i
LILIAN FERREIRA BARBOSA AMARAL
AVALIAÇÃO DA SEGURANÇA E EFICÁCIA DO EXTRATO DE
Caryocar brasiliense
OBTIDO POR CO
2SUPERCRÍTICO E SUA
APLICAÇÃO COMO ATIVO PARA FORMULAÇÕES
ANTISSÉPTICAS
CAMPINAS 2014
iii
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
LILIAN FERREIRA BARBOSA AMARAL
AVALIAÇÃO DA SEGURANÇA E EFICÁCIA DO EXTRATO DE
Caryocar brasiliense OBTIDO POR CO
2SUPERCRÍTICO E SUA
APLICAÇÃO COMO ATIVO PARA FORMULAÇÕES
ANTISSÉPTICAS
Orientadora: Profa. Dra. Priscila Gava Mazzola
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade de Campinas para obtenção do título de Doutora em Ciências Médicas, área de concentração em Ciências Biomédicas.
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA LILIAN FERREIRA BARBOSA AMARAL E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. PRISCILA GAVA MAZZOLA.
--- Assinatura do Orientador
CAMPINAS 2014
vi
ix
DEDICATÓRIA
A Deus, que cuida de mim todo o tempo. Aos meus pais, Zélia e Santiago, pelo amor incondicional. Ao meu amado esposo, Helberth, pelo apoio em todos os momentos e por se orgulhar das minhas conquistas, que na verdade, são nossas. Ao meu príncipe Arthur, que embora pequenininho, já se alegra com a minha
xi
AGRADECIMENTOS
Eu agradeço a Deus, que nunca me deixa sozinha, que me abençoa além de meus merecimentos.
Agradeço ainda à intercessora que tenho no céu, que me conduz a Deus.
Aos meus pais, que dignamente me formaram para a vida, apontando o caminho da honestidade e persistência.
Ao meu marido por acreditar em mim, pelo amor tão sincero e por motivar o meu crescimento. Agradeço em especial, pela nossa maior dádiva, nosso filho Arthur!
Aos meus irmãos Rany e Polly, que mesmo estando distante, amo incondicionalmente.
Aos meus sogros Luzia e Antônio, pelo carinho e pela oração sempre constante. À Profa. Dra. Priscila Gava Mazzola, orientadora deste trabalho, por acreditar e confiar em mim, incentivado cada conquista. Sem você, talvez eu não tivesse chegado até aqui!
À diretoria da empresa Chemyunion Química LTDA, pela oportunidade de crescimento pessoal e profissional.
À Cecilia Nogueira, gerente de Pesquisa e Desenvolvimento da Chemyunion, pelas palavras de motivação.
xii
À Ana Paula Vilar, coordenadora da Garantia da Qualidade da Chemyunion, por compreender os meus anseios.
Aos colegas Marcos Rossan, Lilian Mussi e Wagner Magalhães pela contribuição técnica.
À Ângela Jozzala que esteve presente em vários momentos deste trabalho, sempre generosa em compartilhar seu conhecimento.
À Dra. Mary Ann pelo suporte nas análises fitoquímicas e na redação de um dos artigos científicos.
À Aline Dutra e Sílvia Bueno, minhas “filhinhas”, que deixaram de ser colegas de trabalho e se tornaram amigas.
À FAPESP - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo. À FCM - Faculdade de Ciências Médicas.
Aos colaboradores do programa de pós-graduação da Faculdade de Ciências Médicas.
Ao departamento de Patologia Clínica pela oportunidade.
xiii
“Sê humilde para evitar o orgulho, mas voa alto para alcançar a sabedoria."
xv Sumário
RESUMO ... xxvii
ABSTRACT ... xxix
1. INTRODUÇÃO ... 31
1.1 Pequi (Caryocar brasiliense Cambess) ... 37
1.2 Extração por dióxido de carbono supercrítico ... 43
1.3 Produtos naturais e atividade antimicrobiana ... 50
1.4 Antioxidantes ... 59
1.5 Testes de segurança in vitro... 64
2. OBJETIVOS ... 73
2.1 Objetivo geral ... 73
2.2 Objetivos específicos ... 73
3. MATERIAL E MÉTODOS ... 77
3.1 Obtenção do material vegetal ... 77
3.2 Obtenção dos extratos supercríticos ... 77
3.3 Avaliação do perfil fitoquímico ... 78
3.4 Determinação da atividade antimicrobiana ... 78
3.4.1 Microrganismos utilizados ... 78
3.4.2 Meios de cultura ... 79
3.4.3 Preparo dos meios de cultura ... 79
3.4.4 Obtenção e conservação dos microrganismos ... 80
3.4.5 Padronização dos inóculos ... 80
xvi
3.5 Preparo das formulações ... 82
3.6 Avaliação da qualidade microbiológica das formulações ... 84
3.7 Avaliação da atividade antisséptica ... 85
3.8 Avaliação da atividade antioxidante ... 85
3.8.1 Cultura de fibroblastos humanos ... 85
3.8.2 Incubação com o produto-teste ... 86
3.8.3 Determinação da atividade antioxidante ... 86
3.9 Avaliação da irritação ocular - HET-CAM (Teste na membrana corioalantóide do ovo de galinha) ... 89
3.9.1 Preparação do produto-teste ... 90
3.9.2 Preparação dos ovos ... 90
3.9.3 Determinação do potencial irritante ... 90
3.10 Avaliação da citotoxicidade e fototoxicidade ... 93
3.10.1 Cultivo celular ... 93
3.10.2 Determinação da citotoxicidade pelo método do XTT ... 94
3.10.3 Avaliação da fototoxicidade pelo método do vermelho neutro (3T3 NRU)96 3.11 Avaliação da estabilidade das formulações ... 99
3.12 Análises estatísticas ... 100
4. RESULTADOS ... 101
4.1 Obtenção dos extratos supercríticos ... 103
4.2 Screening do extrato bruto ... 105
4.3 Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) ... 105
4.4 Avaliação da qualidade microbiológica das formulações ... 107
xvii
4.6 Atividade antioxidante ... 109
4.7 Avaliação da irritação ocular ... 110
4.8 Avaliação da citotoxicidade ... 112
4.9 Avaliação do potencial fototóxico ... 114
4.10 Avaliação da estabilidade das formulações ... 115
5. DISCUSSÃO ... 121 6. CONCLUSÃO ... 143 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 147 ANEXO I ... 183 ANEXO II ... 183 ANEXO III ... 185
xix
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ABTS: (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid).
AIDS: Síndrome da imunodeficiência adquirida (Acquired Immunodeficiency Syndrome). ANOVA: Análise de variância (Analysis of variance).
ATLA: Alternatives to Laboratory Animals. ATP: Adenosina tri-fostato.
BHA: Butilhidroxianisol.
BHI: Caldo infusão de cérebro e coração. BHT: Butilhidroxitolueno
CBSE: Extrato supercrítico de Caryocar brasiliense (Caryocar brasiliense supercritical
extract).
CCD: Cromatografia de camada delgada. CIM: Concentração inibitória mínima.
CTFA: Cosmetic and toiletries fragance association. DNA: Ácido desoxirribonucleico (deoxyribonucleic acid). DPPH: 2,2-difenil-1-picril-hidrazila.
EBSS: Solução salina balanceada de Earle (Earle's Balanced Salt Solution). ECVAM: European committee for validation of alternative methods. EGF: Fator de crescimento epidérmico (Epidermal growth factor).
xx ERN: Espécie reativa de nitrogênio.
ERO: Espécie reativa de oxigênio. FDA: Food and drug administration. FIOCRUZ: Fundação Oswaldo Cruz.
FRAME: Fund for replacement of animal medical experiments. GRAS: Generally Recognized as Safe.
