposta neuroinflamatória7,13. Este processo estimula
a ativação de microglia e astrócitos, células residentes do SNC, a produzirem localmente mais citocinas e outros mediadores pró-inflamatórios, resultando em dano neuronal14,15. Nesse sentido, recentemente foi verificado que a inibição da ativação
microglial, através do uso de minociclina, gerou uma redução de mediadores inflamatórios agudos e de dano cognitivo em longo prazo em modelo experimental de sepse16.
Diversas vias da resposta inflamatória podem ser ativadas durante a sepse possuindo relação com alterações comportamentais, desta forma, é de extrema importância compreender melhor esses mecanismos. Neste trabalho foi avaliado a
relação entre o comportamento doentio com alterações neuroquímicas e inflamatórias agudas e o dano cognitivo a longo prazo, além do envolvimento da ativação microglial durante esse processo em modelo animal de sepse polimicrobiana abdominal. Desta maneira, considera-se a hipótese de que o comportamento doentio em animais submetidos à sepse polimicrobiana intra-abdominal está correlacionado às alterações neuroquímicas e inflamatórias agudas e associe-se, consequentemente, ao dano cognitivo a longo prazo e uma maior mortalidade. Considera-se, adicionalmente, que a ativação microglial está envolvida nestes processos. Assim sendo, as alterações do comportamento doentio podem ser indicadoras do prognóstico neurodegenerativo decorrente da sepse.
1.1. REFERENCIAL TEÓRICO
1.1.1. Definição e aspectos epidemiológicos da sepse
A sepse é conhecida desde Hipócrates, quando ele descreveu a doença como a resposta inflamatória à presença de um patógeno com um prognóstico ruim. Esta definição enfatiza as diversas complicações decorrentes desse processo inflamatório severo e a dificuldade, que se tem até hoje, em tratar os pacientes17.
De acordo com o último consenso internacional de definição de sepse e choque séptico1, denominado sepsis-3, a sepse é determinada como uma disfunção orgânica
com risco de vida causada por uma resposta inflamatória sistêmica à presença de um patógeno. Para a determinação desta disfunção orgânica o paciente suspeito deve ter alterado pelo menos dois dos três critérios de avaliação utilizando os critérios rápidos de sistema de pontuação de disfunção orgânica (qSOFA; do inglês quick Sequential [Sepsis-Related] Organ Failure Assessment Score): alteração do estado mental, pressão sanguínea sistólica menor ou igual a 100mmHg e taxa respiratória superior ou igual a 22/min. Para a confirmação e acompanhamento das disfunções orgânicas deve ser utilizado o sistema de pontuação de disfunção orgânica completo (SOFA), onde pontuação de dois ou mais é definida como critério diagnóstico de sepse (Quadro 1).
Quadro 1 - Sistema de pontuação de disfunção orgânica completo (SOFA). Sistema de pontuação de disfunção orgânica completo (SOFA)
SOFA 0 1 2 3 4 Respiração PaO2/FiO2 >400 <400 <300 <200 <100 Coagulação Plaquetas 103/mm3 >150 <150 <100 <50 <20 Hipotensão
Cardiovascular PAM>70 PAM<70 Dopamina <5 ou Dobutamina qualquer dose Dopamina >5 ou Epinefrina <0,1 ou Norepinefrina <0,1 Dopamina >15 ou Epinefrina >0,1 ou Norepinefrina >0,1 Fígado Bilirrubina mg/dL <1,2 1,2-1,9 2,0-5,9 6,0-11,9 >12,0 SNC Escala de coma de Glasgow >14 13-14 10-12 6-9 <6 Renal Creatinina <1,2 1,2-1,9 2,0-3,4 3,5-4,9 >5,0 Fonte: Singer et al, 20161.
O critério anterior de sepse, era caracterizado pela presença de infecção associada à síndrome da resposta inflamatória sistêmica (SIRS)18. Sendo a SIRS
determinada pela alteração de pelo menos duas das quatro variáveis: temperatura corporal (<36°C ou >38°C), frequência cardíaca (>90 bpm), frequência respiratória (>20 ipm ou PaCO2 <32 mmHg) e contagem de leucócitos (<4.000 ou >12.000 ou
>10% células imaturas)3. Essas alterações clínicas são associadas à presença de
resposta inflamatória não específica, podendo estar presente em até 90% dos pacientes admitidos em Unidade de Terapia Intensiva (UTI)19.
