Testes de segurança in vitro

Devido à evolução técnico-científica, na década de 80 iniciou-se o desenvolvimento de modelos experimentais alternativos para a área cosmética, em substituição ao uso de animais de laboratório. Metodologias foram desenvolvidas, inicialmente, para responder corretamente às necessidades de pesquisa em farmacologia, onde se sabe que o comportamento animal pode ser diferente do humano. Os métodos alternativos também foram contemplados para a avaliação de efeitos toxicológicos (137)_.

Para avaliação toxicológica de produtos, são necessários testes que comprovem a segurança, tais como toxicidade sistêmica aguda, irritação e corrosividade cutânea, irritação ocular, sensibilização dérmica, absorção cutânea, toxicidade subaguda e

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subcrônica, genotoxicidade e mutagenicidade, efeitos tóxicos induzidos por raios UV (fototoxicidade, fotoalergia e fotogenotoxicidade), toxicocinética e metabolismo, carcinogenicidade e reprodução e toxicidade do desenvolvimento (137).

Visando a segurança do consumidor frente aos produtos com componentes naturais, novas substâncias ativas de origem vegetal devem ser avaliadas extensivamente, quanto a sua toxicidade. Atualmente, os testes de toxicidade em animais são contestados pelos pesquisadores, levando ao desenvolvimento de novas metodologias que utilizam linhagens especializadas de células, resultando em ensaios confiáveis e esclarecedores (138).

A União Europeia determinou prazos para a redução e substituição de testes em animais. Isto atingiu o mercado mundial e os países vêm tentando se adequar a esta realidade. Estas considerações e avanços em testes clínicos e in vitro têm colaborado para um intenso esforço da comunidade científica para o desenvolvimento de métodos alternativos baseados em sistemas de testes in vitro (uso de pele de ratos, suínos ou humanos ex vivo ou em modelos de pele reconstituída) (139).

Vários esforços têm sido efetuados para a diminuição do uso e do sofrimento de animais (140)_{. Em 1984, o Governo Britânico concedeu fundos para o desenvolvimento de}

métodos alternativos ao FRAME - Fund for Replacement of Animal Medical Experiments que, desde 1983, edita uma revista internacional intitulada ATLA - Alternatives to

Laboratory Animals.

Em 1994, foi inaugurado o ECVAM – European Committee for Validation of

Alternative Methods - instituição da Comissão Européia encarregada de promover e validar

técnicas e metodologias destinadas à substituição dos ensaios em animais (141).

Algumas instituições, como CTFA - Cosmetic, Toiletries and Frangrance

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Administration e Alternatives to Animal Testing, John Hopkins University, Baltimore -

EUA, são referências para acelerar a padronização e a harmonização de metodologias in

vitro (137).

A ideia de ensaios alternativos é muito mais abrangente do que a substituição do uso de animais, incluindo também a questão da redução e refinamento na utilização dos mesmos. Este princípio está baseado no conceito dos 3R’s (Three R’s), o qual foi definido por William Russell e Rex Burch (142), no livro Principles of Human Experimental

Technique. Os 3 R’s, que representam o refinamento, redução e substituição (Refine, Reduction e Replacement), têm como estratégia uma pesquisa racional minimizando o uso

de animais e o seu sofrimento, sem comprometer a qualidade do trabalho científico que está sendo executado, visualizando, futuramente, a total substituição de animais por modelos experimentais alternativos (142).

O termo refinamento refere-se à modificação de algum procedimento operacional envolvendo animais, objetivando minimizar a dor e o estresse. A experiência da dor e do estresse resulta em mudanças psicológicas que aumentam a variabilidade experimental dos resultados. O interesse dos cientistas é assegurar que as condições ambientais para os animais sejam as melhores possíveis. Os testes considerados menos invasivos podem ser utilizados para diminuir a angústia causada durante o estudo. Além disto, é importante que toda a equipe envolvida seja bem treinada e competente no que se refere a correta atitude em relação aos animais (143).

A concepção de redução como alternativa estratégica, resulta em menor número de animais sendo utilizados para obter a mesma informação, ou maximização da informação obtida por animal. Existem várias possibilidades para redução do uso de

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animais, de forma que se opte pelas pesquisas que utilizem os vários órgãos de um mesmo animal, associadas aos dados apropriados e princípios estatísticos. Em outros casos, pode-se executar um estudo piloto indicando se o procedimento será apropriado para um estudo maior. Para tanto, é possível a utilização de estudos preliminares in vitro, os quais podem indicar novos caminhos, utilizando técnicas não invasivas (137).

Os ensaios biológicos utilizados para avaliação de segurança de produtos cosméticos, entre eles o teste de sensibilidade de pele, irritação ocular, fototoxicidade e citotoxicidade geram discussão entre os pesquisadores, e cabe, portanto, ao profissional envolvido em questões técnico-científicas, o bom senso na utilização de ensaios toxicológicos e a busca de abordagens alternativas, evitando sempre que possível a morte e o sofrimento desnecessários dos animais de experimentação (144)_.