HET-CAM: Hen's Egg Test – Chorioallantoic Membrane.
IBAMA: Instituto brasileiro do meio ambiente e dos recursos naturais renováveis.
INCI: Nomenclatura cosmética Internacional (International nomenclature of cosmetic
ingredient).
IRAG: Interagency Regulatory Alternatives Group. MH: Muller Hinton
MTT: 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide). NIEHS: National institute of environmental health sciences.
NRU: Ensaio de captação do corante vermelho neutro (Neutral red uptake). OMS: Organização mundial da saúde.
P.A: Para análise.
PBS: Tampão fosfato-salino (Phosphate buffered saline). PG: Propil galato.
xxi PIF: Fator de fotoirritação (Photo-irritation factor)
REACH: Regulation on Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of
Chemicals.
RNA: Ácido ribonucleico (ribonucleic acid). RPMI: Roswell park memorial institute. SAB: Agar sabouraud dextrose.
SDS: Dodecil sulfato de sódio (Sodium dodecyl sulfate). TAA: Atividade antioxidante total (Total antioxidant activity). TBHQ: Terciobutilhidroquinona.
TSA: Ágar soja tripticaseína (Trypticase soy Agar). TSB: Caldo soja tripticaseína (Trypticase soy broth). UFC: Unidade formadora de colônia.
UV: Ultravioleta.
XTT: Sodium 3´-[1-(phenylaminocarbonyl) – 3,4–tetrazolium]–bis (4-methoxy-6-nitro)
xxiii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Pequizeiro ... 38
Figura 2. Diagrama pressão x temperatura para um componente puro. ... 45
Figura 3. Extrator CO2 supercrítico ... 47
Figura 4. Parede celular bacteriana. ... 55
Figura 5. Área foto-exposta ... 59
Figura 6. Área não foto-exposta ... 59
Figura 7. Estrutura química dos principais antioxidantes sintéticos. ... 61
Figura 8. Dermatite fototóxica. ... 69
Figura 9. Membrana corioalantóide de ovo de galinha embrionado. ... 70
Figura 10. Etapas de execução do método ABTS ... 88
Figura 11. Esquema das etapas do método XTT. ... 94
Figura 12. Esquema da distribuição dos controles do teste em microplaca de 96 poços .... 95
Figura 13. (A) Curva global de extração de Caryocar brasiliense e (B) Curva de extração referente à massa de extrato obtida versus tempo de extração ... 103 Figura 14. Concentração de antioxidantes em lisado celular tratado com extrato de
Caryocar brasiliense obtido por CO2 supercrítico (CBSE). ... 109 Figura 15. Placa de 96 poços utilizada na determinação do potencial citotóxico do CBSE em fibroblastos murinos (3T3) pelo método do XTT ... 112
xxiv
Figura 16. Avaliação do potencial citotóxico do CBSE em fibroblastos murinos (3T3) após 48 horas de incubação pelo método do XTT. ... 113 Figura 17. Avaliação do potencial fototóxico do CBSE em fibroblastos murinos (3T3) após 60 minutos de incubação pelo método do Vermelho Neutro (3T3 RNU) .... 114 Figura 18. Avaliação de pH da loção hidratante testada durante o estudo de estabilidade.
... 116 Figura 19. Avaliação de pH do sabonete líquido testado durante o estudo de estabilidade.
xxv
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Composição da loção hidratante ... 83
Tabela 2. Composição do sabonete líquido ... 84
Tabela 3. Pontuação dos fenômenos ocorridos em função do tempo ... 92
Tabela 4. Classificação do potencial irritante de acordo com a pontuação atingida ... 92
Tabela 5: Classificação da citotoxicidade em função da IC50. ... 96
Tabela 6. Classificação da fototoxicidade em função do PIF. ... 99
Tabela 7. Rendimento de extração de Caryocar brasiliense. ... 104
Tabela 8. Valores da concentração inibitória mínima (CIM) do CBSE e da solução de etanol ... 106 Tabela 9. Avaliação da sensibilidade antimicrobiana... 107
Tabela 10. Atividade antisséptica do CBSE ... 108
Tabela 11. Graduação dos fenômenos observados em relação ao tempo – CBSE 100% . 110
Tabela 12. Graduação dos fenômenos observados em relação ao tempo – CBSE 10% ... 111
Tabela 13. Estudo de estabilidade da loção hidratante ... 117
xxvii
RESUMO
As indústrias cosméticas e farmacêuticas têm um crescente interesse na substituição dos antimicrobianos sintéticos nos produtos dermatológicos, devido à resistência dos microrganismos aos antimicrobianos convencionais. O pequi (Caryocar brasiliense) é uma frutífera nativa do Cerrado brasileiro utilizada na medicina popular, na indústria cosmética e na alimentação, com atividades leishmanicida e antimicrobiana descritas na literatura. O objetivo principal deste trabalho foi avaliar a segurança e a eficácia do extrato de Caryocar
brasilense obtido por CO2 supercrítico visando sua aplicação cosmética. A concentração inibitória mínima (CIM) frente às bactérias Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e
Staphylococcus aureus foi determinada pelo método clássico de microdiluição em placas. O
potencial antioxidante do extrato foi determinado por um método baseado na oxidação do 2,2-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS). Para avaliação da citotoxicidade e fototoxicidade in vitro, foram utilizados métodos colorimétricos baseados na conversão do corante tetrazólio (XTT) e o método do vermelho neutro (3T3 NRU), respectivamente. Na avaliação do potencial de irritação ocular empregou-se o teste na membrana corioalantóide do ovo de galinha (HET-CAM). O Perfil fitoquímico do extrato foi analisado quanto à presença de alcalóides, saponinas, antraquinonas, esteróides, taninos, flavonóides e compostos fenólicos, de acordo com métodos colorimétricos padronizados. Os resultados obtidos indicam que o extrato de Caryocar brasilense obtido por CO2
supercrítico demonstra atividade antimicrobiana frente às bactérias testadas, além de potencial antioxidante comparado ao padrão testado. Adicionalmente, o extrato de
Caryocar brasilense obtido por CO2 supercrítico não apresenta efeitos tóxicos, mostrando-se um extrato mostrando-seguro. Estes resultados fornecem perspectivas de demostrando-senvolvimento de produtos para o cuidado pessoal, principalmente aqueles com atividade antisséptica e os que minimizam os danos causados pelos radicais livres.
xxix
ABSTRACT
The cosmetic and pharmaceutical industries have an increasing interest in replacing synthetic antimicrobials in dermatological products due to increased microbial resistance to conventional antimicrobial agents. Caryocar brasiliense (pequi) is a typical Brazilian Cerrado fruit tree. Its fruit is used as a vitamin source for culinary purposes and as a source of oil for the manufacture of cosmetics. Leishmanicidal and antimicrobial activities have been reported previously. This study was designed to evaluate the safety and efficacy of C.
brasiliense extract obtained by supercritical CO2 extraction. The minimum inhibitory concentrations (MICs) against Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, and
Staphylococcus aureus were determined by the classical microdilution method. Antiseptic
activity against these organisms was evaluated by the plate diffusion method. The antioxidant potential of the extract was evaluated using a method based on the oxidation of 2,2-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS). In vitro cytotoxicity and phototoxicity of C. brasiliense supercritical CO2 extracts were assessed using a
tetrazolium-based colorimetric assay (XTT) and Neutral Red methods; eye irritation potential was assessed using the Hen's Egg Test – Chorioallantoic Membrane (HET-CAM) Test Method. The extract’s chemical profile was analyzed for the presence of alkaloids, saponins, anthraquinones, steroids, tannins, flavonoids, and phenolic compounds according to standard colorimetric methods. The C. brasiliense supercritical CO2 extract exhibits
antimicrobial activity against all bacteria tested. It also possesses antioxidant activity, when compared to a vitamin E standard. We also found that the C. brasiliense (pequi) extract obtained by supercritical CO2 extraction did not present cytotoxic and phototoxic hazards
This finding suggests that C. brasiliense supercritical may be useful for the development of cosmetic and/or pharmaceutical products, primarily for antiseptic skin products that inactivate, reduce, prevent, or arrest the growth of microorganisms with the inherent intent to mitigate or prevent disease as well as products that minimize damage caused by free radicals.