Portanto, o diagnóstico de sepse a partir da presença de SIRS leva em consideração somente alterações imunológicas, porém diversas outras vias também estão envolvidas, como coagulação, hepática, cardiovascular, neuronal, hormonal, e
bioenergética20,21. Sendo assim, o critério de sepse atual, sepsis-3, ao utilizar o SOFA
estabelece o diagnóstico de sepse com mais especificidade1.
A sepse pode evoluir para choque séptico, quando há hipotensão persistente após a reposição volêmica, necessitando o uso de vasopressores para manter a pressão arterial média igual ou superior a 65mmHg e o aumento dos níveis de lactato sérico acima de 2mmol/L. Devido estas alterações, a mortalidade dos pacientes é aumentada em 40%22.
Os focos infecciosos mais comumente associados ao desfecho de sepse são a pneumonia, responsável pela metade dos casos, seguido por infecção intra-abdominal e urinária. Sendo os agentes etiológicos mais frequentes bactérias gram-negativas, seguido por bactérias gram-positivas e, em menor frequência, fungos 23,24.
Uma meta-análise realizada a partir de 510 estudos, determinou que há uma maior mortalidade associada a bactérias gram-negativas, comparado a gram-positivas25.
As taxas de mortalidade de sepse variam de acordo com o país, a nível mundial aproximadamente 30% e no Brasil 46%4,26. Nos Estados Unidos, a incidência de
sepse é de 300 casos a cada 100.000 habitantes, onde ¼ dos pacientes que são hospitalizados acabam falecendo, sendo a maior causa de morte em UTIs não cardíacas2,4. Nos pacientes que evoluem para choque séptico, a mortalidade é de
aproximadamente 50%. Outro estudo americano observou um aumento na incidência de sepse nos últimos anos devido ao envelhecimento da população, doenças crônicas associadas, uso de imunossupressores, transplantes, quimioterapias e procedimentos invasivos27.
Conforme o relatório nacional de fevereiro de 2014, realizado pelo Instituto Latino Americano de Sepse (ILAS) na campanha “Sobrevivendo à Sepse”, 19.182 pacientes foram diagnosticados com sepse no Brasil nos últimos dez anos (dados de 2005 a 2014 de 102 hospitais credenciados)26.
1.1.2. Fisiopatologia da Sepse
O processo inflamatório na sepse inicia-se no foco da infecção, local onde acontece a proliferação dos microrganismos com a presença de toxinas como lipopolissacarídeos (LPS), peptideoglicanos e exotoxinas, os quais podem também invadir a circulação sistêmica28. A relação estabelecida entre hospedeiro e
moleculares associados aos patógenos (PAMPs; do inglês, pathogen-associated molecular patterns), estruturas moleculares não variáveis expressas por grupos de patógenos, as quais são normalmente significantes para a virulência ou sobrevivência do agente, por exemplo, o LPS das bactérias gram-negativas, e o ácido lipoteicóico das bactérias gram-positivas29. Os PAMPs são reconhecidos por receptores de
reconhecimento de padrão (RRP), os quais são expressos por células do sistema imune inato podendo ser representados pelos receptores like (TLR; do inglês, toll-like receptor)30.
Quando a infecção ocorre devido à presença de bactérias gram-negativas, o LPS é apresentado por uma proteína plasmática ligadora de LPS (LBP; do inglês, lipopolysaccharide binding protein) ao TLR-4 existentes na superfície de células do sistema imune inato, como monócitos, macrófagos, células dendríticas e neutrófilos31.
Quanto às infecções por bactérias gram-positivas, o receptor toll-like TLR-2, é responsável pela sinalização da presença dos proteoglicanos destas bactérias32.
Através da ativação dos receptores TLR-4 ou TLR-2 é desencadeada a transcrição gênica de citocinas pró-inflamatórias, por meio da ativação do fator de transcrição nuclear-kappa B (NF-κB; do inglês, nuclear factor kappa B). Inicialmente é liberado Fator de Necrose Tumoral-alfa (TNF-α; do inglês, tumor necrosis factor α) e Interleucina-1β (IL-1β), seguido por IL-6, os quais favorecem uma intensa resposta celular, com liberação de mediadores secundários, quimiotaxia e ativação de granulócitos. Esses mediadores, por sua vez, são responsáveis pela reativação das células fagocitárias e da cascata inflamatória, gerando assim, um ciclo vicioso inflamatório33. A liberação exacerbada de mediadores inflamatórios associada ao
dano celular causado pela ação de EROs e ERNs por neutrófilos ativados, podem causar alterações hemodinâmicas, como extravasamento capilar, vasodilatação e redução do tônus do miocárdio, além de alterações na coagulação sanguínea34,35.