Um sistema experimental que esteja vinculado à totalidade da condição de vida animal, pode ser considerado como um substituto alternativo. Pode-se citar a proposta de obtenção de células, tecidos ou organismos para subsequentes estudos in vitro ao invés da matança de animais (137).

Cerca de 20 diferentes critérios são utilizados na determinação da toxicidade geral. As células são expostas a diferentes concentrações da substância-teste por um período de tempo e, posteriormente, o grau de inibição de viabilidade e/ou condições funcionais das células são avaliados. Os métodos mais utilizados são: análise histológica através de microscopia comum, número, morfologia, crescimento, divisão e metabolismo celular, integridade de membrana, atividade mitocondrial, lisossomal e ribossomal (145).

Critérios menos comuns, mas também de grande valor (estudos mecanísticos), são: análise ultra-estrutural por microscopia eletrônica de transmissão, frequência mitótica utilizando análise cariotípica, retenção do azul de tripan entre outras (146)_.

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Os testes de citotoxicidade definem o potencial de degeneração ou morte celular provocado pela formulação cosmética. Assim, resultados positivos no ensaio de citotoxicidade descaracterizam a condição de inocuidade do cosmético, sendo possível causar processos de irritabilidade nos usuários (147).

Algumas técnicas para determinação de citotoxicidade utilizam substâncias que são incorporadas ou transformadas em produtos coloridos apenas por células vivas, mas não por células mortas ou são transformados pelo próprio meio de cultivo. A formação desses produtos reflete o endpoint tóxico e quantifica o número de células viáveis, mostrando uma relação linear entre esses dois parâmetros (148).

Os métodos colorimétricos são realizados em placas de microtitulação, leitura em espectrofotômetro multicanal automático e oferecem vantagens como simplicidade, rapidez, custo e segurança. A técnica desenvolvida por Mosmann (149) baseia-se na quebra do sal de MTT tetrazólio (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide), o qual é reduzido em produto corado por enzimas microssomais e, em menor parcela, pela enzima mitocondrial succinato desidrogenase. Esta reação ocorre exclusivamente em células vivas e a quantidade de formazana formada é proporcional ao número de células viáveis (150).

Outro método colorimétrico utiliza o vermelho neutro (2,8-Phenazinediamine,

N8,N8,3-trimethyl-, hydrochloride), corante supra vital, fracamente básico, catiônico e

solúvel em água, que é absorvido pelas células por pinocitose ou transporte ativo através da membrana plasmática e acumulam-se apenas nos lisossomas de células vivas (151).

A fototoxicidade é uma reação aguda, que pode ser induzida por um simples tratamento com uma substância química e concomitante exposição à radiação ultravioleta ou visível (152)_.

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As dermatites fototóxicas são limitadas à área de exposição à luz, decorrentes de mecanismos imunológicos e geralmente são acompanhadas de hiperpigmentação e descamação (Figura 8). As dermatites fotoalérgicas são menos comuns e geralmente necessitam de exposições repetidas, sendo caracterizadas por eritema e edema (153).

Figura 8. Dermatite fototóxica (Copyright 1996 - 2014 DermIS) (154)_.

Para a determinação do potencial fototóxico, normalmente emprega-se o teste de captação do vermelho neutro, onde, células chamadas 3T3 são mantidas em cultura durante 24 horas para a formação de monocamadas. Duas placas por substância teste são pré- incubadas com concentrações diferentes da substância e em seguida, uma das placas é exposta à radiação UV e a outra é mantida no escuro, para ser usada como controle. Em ambas as placas, o meio de tratamento é depois substituído por meio de cultura e após 24 horas de incubação, a viabilidade celular é determinada por meio da incorporação do corante vermelho neutro (155).

Considerando-se que pode ocorrer a introdução acidental de cosméticos nos olhos, o teste de irritação ocular é extremamente importante para esta categoria de produtos. Atualmente, vários pesquisadores sugerem a utilização de métodos alternativos para a determinação da irritação ocular, como por exemplo, o teste de membrana

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córioalantóide do ovo de galinha (HET-CAM - Hen’s Egg Chorioallantoic Membrane

Test) (155).

O teste é baseado na observação, por um técnico treinado, dos sinais característicos de irritação (hiperemia, hemorragia e coagulação) (Figura 9) que podem ocorrer dentro de 5 minutos após a aplicação do produto-teste, puro ou diluído, em membrana corioalantóide (CAM) de ovo de galinha embrionado, no 9° ou 10º dia de incubação (156).

Figura 9. Membrana corioalantóide de ovo de galinha embrionado (157)_.

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O ensaio de HET-CAM visa avaliar semi-quantitativamente o potencial irritante de um produto-teste após sua aplicação em membrana corioalantóide de ovo de galinha embrionado (156).

Embora não seja um método oficialmente validado, o método HET-CAM é um modelo alternativo comumente utilizado pelas indústrias cosméticas e é aceito pelas autoridades regulatórias da Comunidade Européia (152)_.

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2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

O objetivo principal deste trabalho foi avaliar a segurança e a eficácia do extrato de Caryocar brasiliense obtido por CO2 supercrítico visando sua aplicação

cosmética.