31
33
1. INTRODUÇÃO
Desde a Antiguidade, o homem procurou conhecer as plantas e suas propriedades medicinais. Muitas descobertas casuais são, atualmente, comprovadas pela ciência, como por exemplo, a sua utilização para o desenvolvimento de medicamentos, desenvolvimento de conservantes para alimentos e de produtos para o controle de insetos (1).
A humanidade depende diretamente da biodiversidade para extrair ou produzir alimentos, cosméticos e medicamentos. O uso de produtos naturais para fins terapêuticos é tão antigo quanto a civilização humana. Por um longo tempo, produtos minerais, animais e vegetais foram as principais fontes de ativos farmacológicos. O homem primitivo utilizava as plantas na alimentação, na cura de doenças e também na agricultura. Atualmente, têm um potencial de uso crescente pelas indústrias cosméticas e farmacêuticas na busca de ativos naturais (2).
O número de plantas no planeta Terra é estimado entre 250.000 e 500.000 espécies (3). Desse total, cerca de 5% é utilizado como fonte de alimentos tanto para
humanos quanto para animais, e outros 5% têm propósito medicinal (4).
Dados literários sobre a utilização de espécies vegetais para a cura de doenças e outros males são encontrados desde a antiguidade. Intuitivamente, o homem primitivo buscava descobrir soluções para suas necessidades básicas como nutrição, reprodução e proteção. Pelas suas experiências e observações, evoluiu biologicamente, descobrindo nas plantas e ervas soluções para o tratamento de doenças. Além das plantas benéficas, descobriu as plantas nocivas, capazes de matar e produzir alucinações (5).
34
No Brasil, o emprego de plantas medicinais está presente desde antes da colonização. Os índios as utilizavam e, posteriormente, transferiram seus conhecimentos para os colonizadores, tornando-as amplamente utilizadas na medicina caseira (6).
No início do desenvolvimento dos fármacos, os materiais vegetais eram utilizados da maneira como eram encontrados no meio ambiente, depois, passaram a ser concentrados para intensificar e uniformizar a atividade terapêutica. À medida que os avanços da química surgiram, as substâncias ativas puderam ser identificadas, isoladas e usadas como moléculas sinteticamente elaboradas, com uma eficácia ainda maior (7).
Extratos de plantas ou seus componentes vêm despertando interesse no uso como antissépticos e agentes antimicrobianos em dermatologia principalmente devido ao aumento da resistência dos microrganismos aos agentes antimicrobianos convencionais (8, 9).
Esta alternativa foi baseada em princípios de convenções internacionais, com a participação do Brasil na Conferência da Organização Mundial da Saúde (OMS) em Alma-Ata em 1978, em Chiang-Mai em 1988 e na Conferência Mundial de Saúde de 1997. A OMS recomenda que as tecnologias de saúde devam ser postas ao alcance de toda a comunidade, com segurança científica, aceitabilidade social e sustentabilidade econômica (10, 11, 12, 13).
De acordo com o Decreto nº 5.813, de 22 de junho de 2006, foi aprovada a Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos que tem o papel de garantir à população, o acesso seguro e o uso correto de plantas medicinais e de remédios fitoterápicos. A medida também busca promover a utilização sustentável da biodiversidade brasileira e o desenvolvimento da cadeia produtiva e da indústria do setor (14).
35
A descoberta de agentes farmacologicamente ativos de origem natural tem contribuído para o tratamento de doenças humanas (15). A utilização de plantas contra infecções é uma prática antiga e os resultados alcançados compreendem desde um alívio de sintomas até a cura completa de doenças (16). Estima-se que 60% das drogas anti-tumorais e anti-infecciosas inseridas no mercado mundial ou que se encontram na fase de triagem clínica sejam de origem natural (17).
Embora o desenvolvimento da síntese orgânica e de novos processos biotecnológicos esteja disponível às indústrias cosméticas e farmacêuticas, 25% dos medicamentos utilizados nos países industrializados são provenientes de plantas. Aproximadamente 120 compostos de origem natural, obtidos a partir de cerca de 90 espécies de plantas, são utilizados na terapêutica moderna. Os produtos naturais estão envolvidos no desenvolvimento de 44% de todas as novas drogas (18).
O mercado de produtos cosméticos e farmacêuticos com componentes de origem vegetal ou mineral tem crescido muito nos últimos anos. De acordo com Farnsworth
et al. (19), a correlação entre o uso de uma planta na medicina tradicional e a presença de princípios farmacologicamente ativos com alguma ação terapêutica é altamente positiva. Estima-se que 74% dos medicamentos convencionais da atualidade tenham sido descobertos com base no seu uso tradicional. Por este motivo, a procura por compostos bioativos em produtos naturais tem causado grande repercussão internacional (20).
Na prática, os produtos de origem sintética são raramente associados a sérios danos à saúde. Entretanto, isto não significa que estes produtos sejam sempre seguros, especialmente quando são considerados os efeitos a longo prazo. Partindo do pressuposto de que estes produtos podem ser usados extensivamente durante um amplo período de
36
nossa vida, é extremamente necessário garantir a segurança e a eficácia dos mesmos, através do controle da toxicidade do produto final e dos seus ingredientes (21).
As reações ou sensibilizações provocadas pelos produtos sintéticos, bem como o excesso de efeitos colaterais, o uso abusivo, a prescrição indiscriminada e o emprego incorreto destes produtos, têm estimulado diversos pesquisadores na busca por substâncias de origem natural para substituição dos ativos sintéticos. Outro motivo que tem favorecido o crescimento da fitoterapia é a falta de acesso de parte da população mundial à medicina convencional, devido à situação econômica ou às condições oferecidas pelo sistema político econômico mundial ou ainda, pela política adotada pelas grandes indústrias farmacêuticas (22).
Muitas empresas estão conscientes das tendências de consumo e buscam novos ingredientes para incorporar aos produtos já existentes e aos que poderão ser desenvolvidos. Uma tendência que está se destacando é o aumento da procura, por parte da população, de produtos funcionais e seguros baseados em ativos naturais (23).
Normalmente, todas as partes da planta possuem substâncias ativas importantes, que são sintetizadas a partir do metabolismo primário, resultando em componentes bioquímicos de ação terapêutica. Por isso, o crescente o interesse dos consumidores em utilizar produtos menos agressivos e de origem natural, remetendo-se à pesquisa de produtos fitoterápicos e produtos naturais com valor conhecido, comprovado ou não, que são disponibilizados às indústrias cosméticas e farmacêuticas.
Assim, a seleção de ativos de origem vegetal para incorporação em produtos cosméticos ou farmacêuticos é uma tarefa bastante difícil, devendo ser feita à luz do conhecimento técnico específico disponível sobre sua estrutura química, aspectos microbiológicos, toxicológicos e legais, buscando substâncias naturais que sejam eficazes,
37
não apresentem efeitos tóxicos ou irritantes e atendam aos aspectos regulatórios dos países onde são fabricados ou comercializados.