Segundo Vincent e Korkut36, na sepse ocorre um desequilíbrio entre o consumo
e a disponibilidade de oxigênio, podendo levar ao quadro de hipóxia tecidual. Com a finalidade de priorizar a utilização do oxigênio para as áreas mais importantes, como miocárdio e cérebro, ocorrem alterações na microcirculação e no fluxo sanguíneo de outros órgãos e tecidos. O tempo de duração dessa situação pode levar a importantes alterações celulares e teciduais, desenvolvendo-se a síndrome de disfunção múltipla de órgãos, e dentre os órgãos mais afetados estão o fígado, pulmão, rins, coração e o cérebro37.
1.1.3. Disfunção cerebral associada à sepse
Sintomas relacionados à disfunção cerebral, como depressão, ansiedade, alterações cognitivas, confusão e até coma, são relatados em pacientes com sepse38.
Essas alterações ocorrem de 23 a 71% dos pacientes, dependendo da definição utilizada8. O agravamento dos sintomas chegando ao diagnóstico de encefalopatia,
mesmo sem que haja infecção estabelecida no encéfalo, está associado a um pior prognóstico dos pacientes39.
Uma das alterações comportamentais encontradas em pacientes internados em UTI, em até 50% dos pacientes idosos, é a síndrome neuropsiquiátrica delirium40,41. As manifestações de delirium são definidas como confusão mental,
alterações cognitivas e comportamentais. Em um estudo realizado em paciente sob ventilação mecânica em UTI foi observado que o tempo de duração do delirium está associado aos danos cognitivos desenvolvidos após a sepse42. Em
acompanhamentos realizados em pacientes que sobreviveram à sepse determinaram que a sepse aumentou em 3,3 vezes a chance de desenvolver algum tipo de dano cognitivo moderado ou severo. E que essas alterações neurológicas podem persistir por até oito anos após a sepse12,42. Estudos em animais têm mostrado que ratos após
10 dias submetidos ao modelo de sepse apresentam dificuldade de aprendizado e memória, e esse dano permanece por até 60 dias15,43,44.
A disfunção cerebral na sepse é decorrente da interação e da sobreposição de diferentes mecanismos relacionados à resposta inflamatória sistêmica. A resposta cerebral para a infecção sistêmica que ocorre na sepse é fisiologicamente disparada por uma ativação de sinais que são mediados basicamente por três vias: (1) a via neural, que requer a ativação de sistema nervoso aferente primário, tal como o nervo vago através do estímulo periférico de PAMPs e citocinas pró-inflamatórias; (2) a via humoral, que envolve as citocinas circulantes, que sinalizam respostas ao cérebro, aos órgãos circumventriculares e ao plexo coróide e para a barreira hematoencefálica (BHE); (3) as alterações estruturais na BHE induzidas pela ativação de células endoteliais, que resultam no aumento da permeabilidade do parênquima cerebral à substâncias da corrente sanguínea41.
As citocinas possuem um papel fundamental na mediação da sinalização inflamatória, podendo ter efeitos autócrinos, parácrinos e endócrinos, sendo que este
último, reflete no SNC45. Sintomas como febre, anorexia e ativação do eixo
hipotálamo-pituitária-adrenal (HPA), resultando no aumento da produção dos corticóides adrenais, são consideradas respostas do papel desempenhado pelas citocinas46,47. As interações recíprocas entre o SNC e sistema imunológico são
apontadas como os componentes principais da resposta inflamatória na sepse, o que acaba causando alterações nos sistemas neuroendócrino, autonômico e comportamental48.
Sabe-se que receptores de citocinas são encontrados em micróglia, neurônios e oligodendrócitos, variando de acordo com a região cerebral49,50. Quando ativadas,
as células microgliais podem afetar negativamente o cérebro pela produção de óxido nítrico (NO), citocinas e EROs resultando em apoptose celular em áreas vulneráveis do cérebro e alteração de neurotransmissores e alterações comportamentais agudas, como o comportamento doentio, o delirium e as alterações cognitivas a longo prazo51.
Adicionalmente, esta produção é responsável pela progressão das alterações na BHE, assim causando um ciclo vicioso de disfunção e injúria cerebral52. Esses mecanismos
podem ser agravados por distúrbios metabólicos que ocorrem em pacientes com sepse (tais como hiperglicemia prolongada e hipoxemia grave), falência hemodinâmica, uso de medicamentos e fatores ambientais e iatrogênicos53.
