Testes in vivo

O animal usado durante todo o estudo foi o rato da estirpe Wistar existente no Biotério da Faculdade de Ciências Médicas (FCM) da Universidade Nova de Lisboa (UNL) creditado pelo alvará emitido pela DGAV de onde consta a autorização de utilização de animais, pequenos roedores, ao abrigo do disposto na Portaria 1005/92 de 23 de Outubro. É um Biotério que garante o estatuto sanitário SPF (Specific Pathogen Free), ou seja, garante que os animais são mantidos em sistemas de barreiras sanitárias rigorosas, de forma a manter a boa qualidade microbiológica.

Os procedimentos praticados nos animais regem-se pela Legislação Portuguesa e Europeia apresentada no capítulo 3 secção 3.4.1.

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Os animais estão todos em gaiolas individuais com cama de serradura específica e no pós- operatório permanecem no recobro do biotério até ao dia da eutanásia. No recobro existe ventilação, humidade e temperatura controladas, ciclo de luz/escuro de 12 h/12 h e água e alimentos de acordo com as normas.

A prática de experimentação animal foi da responsabilidade da Doutora Maria Angélica Rato da Silva Roberto, médica investigadora devidamente creditada ao abrigo do ponto iii), da alínea e), do nº3 da Portaria nº 1005/92, de 23 de Outubro.

As experiências com os animais envolveram três fases: planeamento das experiências, procedimento cirúrgico e histologia.

4.6.1 Planeamento das Experiências

Seguindo a estratégia transversal a toda a tese foram em primeiro lugar analisadas as matrizes unitárias. Mediante os resultados destas, usaram-se as matrizes binárias e ternária. No geral as matrizes apresentavam espessuras entre 120 m e 150 m. O procedimento envolveu a utilização de um total de 26 ratos (peso médio: 250 g, idade: 6 a 12 meses) distribuídos como mostra a Tabela 3.2.

Tabela 4. 2 Distribuição do número de ratos por matriz.

Matriz Nº de Ratos Matriz Nº de Ratos

M1 – PCL 6 M4 – CS/PCL 2

M2 - Quitosano (CS) 6 M5 – CS/GEL 2

M3 – Gelatina (GEL) 6 M6 – PCL/GEL 2

M7 – CS PCL/GEL 2

O protocolo seguido nas matrizes unitárias envolveu a utilização de 3 réplicas dos materiais em 3 tempos distintos de permanência na ferida, definidos como T1 - material removido após 1 semana, T2 - material removido após 2 semanas e T3 - material removido após 4 semanas. A experiência foi planeada de forma a que em cada rato fossem aplicadas duas matrizes, a serem removidas em tempos diferentes ou 1 matriz e um controlo (neste a ferida apenas era tapada com gaze gorda). Os controlos também foram feitos em triplicado para cada tempo.

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Nas matrizes binárias e ternária foram utilizadas 2 réplicas dos materiais em 2 tempos distintos de permanência, T2 - material removido após 2 semanas e T3 - material removido após 4 semanas. A experiência foi conduzida de forma que dos dois ratos disponíveis para cada matriz, num deles fossem aplicadas duas matrizes as quais eram removidas em tempos diferentes e no outro fossem aplicadas 2 matrizes e 2 controlos.

4.6.2 Procedimento Cirúrgico

Em primeiro lugar procedeu-se à identificação do animal, seguindo-se a sua anestesia com uma mistura de cetamina e diazepam na proporção 2:1. Uma vez sob efeito anestésico, o pêlo do animal foi removido com uma máquina de barbear. Seguidamente foi aplicado um spray antisséptico sobre a pele e depois com uma caneta dermográfica marcaram-se dois quadrados com cerca de 22 cm2_{, com uma}

distância mínima de 1 cm entre eles, sob a zona dorsal do rato. Nas matrizes binárias e ternária aplicou-se um passo extra, que consistiu na lavagem com água, na zona onde se removeu o pêlo, de modo a diminuir a probabilidade de caírem alguns resíduos de pêlos para dentro da ferida. O passo seguinte consistiu no procedimento cirúrgico, demonstrado e descrito na Figura 4.7.

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79 Figura 4. 7 Procedimento cirúrgico.

A) Desenharam-se no animal com uma caneta dermográfica as regiões cuja pele total se pretendia retirar. B) Procedeu-se à remoção da pele cosendo-se em seguida os bordos da pele ao plano interno para tentar

minimizar a contracção da ferida;

C) Colocaram-se as matrizes sobre as feridas (sempre do mesmo material); apenas se cosia a membrana à pele caso esta não aderisse totalmente à ferida (por ex. o PCL).

D) Neste exemplo colocou-se uma membrana, à direita, e um controlo, à esquerda.

E) Fim dos actos cirúrgicos; a ferida é tapada com uma gaze normal e agrafada, apenas para evitar que o rato removesse as membranas após acordar da anestesia.

C) D)

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Concluídos os actos cirúrgicos, os ratos foram colocados no recobro até à altura de remoção das biópsias. Todos os períodos foram acompanhados por registo fotográfico. O procedimento seguido na remoção da primeira biópsia consistiu em anestesiar novamente o animal, proceder à remoção da biópsia, a qual era cuidadosamente colocada num frasco com formaldeído a 4% tamponado, para posterior análise histológica. A ferida era encerrada, cosendo-se ou agrafando. Estas etapas podem ser visualizadas na Figura 4.8. Finalmente, a remoção da última biópsia coincidia com a eutanásia do animal. O rato era eutanasiado com CO2 e depois então removida a biópsia. No final, o rato era colocado num saco, onde se

indicava o seu código e era colocado num frigorífico para subsequente incineração.

Figura 4. 8 Processo de remoção da biópsia.

A) Aspecto das feridas 7 dias após a cirurgia. Animal anestesiado. B) Remoção da primeira biópsia (lado esquerdo).

C) Encerramento da ferida com agrafos.

A) B)

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81 4.6.3 Histologia

As biópsias permaneceram em formol tamponado a 4% até ao processamento histológico no Serviço de Anatomia Patológica do Hospital de São José.

O processamento histológico seguiu o protocolo:

- processamento automático no processador de tecidos onde os fragmentos provenientes da macroscopia são sujeitos a uma série de etapas com o objectivo de os desidratar, diafanizar e impregnar com parafina;

- inclusão em parafina em moldes próprios de forma a obter um bloco de parafina contendo os fragmentos processados;

- corte dos blocos de parafina em aparelho próprio (micrótomo de corrediça) a uma espessura de 2 a 4 m. Estes cortes são colocados em lâminas de vidro depois de esticadas em água quente (cerca de 60 ºC). As lâminas de seguida vão para uma estufa a cerca de 80 ºC para que os cortes adiram bem à lâmina;

- coloração de hematoxilina-eosina no colorador automático. A hematoxilina, de origem natural, funciona como corante básico e tem atracção por substâncias ácidas que compõem os tecidos, como as proteínas, ricas em radicais amina, como os núcleos e o retículo endoplasmático rugoso e ácidos nucleicos. Já a eosina, corante sintético ácido, é atraída pelos elementos básicos das proteínas do citoplasma das células, fibras de colagénio e outras estruturas compostas de substâncias com carácter básico. A hematoxilina cora em azul-púrpura enquanto a eosina produz uma coloração vermelha, permitindo a detecção de alguma patologia nos tecidos;

- montagem em meio de montagem sintético à base de xilol, em aparelho automático.