1.1 Pequi (Caryocar brasiliense Cambess)
Estima-se que dois terços da diversidade biológica mundial estejam nas zonas tropicais, distribuídas principalmente nos países em desenvolvimento. Cerca de 40% dessa diversidade encontra-se na América tropical, que contém cerca de 90 mil espécies de fanerógamas, representadas no Brasil por aproximadamente 60 mil espécies. O bioma cerrado possui uma flora estimada em sete mil espécies, sendo o segundo bioma brasileiro de maior diversidade vegetal com árvores frutíferas (24, 25).
Caryocar brasiliense Cambess é uma frutífera nativa do cerrado brasileiro (26, 27). É popularmente conhecida como “ouro do cerrado”, devido ao interesse econômico,
principalmente pelo uso de seus frutos na culinária, como fonte de vitaminas e na extração de óleos para a fabricação de cosméticos (28). Etimologicamente, a palavra pequi ou piqui, vem do tupi-guarani e significa “fruto de pele espinhenta”, fazendo, dessa forma, uma alusão aos vários espinhos formadores de uma pele protetora sobre a semente (29).
Taxonomicamente, o Caryocar brasiliense pertence à classe Dicotiledonae, ordem Parietales e família Caryocaraceae, cuja distribuição cobre a América Central e a América do Sul, estendendo-se desde a Costa Rica até o Paraguai. Das 26 espécies da família, dezesseis pertencem ao gênero Caryocar L. e as restantes, ao Anthodiscus G.F.W. Meyer (30). No Brasil, podem ser encontradas as espécies C. nuciferum (Amazonas e Goiás),
C. Glabrum (Amazonas e Pará), C. edule (Estados do Norte até Rio de Janeiro), C. brasiliense Cambess (Goiás, Mato Grosso, Minas Gerais, São Paulo, Rio de Janeiro,
38
Maranhão, Piauí e Ceará), C. crenatum (Piauí e Ceará) e C. coriaceum Wittm (Nordeste) (31).
É uma planta semidecídua, heliófita e seletiva xerófita, de formações primárias e secundárias. A árvore de Caryocar brasiliense (Figura 1A) mede de 12 a 15 metros de altura, possui tronco com até 2 metros de circunferência, casca escura e gretada, galhos grossos, compridos e inclinados, copa longa e aprazível. Tem folhas (Figura 1B) opostas, ovais, verde-luzentes de aspecto coreáceo, flores branco-amareladas (Figura 1C) e estames vermelhos e grandes (32).
As folhas do pequizeiro são pilosas e opostas, formadas por três folíolos com as bordas recortadas. As flores são grandes e amarelas, com múltiplos estames e quatro estiletes (33).
Figura 1. Pequizeiro: A) Árvore34 B) Folhas35 C) Flores36 D) Fruto37.
A
B
39
O fruto (Figura 1D) é do tipo drupa, globoso, com casca verde-amarelada e mesocarpo oleaginoso e brancacento, contendo de uma a quatro sementes volumosas, protegidas por endocarpo lenhoso, acompanhado de espinhos delgados e agudos, sob a qual está a amêndoa grande, carnosa e também oleaginosa (32). Contêm vitamina A, B1, B2, C, E, fósforo, cobre e ferro (38), apresenta também proteínas, carboidratos, sais minerais e um gama de metabólitos secundários (39).
A principal exploração do pequi é o uso de seus frutos na culinária e na indústria agrícola para extração de óleos e produção de licores. Entretanto, são inúmeras as aplicações do fruto, da casca, do óleo, do caule, da flor e das folhas desta planta na medicina popular, na indústria cosmética e na alimentação (31, 38).
Popularmente, o óleo de pequi é utilizado no tratamento da rouquidão, dor de garganta, bronquite, tosse, fortificante, uso tópico para curativos de ferimentos, dores musculares e reumáticas e contusões (32); infecções pulmonares e uso veterinário (40); problemas respiratórios e cicatrização (41); atividade antiinflamatória (42); problemas respiratórios, afrodisíaco e estimulante da produção de sais biliares (38).
A análise da composição química de C. brasiliense revelou que a polpa apresenta alto teor de umidade (41,50%), além de lipídios (33,4%), carboidratos (11,45%), fibras (10,0%) e proteínas (3,0%). A amêndoa, por sua vez, é rica em lipídios (51,51%), apresentando em sua composição proteínas (25,27%), carboidratos (8,33%), fibra alimentar (2,2%), baixo teor de umidade (8,68%) e elevado teor de minerais, representado pelas cinzas (4,0%) (43). A polpa e a semente do pequi representam apenas 25% do fruto. Embora o epicarpo (casca) represente a maior parte do pequi (75%), há poucos estudos sobre esta parte do fruto, provavelmente por ser um resíduo rejeitado pela população (44).
40
Na composição do óleo de pequi verifica-se a presença da vitamina A e de diversos ácidos graxos como o palmítico, oléico, mirístico, palmitoléico, esteárico, linoléico e linolênico (45). A presença destes ácidos graxos na pele é fundamental para manutenção da hidratação cutânea, da barreira cutânea e do manto hidrolipídico (46). Também foram identificados carotenóides no pequi (47). Estes metabólitos conferem proteção à pele impedindo a lipoperoxidação, evitando desta maneira a formação de radicais livres e, consequentemente, retardando envelhecimento cutâneo.
C. brasiliense possui alto conteúdo de fenóis totais (209 g equivalentes de ácido
gálico/Kg) e atividade de varredura contra o radical estável DPPH (2,2-difenil-1-picril hidrazil) com IC50 de 9,44 µg/mL e 17,98 µg/mL para o extrato aquoso e etanólico da casca do fruto, respectivamente, demonstrando, assim, excelente atividade antioxidante. A caracterização dos componentes bioativos responsáveis por essa atividade revelou a presença de potentes antioxidantes, tais como ácido gálico, ácido quínico, quercetina e quercetina-3-O-arabinose (48).
O óleo do pequi possui, em sua composição, o ácido graxo de cadeia média, linoléico, sendo o mesmo aplicado no tratamento e/ou prevenção de feridas cutâneas abertas. É relatada ação bactericida, aumento da permeabilidade da membrana celular, facilitação da entrada de fatores de crescimento, promoção de mitose e proliferação celular, estimulação da neoangiogênese e facilitação da quimiotaxia leucocitária (49).
O óleo de pequi apresenta atividade inseticida em milhos mantidos em condições de armazenamento (50). Alguns resultados têm demonstrado a atividade antimicrobiana de C. brasiliense. Os óleos fixos da semente e da amêndoa dessa planta mostraram bioatividade elevada em testes de susceptibilidade in vitro sobre isolados de
41
inibir 24% das cepas de C. neoformans (CIM ≤ 250 µg/mL), apresentou atividade inibitória contra cepas patogênicas de Paracoccidioides brasiliense (CIM = 500 µg/mL) (51). Ensaios
in vitro com extrato hidroetanólico das folhas de C. brasiliense demonstraram atividade
antibacteriana contra Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli e
Enterococcus faecalis. Além disso, nos estudos de Paula-Junior et al.(52), foram demonstradas as atividades leishmanicida e antimicrobiana do extrato das folhas de pequi. O extrato apresentou efeito leishmanicida, inibindo a proliferação de formas promastigotas de Leishmania amazonensis e, ainda, potencial efeito antioxidante, com atividades similares à atividade da vitamina C e da rutina.
O extrato etanólico obtido das folhas e da casca do caule de C. brasiliense mostrou atividades moluscicida contra Biomphalaria glabrata, hospedeiro intermediário esquissostomose (53) e tripanocida in vivo, reduzindo a parasitemia do Trypanosoma cruzi em camundongos infectados por via intraperitoneal (54). Estudos demonstraram ainda que o extrato etanólico das folhas apresenta atividade contra o sarcoma 180, um tipo de câncer de pele. Por meio de análise cromatográfica, identificaram-se no extrato etanólico as seguintes substâncias: friedelina, friedelanol, ácido oleanóico, β-sitosterol, estigmasterol, β-amirilina e ácido elágico (55).