1.1.3.1. Estresse Oxidativo
Radicais livres são qualquer espécie de molécula ou átomo que exista de forma independente que contenha um ou mais elétrons não pareados. Desta forma, reagem com outras moléculas de forma oxidante ou redutora de elétrons. Algumas moléculas, como o peróxido de hidrogênio, também possuem ação redutora ou oxidante, apesar de terem elétrons pareados. Portanto, radicais livres e moléculas com ação reativa são chamadas de espécies reativas54.
As espécies reativas de oxigênio são descritas como formas importantes de comunicação celular e homeostase presentes em diferentes formas de vida, agindo também na resposta inflamatória, no combate a patógenos pelas células de mamíferos55,56. Durante o processo inflamatório, uma das estratégias de combate aos
patógenos é a liberação de EROs via redução do oxigênio, através da NADPH oxidase, causando danos oxidativos ao DNA, lipídios e proteínas dos patógenos57,58.
estas não possuem enzimas antioxidantes capazes de inibir as reações geradas pelas EROs55.
Além da produção de EROs durante a fagocitose, outra principal fonte de EROs é a partir do vazamento de elétrons que participam da cadeia transportadora de elétrons (CTE) nas mitocôndrias59. A CTE está localizada na membrana interna, cuja
função é a produção de adenosina trifosfato (ATP, molécula de armazenamento de energia celular), através da fosforilação oxidativa. É composta pelos complexos I à IV e ATP sintase, que gera ATP a partir de NADH por meio de um gradiente energético60.
Neste sentido, EROs, como radicais hidroxila (OH-), peróxido de hidrogênio
(H2O2) e superóxidos (O2•-), são produtos tóxicos formados durante o funcionamento
da CTE e fagocitose. Sua toxicidade é controlada pela presença de enzimas antioxidantes. A superóxido dismutase (SOD) é uma destas enzimas que converte O2•- a H2O2 e O2. A catalase (CAT) e a glutationa peroxidase (GPx) convertem H2O2 à
H2O. A ação destas enzimas tem papel fundamental na prevenção da reação de
Fenton, onde há a conversão de H2O2 ao OH-, através da interação com íons de
metais61.
Porém, em situações patológicas como a sepse, ocorre um desequilíbrio entre estas enzimas ocasionando um aumento da EROs, e, consequentemente estresse oxidativo com dano a lipídios, proteínas e DNA62–65. Os neutrófilos também possuem papel importante no estresse oxidativo, agindo na fagocitose e na produção de EROs como forma de causar dano ao patógeno. Na sepse é observado um número aumentado de neutrófilos ativados e, consequentemente, estresse oxidativo, o que acaba causando danos ao próprio organismo hospedeiro inclusive ao SNC64.
Além do estresse oxidativo causado pelas EROs, há o aumento das espécies reativas de nitrogênio (ERNs), através da liberação de NO pelas células ativadas no processo inflamatório. Uma das enzimas responsáveis pela produção de NO é a óxido nítrico sintase induzida (iNOS). Esta indução é elevada pela presença de citocinas e PAMPs, como o LPS, produzindo e liberando grandes quantidades de NO, que reagem com O2•- formando peroxinitrito (ONOO-), que possui ação oxidante. Este
ainda pode ser decomposto e formar HO-, causando danos celulares e às enzimas da
CTE64,66,67. Estudos mostram a presença elevada dos níveis de nitrito e nitrato (N/N),
metabólitos estáveis do NO, em sangue e órgãos, incluindo o SNC, durante a sepse65.
Há uma associação entre a expressão de iNOS e apoptose neuronal, principalmente em hipocampo63,68.
Tratamentos com ação antioxidante tem demostrado ação protetora aos danos causados pela sepse, incluindo ao SNC, como diminuição do estresse oxidativo e dano cognitivo, assim como maior sobrevida69,70. Danos oxidativos e alterações nas
enzimas mitocondriais podem ser observados em ratos sobreviventes de sepse em até 10 dias após a indução, e o dano cognitivo está associado a estas alterações metabólicas71,72.
Em modelo experimental em ratos, foi observado dano aos lipídios e proteínas e diminuição na atividade das enzimas antioxidantes SOD e CAT em diferentes estruturas cerebrais, em seis e 12 horas após a indução de sepse polimicrobiana severa64. Além destas alterações foi observado o aumento de infiltrado de neutrófilos
e de N/N65. As alterações se intensificam em 24h após a indução de sepse, nas
estruturas cerebrais relacionadas à memória (hipocampo) e ao comportamento social (córtex pré-frontal)52,73.
1.1.3.2. Barreira Hematoencefálica
A barreira hematoencefálica (BHE) é formada por células endoteliais que envolvem os capilares do SNC, alterando de forma seletiva a permeabilidade de substâncias para o parênquima cerebral. Possui ação de proteção, dificultando a entrada de patógenos, macromoléculas hidrofílicas, como as citocinas, e células imunológicas, como neutrófilos ativados. Por isso, se pode dizer que o SNC é imunologicamente protegido, devido à presença da BHE14,74.
Durante a sepse, com a elevação de citocinas pró-inflamatórias e EROs, ocorre a ativação de enzimas proteolíticas, conhecidas como metaloproteinases de matriz (MMPs, do inglês matrix metalloproteinase)52,75. Tais proteínas, quando ativadas,
fazem a degradação da lâmina basal que envolve as células endoteliais da BHE. Além disso, degradam as proteínas intercelulares conhecidas como junções apertadas e junções endoteliais aderentes, principais reguladoras da permeabilidade da BHE76.
Em sepse experimental, com a utilização de inibidores de MMPs 2 e 9, verificou-se a diminuição de diversos parâmetros relacionados à disfunção cerebral na sepse, como a alteração da permeabilidade da BHE, estresse oxidativo, citocinas e alteração comportamental, comprovando a ação das MMPs na quebra da BHE52.
Além da função de permeabilidade seletiva, a BHE possui aspectos importantes como função neuroimune, incluindo a secreção de citocinas,
prostaglandinas e NO. Tal mecanismo é dependente de estímulos que as células da BHE recebem tanto da circulação sanguínea sistêmica, quanto de mediadores do SNC77. A alteração da permeabilidade da BHE facilita o acesso de mediadores
inflamatórios provindos do sistema circulatório periférico ao SNC, resultando no aumento da neuroinflamação devido à ativação microglial41.
Apesar de em seis e 12 horas após a indução não haver alteração significativa na permeabilidade da BHE, os níveis de citocinas e quimiocinas estão aumentados no SNC, devido à sinalização via neural e humoral78–81. Porém, em 24h há um aumento significativo da permeabilidade da BHE associado ao aumento do dano oxidativo e de outros marcadores inflamatórios como citocinas, quimiocinas e mieloperoxidase, estimulando a neuroinflamação via ativação microglial16,78.
1.1.3.3. Ativação microglial
As células microgliais são as células residentes do SNC com ação fagocitária semelhante aos macrófagos no sistema periférico. Quando ativadas, tem a capacidade de liberar diversos marcadores inflamatórios como citocinas, proteases, quimiocinas e EROs, gerando neuroinflamação82,83. Ativação microglial pode
representar uma das alterações iniciais observadas na disfunção cerebral, sendo que a sua ativação prolongada pode afetar negativamente outras células, tais como os neurônios51.
Através da administração sistêmica de LPS foi verificada a ativação microglial precoce com o aumento de IL-1β no SNC82. Além disso, com a utilização de análise
de imagem por tomografia por emissão de pósitrons (PET) em primatas não humanos, verificou-se um aumento da ativação microglial em uma hora após administração de LPS84. No hipocampo, especificamente, o processo inflamatório mediado por citocinas
pró-inflamatórias decorrentes da ativação microglial, com posterior perda neuronal, foi confirmado em diferentes modelos de inflamação sistêmica, incluindo o modelo animal de sepse68,85–88. Esses achados representam a base neuropatológica para um dano cognitivo persistente, atrofia hipocampal, e mudanças encefalográficas observadas em sobreviventes de sepse89.
Adicionalmente, tem-se verificado o bloqueio de vias relacionadas à ativação microglial com o emprego de minociclina90. A minociclina é um antibiótico de segunda
neuroprotetora91. O uso de minociclina no tratamento de transtornos de humor como
depressão, transtorno bipolar e esquizofrenia, tem mostrado resultados promissores com a diminuição da disfunção neuronal, devido ao processo inflamatório no
SNC90,92,93. Recentemente, foi verificado em modelo experimental de sepse que a
utilização de minociclina foi efetiva na diminuição de mediadores inflamatórios, dano oxidativo a lipídios e proteínas em hipocampo em um tempo precoce após a sepse e que essas alterações agudas proporcionaram uma diminuição de dano cognitivo a longo prazo16. Além disso, a minociclina bloqueia a resposta inflamatória mediada por
LPS atenuando os parâmetros de comportamento doentio nas primeiras horas após a infecção94.