De acordo com Passos et al.(51) em seus estudos sobre a atividade antifúngica do pequi, todas as partes do fruto possuem atividade antifúngica sobre Cryptococus
neoformans, sendo que a cera retirada da folha possui atividade mais elevada, inibindo o
crescimento de 91,3% dos isolados desse microrganismo.
O efeito tóxico de Caryocar brasiliense sobre Botrytis cineria, Colletotrichum
truncatum e Fusarium oxysporum, fungos parasitas de plantas, foi investigado usando-se
42
das folhas, dos botões florais, dos mesocarpos externo e interno. Entretanto, nenhum deles apresentou efeito tóxico sobre os fungos testados. Pelo contrário, observou-se estimulação de seu crescimento (31).
O extrato aquoso, por sua vez, apresentou efeito protetor sobre a clastogenicidade induzida por ciclofosfamida, provavelmente, devido às propriedades antioxidantes dessa planta (56).
Os estudos de Magalhães e colaboradores (57) sobre a atividade hemolítica contra o vírus da estomatite vesicular, poliovírus tipo 1 selvagem e o vírus da encefalomielite eqüina do leste, de extratos de folhas jovens e adultas de C. brasiliense demonstraram pequena ação hemolítica frente aos vírus testados.
A capacidade terapêutica do pequi e seus derivados, é bastante difundida no conhecimento popular e tem ganhado a atenção de pesquisadores, entretanto, existem poucos estudos demonstrando cientificamente a atividade biológica que elucide suas atividades terapêuticas, antibacteriana, antifúngica, parasiticida e antioxidante, assim como uma possível toxicidade que seus componentes possam apresentar (58).
A escassez de dados na literatura, demonstrando cientificamente a atividade biológica das diversas partes do pequi e potencial toxicidade, reforça a necessidade de estudos dessa natureza que trarão grande contribuição para utilização segura do pequi (58).
A insatisfação com a medicina convencional, o uso abusivo ou incorreto de drogas sintéticas, a crescente resistência microbiana a medicamentos, os efeitos tóxicos, o custo-benefício e a dificuldade de acesso da grande maioria da população a esse tipo de tratamento, são fatores que reforçam a necessidade de pesquisas científicas que esclareçam as potenciais atividades biológicas do pequi, e também de outras plantas, a fim de encontrar resultados satisfatórios.
43
Diante dos registros sobre as diversas atividades dos extratos, ou mesmo de compostos isolados de C. brasiliense, reconhecemos a importância do estudo sobre sua utilização; objetivando especificamente neste trabalho, a aplicabilidade antisséptica e antioxidante em produtos cosméticos, baseando-se no fato de que muitos dos compostos com reconhecida atividade antimicrobiana e antioxidante estão presentes nesta planta e que, até o presente momento, poucos estudos com esta abordagem foram encontrados e nenhum estudo envolvendo extratos obtidos por extração supercrítica foi reportado.
Este estudo buscou ainda sinalizar o aproveitamento de recursos naturais da biodiversidade brasileira, envolvendo o desenvolvimento social, econômico e ambiental sustentável por meio da valorização de plantas nativas. Isso implicará em uma maior competitividade para os produtos naturais de plantas nativas, e consequente expansão comercial.
1.2 Extração por dióxido de carbono supercrítico
Desde os primórdios históricos praticou-se a extração de substâncias a partir de vegetais, com fins alimentícios, aromáticos e terapêuticos, buscando-se sempre obter um produto mais específico, mais puro e mais eficaz (59).
As técnicas para a extração de ativos vegetais evoluíram e hoje é possível obter compostos sólidos não voláteis pela utilização de solventes adequados e o emprego de processos físicos, além da obtenção de substâncias líquidas voláteis por destilação ou sublimação (60).
Em ambos os casos, as extrações apresentam inconvenientes: a utilização de solventes, ou a presença de impurezas, pode provocar alterações químicas nas substâncias
44
obtidas; a necessidade eventual de elevação da temperatura pode prejudicar substâncias termolábeis; a eliminação do solvente pode trazer instabilidade físico-química e outras reações secundárias; a hidrodestilação, além do aquecimento, mantém o insumo em contato com água quente (59).
Na determinação do método mais adequado a ser empregado, deve-se levar em conta os fatores mais relevantes como a economia e a qualidade do produto final do processo selecionado. Dessa maneira, variáveis como custo, produtividade e rendimento aliados às restrições ambientais e de saúde pública, em relação a resíduos de solventes orgânicos, e às exigências dos consumidores por alimentos naturais, tem estimulado o desenvolvimento de tecnologias limpas, evidenciando a importância da otimização do processo de extração de produtos naturais (61, 62).
A extração por dióxido de carbono supercrítico tem sido proposta como um método não contaminante de extração de produtos de origem vegetal, em substituição aos métodos de extração com solventes orgânicos pelos quais obtém-se compostos vegetais de baixa qualidade e que requerem inúmeros processos de refinamento e de purificação até chegar ao produto final, completamente isento de contaminantes químicos e efetivamente purificados com signicativos teores de ativos (63).
O processo de extração com fluido supercrítico é uma operação unitária por contato que se fundamenta no equilíbrio e nas propriedades físico-químicas dos fluidos supercríticos: alto poder de solvatação, alto coeficiente de difusão, baixa tensão superficial e baixa viscosidade (64).
Um fluido supercrítico é definido como qualquer substância que se encontra acima de sua temperatura e de sua pressão críticas. A temperatura crítica é a temperatura máxima na qual um vapor pode ser convertido em um líquido por aumento da pressão. A
45
pressão crítica é a pressão na qual um líquido pode ser convertido em vapor por um aumento de temperatura (Figura 2).
Figura 2. Diagrama pressão x temperatura para um componente puro (65).
Estes valores de temperatura e de pressão definem um ponto crítico que é único para cada substância. Quando a temperatura e a pressão de uma substância são elevadas acima dos valores do ponto crítico, ela passa para uma condição chamada de “Estado Fluido Supercrítico” (66).
Os fluidos na proximidade de seus pontos críticos apresentam densidades próximas aos líquidos e compressibilidades comparáveis aos gases. As propriedades deste método extrativo são particularmente sensíveis à temperatura e à pressão, sendo, desta forma, altamente flexível na modificação da solubilização dos compostos através de pequenas variações nas condições termodinâmicas de processo (67).
46
A extração supercrítica utilizando o dióxido de carbono como solvente é uma técnica de alta eficiência na extração de óleo devido a sua natureza apolar, tendo como produto final, compostos bioativos apolares, misturas complexas de óleo essencial, ésteres, terpenos, ácidos graxos, ceras, resinas e pigmentos (59).
O dióxido de carbono (CO2) supercrítico possui baixa temperatura crítica
(31,04ºC), permitindo que as extrações sejam realizadas a uma temperatura que não prejudica as propriedades organolépticas dos extratos, e uma pressão crítica (73,8 bar) de fácil obtenção em processos de produção em escala industrial (68).
O CO2 é inerte e não oferece risco de reações secundárias, como oxidações,
reduções, hidrólises e degradações químicas, não é inflamável e é de fácil remoção do soluto, pois é removido pela simples expansão à pressão ambiente. Estas características o tornam favorável como solvente de extração de compostos termosensíveis como, por exemplo, os carotenóides, uma vez que não são necessariamente expostos a altas temperaturas, que podem induzir alterações em sua composição, e nem às altas pressões de operação, reduzindo o investimento, e consequentemente os custos de manufatura (69, 70).