1.1.3.4. Dano cognitivo
O dano cognitivo e as debilidades físicas estão relacionados à diminuição da qualidade de vida e maior mortalidade. Em pacientes recuperados da sepse, há um aumento de alterações cognitivas, de leves à graves, mesmo nos que anteriormente não apresentavam dano algum12. Associado a estas alterações, foi observada uma
redução significativa no volume do hipocampo e uma diminuição da atividade em eletroencefalograma destes pacientes89. Mesmo em indivíduos saudáveis, alterações
neurológicas leves de memória e aprendizado foram associadas a alterações em exames de neuromorfologia do hipocampo e do córtex e à elevação dos mediadores inflamatórios IL-6 e proteína C reativa95.
Diversos mecanismos estão envolvidos no processo de geração de dano no SNC e consequentemente de dano cognitivo a longo prazo, sendo destacada a neuroinflamação. Na sepse, por haver grande liberação de mediadores inflamatórios a nível sistêmico, gera neuroinflamação, com ativação de células microgliais aumentando ainda mais o processo inflamatório local16,96. Em estudos onde foi inibida
a ativação microglial pelo uso de fármacos e induzida a sepse, foram observados um menor dano cognitivo, quando comparados aos animais que desenvolveram sepse e neuroinflamação16,97.
O uso de testes comportamentais para a avaliação de dano cognitivo em modelos animais de doenças é amplamente utilizado pela facilidade de avaliação98.
Uma grande variedade de testes está disponível para avaliar os mais diversos tipos de comportamentos98.
Em um estudo que avaliou a relação entre estresse oxidativo e dano cognitivo, em ratos com sepse induzida por ligação e perfuração cecal (CLP; do inglês, cecal ligation and puncture), foi demonstrada uma correlação entre melhor desempenho no teste de esquiva inibitória com aumento nos níveis de TNF-α e dano a lipídeos, pela técnica de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS; do inglês, thiobarbituric acid reactive substances) em 6h, porém, com diminuição destes parâmetros em 24h. Associado a estes resultados, no momento do teste comportamental, 30 dias após a indução, os animais que apresentaram maior tempo de latência, indicando que foi estabelecida uma memória aversiva, tiveram maiores níveis de fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF; do inglês, brain-derived neurotrophic factor)80. Altos
níveis de citocinas e de cortisol estão associados à diminuição dos níveis de BDNF e a alterações em hipocampo, tanto em modelos animais, quanto em humanos99–101.
O dano cognitivo a longo prazo é definido como o dano observado mesmo após a reversão das alterações orgânicas. Em modelo de sepse experimental em roedores, o tempo de 10 dias já considerado como longo prazo, com alterações em diversos testes comportamentais como esquiva inibitória, memória de reconhecimento de objeto e nado forçado. Porém, em 30 e 60 dias após a indução de sepse por CLP os animais já recuperam a memória declarativa (teste de reconhecimento de objetos) e não há mais alteração do tipo-depressivo (teste de nado forçado)43,102,103.
1.1.3.5. Comportamento doentio
O comportamento doentio é definido como um conjunto de alterações comportamentais que ocorrem durante um processo inflamatório agudo, sendo uma resposta adaptativa com a finalidade de auxiliar na eficácia da resposta imunológica e combater a infecção104. É caracterizado por sintomas fisiológicos e comportamentais
como: febre, anorexia, letargia, anedonia e diminuição da interação social105. Estes
sintomas estão relacionados à presença de um processo inflamatório, porém não específico, podendo se manifestar no início do desenvolvimento de diversas patologias. Esses tipos de alterações vem sendo estudadas como um conjunto de primeiros sinais de neuroinflamação106–108.
O comportamento animal é controlado e organizado pelo cérebro, apesar deste órgão não reconhecer especificamente a infecção, mas sim, as consequências inflamatórias109. Durante a sepse há um número elevado de mediadores inflamatórios,
como as citocinas e EROs, que possuem potencialidade em alterar a integridade da BHE ou sinalizar respostas no SNC, gerando a neuroinflamação110. Sabe-se que
citocinas, principalmente TNF-α, IL-1β e IL-6, podem induzir alterações comportamentais precoces, como o comportamento doentio, e tardias, como o dano cognitivo15,111–113.
Os mecanismos responsáveis pela termorregulação, localizados no hipotálamo, podem ser alterados por estímulos de citocinas pró-inflamatórias. Sendo a febre uma resposta fisiológica a um dano, com a finalidade de aumentar a taxa metabólica, em aproximadamente 13% a cada grau Celsius elevado109,114 e inibir a
multiplicação bacteriana e viral115. Porém, na sepse, com o aumento exacerbado das
citocinas, ocorre o aumento da produção e da conservação do calor corporal simultaneamente, causando danos vasculares114.