A extração é facilitada devido às propriedades dos fluidos no estado supercrítico, tais como: compressibilidade semelhante a um gás, densidade semelhante a um líquido, capacidade de dissolução como um líquido, viscosidade semelhante à dos gases e difusividade intermediária entre gás e liquido, variando de acordo com a viscosidade (71).
Segundo King (66), um método ideal de extração deve ser rápido, simples, barato, de boa eficiência para quantificação, sem perdas ou degradação das substâncias; deve produzir uma amostra pronta para análise sem a necessidade de adição de solventes ou de uma etapa de fracionamento e não deve acarretar resíduos de produtos químicos no laboratório.
47
Os solventes líquidos, frequentemente, apresentam falhas em alguns destes aspectos. Tais solventes, muitas vezes, requerem várias horas ou alguns dias para fornecer resultados satisfatórios e resultam em extratos diluídos, que devem ser concentrados por evaporação do solvente, quando as substâncias a serem analisadas estão presentes em pequenas quantidades. Sob o ponto de vista ecológico e de segurança, geram acúmulos de substâncias tóxicas ou emissão destas para a atmosfera durante a etapa de concentração (72).
Figura 3. Extrator CO2 supercrítico (Foto da autora).
Em um processo típico de extração supercrítica, o material contendo o extrato bruto é inserido no extrator (Figura 3), onde a corrente de solvente supercrítico flui a uma dada pressão, temperatura e vazão, extraindo, assim, alguns componentes, dependendo diretamente da sua da solubilidade (73).
48
Este processo consiste das etapas de extração e separação do extrato do solvente: a etapa de extração inicia quando o solvente no estado supercrítico (fluido) é bombeado através do extrator, fluindo continuamente através da matéria-prima sólida, a qual absorve o fluido dilatando sua estrutura celular e diminuindo a resistência ao transporte de massa, facilitando assim a solubilização dos compostos que são transportados para a superfície do sólido, escoando para a saída do extrator (64, 74).
A extração e o fracionamento de produtos com fluidos supercríticos podem ser realizados em dois modos de operação: extração seletiva e/ou separação seletiva. A primeira envolve a sintonia da capacidade de solvatação do fluido, utilizado na extração, por meio da manipulação das condições termodinâmicas de temperatura e de pressão e/ou da modificação da natureza química do solvente utilizado com a adição de um co-solvente (59).
No segundo modo de operação, a separação seletiva é obtida por meio da despressurização ou do aquecimento ou resfriamento graduais do extrato, permitindo com isso um fracionamento controlado dos produtos a serem extraídos. A separação seletiva pode ser obtida também pelo acoplamento do processo de extração a outro processo de separação como, por exemplo, adsorção (73).
Após a extração, um ou mais componentes dissolvidos precipitam no vaso separador com a descompressão do sistema. A manipulação das condições operacionais pode tomar o solvente mais seletivo para componentes específicos. O poder de solubilização de um solvente apoIar como o CO2, que é o solvente mais comumente
utilizado neste processo, pode ser modificado através da adição de pequenas quantidades de substâncias polares chamadas modificadores ou co-solventes (67).
49
O método de extração utilizando fluidos supercríticos apresenta vantagens diante dos processos convencionais para a obtenção de princípios ativos a partir da matriz vegetal, uma vez que estes processos, na sua grande maioria, são baseados na extração com solventes químicos, e apresentam inconvenientes como altas temperaturas de operação, possibilitando a degradação térmica dos ativos, a presença de resíduos tóxicos no produto final e a contaminação ocupacional e ambiental, devido à utilização de solventes orgânicos de manipulação perigosa (73).
Diante destas vantagens, as indústrias químicas, de alimentos, farmacêuticas e de cosméticos vêm demonstrando interesse na utilização desta nova tecnologia em processos que priorizam a qualidade máxima dos produtos obtidos. A extração supercrítica de produtos naturais já ocorre industrialmente em todo o mundo, particularmente no que diz respeito à extração de cafeína de grãos de café (75). A técnica também é utilizada na descafeinização de chá; extração, fracionamento e refinamento de gorduras e de óleos; dealcoolização de bebidas; extração de óleos essenciais; entre outros (67, 73).
Muitos estudos demonstram a importância desta metodologia na extração de constituintes químicos vegetais, sendo comum e inquestionável a referência da qualidade deste método de extração quando comparadas às metodologias de extração com solventes orgânicos. Um recente estudo realizado por Stashenko et al. (76), compara o isolamento de dezenas de constituintes químicos vegetais utilizando quatro diferentes técnicas de extração, inclusive a extração por CO2 supercrítico.
Como resultado, demonstraram que para alguns compostos, a utilização deste método é mais rentável e eficaz. Corroborando com estes achados, Del Valle et al. (63), demonstraram que a extração com CO2 supercrítico comparada à extração com solventes
50
antioxidante. Resultados similares foram obtidos na extração de piretrinas de flores, demonstrando mais uma vez a eficiência desta metodologia na extração de produtos em maiores concentrações e com melhor qualidade final (77).
Hawthorne et al. (72) em um estudo comparativo de várias técnicas de isolamento a partir de sólidos ambientais, apresentam conclusões similares e mostram claramente que a qualidade difere de acordo com a metodologia empregada, indicando que a extração por CO2 supercrítico apresenta os melhores índices de qualidade, menor
quantidade de artefatos e maior seletividade para a separação de algumas classes de compostos. Além dos dados já discutidos, é importante referir o estudo comparativo realizado por Bravi et al. (78), o qual reporta que esta metodologia é viável para a obtenção de constituintes químicos vegetais de alta performance.
Estudos realizados, utilizando esta metodologia na extração de constituintes oriundos de espécies vegetais de grande valor econômico para a indústria de cosméticos, demonstram a adequação desta metodologia na obtenção de compostos de interesse com as características desejadas na elaboração de produtos na área cosmética e farmacêutica (79). Com esta finalidade, a adequação desta metodologia para a extração em escala industrial também têm sido alvo de pesquisas. Outros estudos demonstraram que esta técnica é excelente para a obtenção de frações enriquecidas com constituintes químicos vegetais, e que a mesma pode ser facilmente adaptada da escala laboratorial para uma planta piloto (80).
1.3 Produtos naturais e atividade antimicrobiana
As propriedades antimicrobianas de substâncias e óleos essenciais que as plantas contêm como produtos de seu metabolismo secundário têm sido reconhecidas
51
empiricamente durante séculos, mas foram confirmadas cientificamente apenas recentemente. Inúmeras pesquisas vêm sendo desenvolvidas e direcionadas no descobrimento de novos agentes antimicrobianos provenientes de produtos naturais aplicados em produtos farmacêuticos e cosméticos (81).
A história do desenvolvimento e uso de substâncias antimicrobianas com fins medicinais antecedeu a descoberta de espécies microbianas. Em anos remotos, Hipócrates (460–337 a.C.) recomendava a lavagem de ferimentos com vinho para impedir a proliferação de microrganismos e o processo infeccioso. Documentos datados de 2500 a 3000 anos atrás, mostram que alguns povos como chineses e indianos, ainda primitivos, utilizavam mofo, infusões diversas e outros produtos correlatos para o tratamento de lesões infectadas e processos inflamatórios (82).
A eficácia de antimicrobianos foi muito promissora logo após a sua introdução. No entanto, em seu discurso de 1945 quando recebeu o Prêmio Nobel, Fleming advertiu que o uso indevido de antibióticos resultaria em resistência (83). Algumas décadas após esse discurso, o problema da resistência antimicrobiana tornou-se generalizado e uma questão relevante na medicina.