Outra alteração termorreguladora que pode ocorrer durante o processo inflamatório sistêmico é a hipotermia, sendo observada na maioria dos modelos animais de sepse81,116,117. No modelo animal de sepse induzida por CLP, a hipotermia
é mais frequente, sendo mais duradoura quando há um maior extravasamento de fezes para a cavidade abdominal, modulado pelo número e calibre das perfurações no ceco81,117. A hipotermia também é utilizada como forma de terapia em casos de
encefalopatia hipóxico isquêmica, pois com a diminuição da temperatura corporal há uma diminuição da taxa metabólica, diminuindo a produção de EROs e de mediadores inflamatórios, assim diminuindo a neuroinflamação118.
Estudos com administração e inibição de citocinas mostram a sua influência na modulação da temperatura corporal. As interleucinas IL-1β e IL-6 desempenham ação pirogênica e o TNF-α antipirética116. A febre pode ser estimulada pela administração
sistêmica (intraperitoneal ou intravenosa) ou diretamente no SNC de IL-1β119. A ação
pirogênica da IL-6, pode ser comprovada, pois em animais que não expressam esta citocina, ao ser induzida a sepse, não desenvolveram febre, somente hipotermia116.
Além da febre, a liberação excessiva de IL-1β diminui a motivação por alimento, provocando anorexia, o que pode ser observado em animais com infecção aguda ou quando administrado a própria citocina120. A anorexia é um dos primeiros
sinais de comportamento doentio observado. Esta alteração comportamental tem como estratégia a redução dos níveis sanguíneos de ferro, sendo este fundamental para a multiplicação bacteriana115. Em modelos animais de sepse é observado uma
de três dias81,121. Apesar de ser uma alteração comportamental breve, a redução do
peso corporal, como consequência da diminuição do consumo, é observada por até uma semana70,81.
Associado à redução de consumo de alimento, também é reduzido o consumo de água. A sede é modulada devido a hipovolemia e hiperosmolaridade causada pela desidratação, via ativação dos neurônios relacionados a osmorregulação localizados nos órgãos circumventriculares122. A ativação desta região gera uma ativação do
córtex pré-frontal e do hipotálamo estimulando a liberação de vasopressina, hormônio antidiurético. A sepse, porém, causa danos a estas regiões encefálicas, levando a uma diminuição do mecanismo de sede, apesar de haver hiperosmolaridade e hipovolemia122,123.
Alterações no eixo HPA, sistema responsável pela produção e liberações de diversos hormônios, inclusive os relacionados ao estresse, possuem ligação com alteração do consumo de alimento e de massa corporal, estando associado ao aumento da glândula adrenal e aos níveis de corticosterona e hormônio adrenocorticotrófico (ACTH; do inglês, adrenocorticotropic hormone)70,102,124. Estas
alterações podem ser revertidas com o uso de corticosteóides, alterando os níveis de corticosterona, BDNF, ACTH em hipocampo102,125.
O consumo de alimento e água também estão relacionados ao comportamento de letargia, caracterizada pela diminuição de movimentos locomotores. Ao não sentir fome e sede, o animal diminui a sua motivação de movimentação, diminuindo então o gasto de energia115. No SNC, o núcleo accumbens demonstra estar relacionado ao
sistema de recompensa, bem como alterações nesta estrutura são relacionadas ao comportamento de fadiga e diminuição da energia dos animais111. Em modelos
pré-clínicos em roedores, a letargia é avaliada pela atividade locomotora do animal seja na caixa de alojamento ou em um outro ambiente, por exemplo no aparato de habituação em campo aberto. Porém, a avaliação da atividade locomotora fora da caixa de alojamento tem agregado a motivação de explorar um ambiente novo. A distância percorrida, o número de quadrantes cruzados (crossing) e os levantamentos nas patas traseiras (rearing) podem ser utilizadas como parâmetros de avaliação da atividade locomotora, podendo ser correlacionados126. Animais que recebem
anestesia e a manipulação cirúrgica, porém sem a indução de sepse (chamado de grupo sham), desenvolvem letargia transitória, com duração média de 24h, mas os
animais que desenvolvem sepse têm uma redução significativa da sua atividade locomotora persistindo por diversos dias81.
Comportamentos do tipo depressivo também caracterizam o comportamento doentio106. Sendo assim, diversos estudos mostram a influência de marcadores
inflamatórios no desenvolvimento da depressão, também estando relacionado ao delirium e a outros transtornos psiquiátricos9,108,127,128. A amígdala é a estrutura
cerebral principalmente associada a alterações do tipo depressivo, porém, alterações em hipocampo e hipotálamo também podem estar envolvidas129. A anedonia,
incapacidade de sentir prazer ou falta de motivação para realizar tarefas prazerosas, pode ocorrer durante o processo inflamatório e também persistir após a eliminação do patógeno130. Este tipo de comportamento pode ser avaliado em animais através da
preferência do consumo de solução de glicose, ao invés de água. Animais em estado saudável demonstram preferência pela água açucarada, enquanto que há uma redução no interesse por esta solução durante o processo inflamatório130,131.
A neuroinflamação, seja via ativação do nervo vago ou via citocinas, está relacionada à diminuição da interação social113. Em modelo animal de sepse induzida
por CLP a redução na interação social foi observada por até 72h em animais com sepse, enquanto que os animais controle reestabelecem o contato social com outros animais em 48h81.
Apesar de o comportamento doentio ter sido denominado pela primeira vez por Hart em 1988104, ainda existem poucos estudos avaliando em modelos experimentais
de sepse. O estudo mais completo na literatura é o de Granger et al81, realizado em
camundongos com indução de sepse por CLP, observaram o consumo de água e ração, peso corporal, temperatura corporal e atividade locomotora durante 23 dias. Houve uma diminuição significativa do consumo de ração e água durante três dias após a indução, porém, os animais retornaram ao peso normal somente após oito dias. Além disso, a temperatura corporal e a atividade locomotora permaneceram alteradas até o final do experimento. A ausência de disputas e a diminuição do contato entre animais com sepse e outro animal saudável foi observada em 72h após CLP. A presença e a expressão das citocinas TNFα, IL-1β e IL-6 foram aumentadas nas regiões do hipocampo, hipotálamo e tronco cerebral em até oito vezes, comparadas a animais saudáveis, em até 3 dias.
O aumento de citocinas pró-inflamatórias, como TNFα, IL-1β e IL-6, no cérebro está associada a complicações, como o comportamento doentio prolongado,
comportamento do tipo depressivo e disfunção cognitiva a longo prazo132. Godbout et
al107 em seu estudo demonstraram que em ratos idosos que receberam LPS, houve
neuroinflamação exacerbada e prolongado comportamento doentio, levando a alterações como delirium, comportamento do tipo depressivo e características neurodegenerativas.
1.1.3.6. Escalas de avaliação clínica dos animais
Atualmente, existem dois sistemas de pontuação para avaliação da severidade da sepse em animais: M-CASS133 e MSS134. No sistema de avaliação clínica da
severidade da sepse em camundongos M-CASS133 (do inglês, mouse clinical
assessment score for sepsis) foi proposto a avaliação clínica de oito sinais indicativos de severidade da sepse (aspecto do pelo, atividade, postura, comportamento, movimento do peito, ruídos respiratórios, abertura dos olhos e alteração de peso). Nesse sistema, os animais são classificados de saudáveis (pontuação 1) a sepse severa (pontuação 4), conforme os critérios estabelecidos em uma tabela de avaliação. No sistema M-CASS, foram realizadas as avaliações utilizando dois modelos de choque séptico: por indução de pneumonia com K. pneumoniae e por administração intraperitoneal de LPS. Ambos modelos apresentaram pontuação elevada por três dias. Também foi verificada uma associação entre a pontuação M-CASS e citocinas pró-inflamatórias, anti-inflamatórias, dano oxidativo e dano orgânico aos rins e fígado. Apesar do sistema M-CASS apresentar uma ótima associação com a severidade da sepse, não apresenta uma boa reprodutibilidade em outros laboratórios, devido ao alto grau de detalhamento e a necessidade de treinamento dos avaliadores para poder detectar os sintomas. Além disso, por ter sido realizado em modelo de sepse por pneumonia, os critérios de severidade de “ruídos respiratórios” e “dispneia” não são observados em outros modelos de sepse135. Bem como
alterações posturais são alteradas nos animais quando submetidos a indução por CLP, não sendo um indicativo de sepse, mas sim, do processo cirúrgico em si.
Na escala de sepse para roedores MSS134 (do inglês, murine sepsis score) são
utilizados sete critérios clínicos (aparência, nível de consciência, atividade, resposta a estímulos, olhos, frequência respiratória e qualidade respiratória), classificados em cinco estágios. Este estudo realizou a avaliação de camundongos com sepse induzida por peritonite fecal (FIP; do inglês, fecal induced peritonitis) durante 24 horas, onde