Nas últimas décadas, foram intensificadas as investigações sobre fitoterápicos que possam oferecer tratamento alternativo de controle bacteriano (84). O estudo desses agentes é importante no campo da saúde visto que se buscam, mundialmente, substâncias menos tóxicas e mais eficazes contra a resistência bacteriana, capazes de combater novos patógenos (85, 86).
Estudos sobre as atividades antimicrobianas de extratos e óleos essenciais de plantas nativas têm sido relatados em muitos países, como por exemplo, no Brasil, em Cuba, na Índia, no México e na Jordânia, que possuem uma flora diversificada e uma rica
52
tradição na utilização de plantas medicinais para uso como antibacteriano ou antifúngico (87,
88, 89).
Há muitas vantagens no uso de compostos antimicrobianos de plantas medicinais, como por exemplo, indução de menos efeitos colaterais, melhor tolerância do paciente, valor mais econômico, melhor aceitação devido à longa história de uso e ser renovável por estar disponível na natureza (90, 91).
Com uma estrutura química que difere daquela dos antimicrobianos derivados de microrganismos, os antimicrobianos vegetais atuam regulando o metabolismo intermediário de patógenos, ativando ou bloqueando reações e síntese enzimática ou ainda, alterando a estrutura de membranas (92). Além disso, os fitoterápicos têm baixo custo e podem ser usados conjuntamente à medicina alopática (93).
Segundo Sanches (94), os agentes antimicrobianos agem sobre microrganismos patogênicos e oportunistas que podem conduzir ao óbito. Eles possuem vários mecanismos de ação, destacando-se aqueles que atuam lesando ou alterando a permeabilidade da parede celular, promovendo modificações estruturais em suas proteínas e ácidos nucléicos ou mesmo inibindo sua síntese. Diferentemente do que ocorre com os agentes antibióticos e quimioterápicos, há poucos registros na literatura quanto ao possível mecanismo de ação de produtos oriundos de plantas.
Os compostos isolados de plantas são substâncias com estruturas químicas bem diferenciadas dos antimicrobianos obtidos a partir de bactérias, de leveduras e de fungos. Tais produtos podem atuar no metabolismo intermediário ativando enzimas, alterando a ação de inibidores que influenciam os nutrientes do meio, inferindo nos processos enzimáticos em nível nuclear ou ribossomal, provocando alterações nas membranas ou ainda interferindo no metabolismo secundário (16).
53
Inúmeras pesquisas vêm sendo desenvolvidas e direcionadas no descobrimento de novos agentes antimicrobianos provenientes de produtos naturais aplicados em produtos farmacêuticos e cosméticos. Nestes casos, o principal objetivo é avaliar as concentrações em que determinada substância apresenta ação sobre fungos e bactérias. Atualmente existem vários métodos para avaliar a atividade antibacteriana a e antifúngica destes agentes. Os mais conhecidos incluem método de difusão em ágar, método de macrodiluição e método de microdiluição (95).
A antissepsia é um processo de redução da carga microbiana, com o uso de substâncias químicas, chamadas de antissépticos, usadas como bactericidas ou bacteriostáticos, de forma que a área tratada deixa de representar um risco de disseminação de microrganismos em tecidos vivos. Por esta razão, devem ser substâncias de baixa toxicidade (96).
A primeira referência do uso de desinfetantes está relacionada ao uso do enxofre, na forma de dióxido de enxofre (aproximadamente 800 a.C.), substância ainda hoje empregada na preservação de frutas secas, sucos de frutas e vinho (97).
Louis Pasteur (1822-1895) demonstrou que os microrganismos são responsáveis por doenças infecciosas e desenvolveu posteriormente, o método físico denominado pasteurização, ainda hoje utilizado na higienização de produtos alimentícios, médicos e odontológicos (98).
Relatos históricos indicam que os desinfetantes e antissépticos foram utilizados durante o início do século XIX, quando em 1846, Ignaz Semmelweis utilizou compostos clorados na enfermaria de um hospital obstétrico para reduzir a incidência da febre puerperal, orientando os estudantes de medicina do hospital a lavar as mãos com água e
54
sabão e em seguida, imergí-las em uma solução de hipoclorito de sódio antes de examinar as pacientes (97).
Os desinfetantes e antissépticos, entre outras características, devem possuir alta eficácia germicida, o que inclui ação rápida e prolongada, amplo espectro antimicrobiano, estabilidade química e ser inodoro ou ter odor agradável (96).
A antissepsia regular e adequada é de grande importância no controle de infecções, embora ainda apresente alguns desafios, como a eficácia do produto e a incorporação do ato na rotina das pessoas. Embora muitas instituições regulamentem procedimentos de antissepsia, poucas são as regulamentações baseadas em pesquisas científicas e, muitas vezes, esses procedimentos apresentam lacunas de quando e como a mesma deve ser feita (99).
Os antimicrobianos são classificados por diferentes autores levando-se em consideração critérios distintos. De acordo com Bresolin e Cechinel-Filho (100), os antimicrobianos podem ser divididos em específicos e inespecíficos. Os específicos são aqueles que agem sobre o organismo invasor, sem afetar o hospedeiro e os inespecíficos são aqueles capazes de matar ou inibir o crescimento microbiano in vitro. Fazem parte deste grupo os antissépticos, germicidas e biocidas, que são de uso exclusivamente tópico.
Outra classificação adotada separa antimicrobianos em bactericidas ou fungicidas, quando matam os microrganismos e bacteriostáticos e fungistáticos, quando atuam apenas impedindo seu crescimento (100).
Os principais mecanismos de ação dos antimicrobianos incluem a inibição da síntese do peptideoglicano da parede celular bacteriana (Figura 4) ou do β-1,3-glicano/quitina da parede celular do fungo; lesão da membrana citoplasmática e interrupção do fluxo de elétrons, do transporte ativo e da coagulação do conteúdo celular; interferência
55
na síntese e replicação do DNA; inibição da RNA-polimerase dependente de RNA e, consequentemente, da transcrição do ácido nucléico e síntese proteica; inibição competitiva da síntese de metabólitos essenciais (101).
Figura 4. Parede celular bacteriana (102).
A atividade dos produtos antissépticos contra bactérias, nem sempre é a mesma contra fungos, protozoários ou vírus, uma vez que estas células são maiores ou mais complexas (103).
Existem várias substâncias químicas utilizadas para desinfecção ou antissepsia atualmente disponíveis, divididas em grupos principais: fenol e compostos fenólicos, alcoóis, halogênios (iodo e cloro), metais pesados e seus compostos e detergentes (97).
Parede
Parede
56
Os agentes antibacterianos são incluídos também em formulações de higiene e limpeza principalmente para aliviar condições de halitose, odor corporal e infecções de pele mais simples, incluindo infecções secundárias associadas à acne. Estas formulações não devem ser confundidas com produtos farmacêuticos, que são utilizados para o tratamento de condições patológicas, os quais podem conter antibióticos e outros agentes não comumente considerados susceptíveis para os objetivos mais gerais de higiene (98).
A microbiota normal da pele compreende dois grupos distintos de microrganismos, a microbiota residente e a transitória. A microbiota normal, de baixa patogenicidade, é composta por microrganismos Gram positivos, e, em menor proporção, Gram negativos que colonizam as camadas mais profundas da epiderme e são mais resistentes à remoção pelas técnicas de higienização (104).
A microbiota transitória ou contaminante é composta por bactérias Gram-negativas, Gram-positivas, fungos e vírus, que colonizam camadas mais superficiais e são, geralmente, removíveis pela higiene com água e sabão ou destruídos/inativados pelo uso de antissépticos (104).
A população de bactérias varia consideravelmente nas diferentes partes do corpo, sendo encontrada em maiores proporções na face, cabelos e axilas, particularmente nos folículos pilosos e glândulas sebáceas (105).
Os antissépticos removem, destroem ou impedem o crescimento de microrganismos da microbiota transitória e alguns residentes da pele e mucosas (106).
A utilização de sabão com antimicrobianos para lavagem rotineira das mãos reduz transitoriamente a microbiota da pele e é recomendada em procedimentos hospitalares diversos, laboratoriais e odontológicos. O sabão destinado à antissepsia da pele pode conter diferentes famílias de compostos. Dentre eles, os alcoóis, tendo como principal
57
referência o etanol 70%; aldeídos, como o glutaraldeído; agentes catiônicos, como a clorexidina; o iodo e os fenóis. Considerando, porém, o emprego de sabonetes contendo tais antissépticos, a grande maioria destes agentes apresenta comprometida aplicação (107).
São inúmeras as formas farmacêuticas e fitoterápicas desenvolvidas utilizando-se matérias-primas vegetais, muitas delas empregadas no deutilizando-senvolvimento de preparações para higiene. A utilização de agentes antissépticos em formulações difere do uso de agentes conservantes (108).
Os antissépticos são ativos contra microrganismos presentes na pele, couro cabeludo ou boca, enquanto os conservantes têm por principal função a manutenção do produto em condições microbiológicas satisfatórias durante seu prazo de validade (108).
As substâncias antibióticas ou antimicrobianas representam um imenso avanço da farmacoterapia nas últimas cinco décadas. Os antimicrobianos atuam sobre microrganismos patogênicos e oportunistas que podem conduzir a uma incapacitação prolongada ou ao óbito (94).
Considerando que a atividade antimicrobiana de determinada substância deve-se à sua capacidade de impedir o crescimento ou mesmo, destruir os microrganismos-teste, a avaliação da atividade antimicrobiana torna-se possível. Nestes casos, o principal objetivo é avaliar as concentrações em que determinada substância apresenta ação sobre fungos e bactérias (109). Atualmente existem vários métodos para avaliar a atividade antibacteriana e
antifúngica destes agentes. Os mais conhecidos incluem método de difusão em ágar, método de macrodiluição e microdiluição (110).
As variações referentes à determinação da concentração inibitória mínima de produtos naturais ou semi-sintéticos podem ser atribuídas a vários fatores. Dentre eles podemos citar a técnica aplicada, o microrganismo e a cepa utilizada no teste, solubilidade
58
e outras propriedades físico-químicas. Assim, não existe método padronizado para expressar os resultados de testes para avaliação da atividade antimicrobiana de produtos naturais ou semi-sintéticos (111).
O teste de difusão em ágar, também chamado de difusão em placas, é um método físico, no qual um microrganismo é desafiado contra uma substância biologicamente ativa em meio de cultura sólido e relaciona o tamanho da zona de inibição de crescimento do microrganismo desafiado com a concentração da substância ensaiada (112).
A aplicação do método de difusão se limita a microrganismos de crescimento rápido, sendo eles aeróbios ou aeróbios facultativos. A avaliação é comparativa frente a um padrão biológico de referência e a zona ou o halo de inibição de crescimento é medida partindo-se da circunferência do disco ou poço, até a margem onde há crescimento de microrganismos (111).
O método de diluição em caldo considera a relação entre a proporção de crescimento do microrganismo desafiado no meio líquido e a concentração da substância ensaiada. A avaliação é comparada frente a um padrão biológico de referência. Entende-se por proporção a densidade da turbidez provocada pelo crescimento microbiano (112, 113).
O método fornece resultados quantitativos e não é influenciado pela velocidade de crescimento dos microrganismos (111). Duas metodologias podem ser empregadas: macro
e microdiluição. A macrodiluição envolve testes em tubos de ensaio, e a microdiluição utiliza microplacas com 96 poços (112).
59
1.4 Antioxidantes
O processo respiratório e diversas reações oxidativas, que ocorrem nas células aeróbicas, levam à formação de radicais livres, que causam danos ao organismo e contribuem para o aparecimento de muitas doenças, tais como: inflamações, tumores malignos, mal de Alzheimer e doenças cardiovasculares, bem como aceleram o processo de envelhecimento (114).
O envelhecimento cutâneo é provocado principalmente pela desorganização do mecanismo de defesa antioxidante. Como resultado desse desequilíbrio, acontece o aparecimento de doenças na pele, que podem ser consideradas consequências dos danos às estruturas nela presentes, como lipídios, proteínas e DNA. Estima-se que cerca de 80% dos sinais visíveis do envelhecimento são provocados pelos raios ultravioletas e pelos radicais livres, formados devido à exposição aos raios (115).
As Figuras 5 e 6 representam as alterações macroscópicas que evidenciam as diferenças entre uma área fotoexposta e uma área protegida da pele de uma mesma pessoa.
Figura 5. Área foto-exposta* Figura 6. Área não foto-exposta* *Mulher caucasiana de 85 anos, fototipo de pele III (Fitzpatrick) (116).
60
Comparações clínicas visuais entre áreas da pele expostas à radiação ultravioleta mediante fotoproteção e não-fotoprotegida, revelam que as principais alterações na aparência da pele relacionadas ao envelhecimento cutâneo decorrem primariamente da exposição solar (116).
Os radicais livres cujo elétron encontra-se centrado nos átomos de oxigênio e nitrogênio são denominados, respectivamente, de espécies reativas de oxigênio (ERO) e espécies reativas de nitrogênio (ERN). No organismo encontram-se envolvidos com a produção de ATP, fagocitose, regulação do crescimento celular, entre outros. Sua produção ocorre naturalmente como um processo fisiológico (117).
Os antioxidantes constituem um conjunto heterogêneo de substâncias formado por vitaminas, minerais, pigmentos naturais e outros compostos vegetais e, ainda, enzimas, que bloqueiam o efeito danoso dos radicais livres, formados nas reações metabólicas ou por fatores exógenos, ao organismo. A geração de radicais livres, fisiológica ou não, é normalmente equilibrada pela ação dos antioxidantes endógenos e exógenos (118).
Estas substâncias, mesmo em baixas concentrações, retardam ou previnem a oxidação do substrato, isto é, têm ação direta ou indireta sobre espécies oxidativas, neutralizando a sua ação (119, 120). Quando a ação do antioxidante acontece através de sua reação com o radical livre, o novo radical formado deve ser estável e incapaz de propagar a reação (121).
Entre as principais características de um bom antioxidante estão: presença de substituintes doadores de elétrons ou de hidrogênio ao radical, em função de seu potencial de redução; capacidade de deslocamento do radical formado em sua estrutura; capacidade
61
de quelar metais de transição implicados no processo oxidativo; e acesso ao local de ação, dependendo de sua hidrofilia ou lipofilia e de seu coeficiente de partição (122).
Os antioxidantes podem ser classificados em sintéticos ou naturais, sendo que os sintéticos são comumente usados na indústria alimentícia, para aumentar a vida de prateleira de alimentos lipídicos ou que contenham lipídeos em sua composição. Dentre os sintéticos, os mais conhecidos são o butilhidroxitolueno (BHT), o butilhidroxianisol (BHA), o propilgalato (PG) e o terciobutilhidroquinona (TBHQ) (123), cujas estruturas químicas estão demonstradas na Figura 7.
Figura 7. Estrutura química dos principais antioxidantes sintéticos (124).
Dentre os antioxidantes naturais pode-se destacar os compostos enzimáticos como Glutation-Peroxidase, Catalase, Metionina-Redutase e Superóxido-Dismutase (125) e os não enzimáticos, como por exemplo, as substâncias da classe de fenóis, terpenos, ácidos
