1X QIAGEN Multiplex PCR Kit, Master Mix 2x 5 µl

10x Primer Mix 1 µl

Reforço (1µM) * 0 – 1 µl

Água 2 – 3 µl

Total 9 µl mix +

1 µl DNA (±05-5 ng/μl)

*Volumes variáveis de acordo com os resultados e tempo de uso após o preparo do mix de primers

Amplificação dos fragmentos por PCR convencional: A amplificação dos fragmentos de interesse por PCR convencional ocorreu nos termocicladores GeneAmp® PCR System 9700 Thermal Cycler (Applied Biosystems) e Veriti 96 Well Thermal Cycler (Applied Biosystems) e seguiu os seguintes ciclos:

Desnaturação inicial: 95ºC, 15min

30 ciclos:

94ºC, 30seg 60ºC, 90seg 72ºC, 45seg

Extensão final: 72ºC, 60min

4°C, 10min

5.8.2.2 Genotipagem em Sequenciador Automático

A genotipagem dos fragmentos foi realizada nos sequenciadores de DNA por eletroforese capilar ABI PRISM® 3500 Genetic Analyser e ABI PRISM® 3130 Genetic Analyser (Applied Biosystems), os quais efetuam a eletroforese simultânea em 8 e 4 capilares, respectivamente. A detecção dos fragmentos de DNA é feita através de uma câmara laser que reconhece os sinais fluorescentes emitidos quando da sua passagem.

Preparo das amostras para eletroforese capilar: Previamente foi preparado um mix contendo formamida (Hi-Di Formamide, Applied Biosystems) e um padrão interno de tamanho de fragmentos de DNA conhecido, LIZ500® (Applied Biosystems), na proporção de 880 µl para 20 µl, respectivamente. Essa mistura foi colocada diretamente em placa de 96 poços e em seguida as amostras foram aplicadas pela ordem determinada no protocolo, obedecendo a seguinte proporção: 9 µl do mix (Formamida Hi-Di + LIZ500) para 1 µl de cada amostra.

Como se tratava de um aparelho com 8 capilares, assegurou-se que os 8 poços na placa, determinados para serem injetados pelos 8 capilares do aparelho (uma corrida), ficassem devidamente preenchidos, nem que fosse só com água. Após aplicação nos poços, a placa foi

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90 vedada uniformemente com as tampas específicas (septa e plate retainer). Em seguida, foi criada a corrida na programação do aparelho ABI PRISM® 3500 seguindo procedimentos padronizados e trabalhando com a função “Fragment” e depois do preenchimento de todas as informações sobre as amostras a corrida foi iniciada.

Genotipagem das amostras: Após a eletroforese capilar, as amostras foram genotipadas automaticamente no software no Gene Mapper ID (v. 4.1) e conferidas uma a uma para encontrar inconsistências na determinação dos picos referentes a cada alelo antes de gerar o eletroferograma. A figura 16 exemplifica um dos quatro tipos de eletroferogramas avaliados no estudo. O painel de 46 MIAs foi dividido em quatro grupos e marcados por quatro tipos de fluoróforos que emitem as cores azul, como no exemplo, verde, vermelho e amarelo.

Figura 16: Exemplo de um eletroferograma segundo a cor azul emitida pelo fluoróforo marcado em

parte do painel de MIAs.

Fonte: elaborada pela própria autora

5.8.2.3 Estimativas das proporções de ancestralidade individual e geral e classificação da ancestralidade

O software STRUCTURE v2.3.4 fez análises sucessivas (3 corridas independentes com 100.000 comparações) confrontando a frequência dos Indels na população deste estudo com as populações ancestrais (EUR, AFR e AMR).

Para as análises de proporção por grupos os indivíduos foram categorizados nos grupos predominantemente africano (PAFR) e predominantemente europeu (PEUR), utilizando a proporção de ancestralidade > 0,650 (QUEIROZ et al., 2016) como ponto de corte para cada

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91 grupo ancestral respectivo. O grupo ameríndio não foi considerado nesta categorização por se apresentar em frequência muito baixa na população de estudo. Um terceiro grupo foi classificado em predominantemente miscigenado (PMIX) quando não atendeu os critérios citados anteriormente. O ponto de corte adotado foi escolhido porque é maior do que o valor médio dos MIAs europeus descritos para a população de Ouro Preto (50,3-53,9%), e cuja média é observada para a população do sudeste brasileiro (55,2-79,9%). As características antropométricas, clínicas, bioquímicas e demográficas foram analisadas entre os três grupos.

5.8.3 Análise dos polimorfismos genéticos (SNPs) de risco cardiovascular

5.8.3.1 Critérios de escolha

Para esta análise foi determinada a frequência alélica e genotípica de um painel de 12 polimorfismos do tipo SNP e testadas quanto ao Equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW) (WIGGINTON et al., 2005). Os critérios para a escolha do painel envolveram:

1) associação positiva com fatores de risco cardiovascular (hipertensão, obesidade, dislipidemias, diabetes tipo 2 e resistência à insulina) em pelo menos cinco estudos prévios e em grupos étnicos relacionados à formação da população de Minas Gerais;

2) Não apresentar alelo raro em estudos com populações africanas e europeia.

A tabela 5 mostra as características do painel de 12 SNPs segundo o número do identificador (rs ou RefSeq) de acordo com a base de dados (dbSNP), localização nos cromossomos autossômicos, o gene relacionado, o alelo descrito no NCBI e segundo as principais referências na população brasileira, latino-americana, europeia ou africana:

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92 Tabela 5: Características dos 12 SNPs selecionados para o estudo

FN rs CR Gene Alelo - dbSNP Referência H ip er tensão rs699 1 AGT G/A (FWD)

Pereira et al. 2003; Kimura et al., 2012; Wollinger et al., 2015; Bonfim-Silva et al., 2016

rs1799983 7 NOS3 G/T (FWD)

Marroni et al., 2005; Sandrim et

al., 2006a, Pereira et al., 2006;

Luizon et al., 2009; Chang et al., 2010; Kimura et al., 2012

rs5443 12 GNB3 C/T (FWD)

Siffert et al. 1999; Grove et al., 2007; Kimura el al., 2012; Zheng

et al., 2013 D isl ipid em ia rs429358 19 APOE C/T (FWD)

Sakuma et al., 2004; França et al., 2004; Mendes-Lana et al, 2006; Chang et al., 2010; Alvim et al., 2010; Lazzaretti et al., 2013

rs7412 19 APOE C/T (FWD) Sakuma et al., 2004; França et al., 2004; Alvim et al., 2010; Chang

et al., 2010; Lazzaretti et al., 2013

rs693 2 APOB G/A (FWD)

Saxena et al., 2007; Sandhu et al., 2008; Deo et al., 2009; Lazzaretti

et al., 2013; Rodrigues et al.,

2013; Tamburús, 2015; Mendes 2015; Niu et al., 2017

rs4520 11 APOC3 C/T (FWD) Salazar et al., 2000; Dorfmeister _{et al., 2007; Ota et al., 2011}

rs5128 11 APOC3 C/G (REV)

França et al., 2005; Fiegenbaum

et al., 2007; Ota et al., 2011; Song et al., 2015

rs5925 19 LDLR C/T (FWD)

Salazar et al., 2000; Ríos- González et al., 2014; Bauerfeind

et al., 2006; Zyl et al., 2014;

Rodríguez-Arroyo et al., 2016 O bes idad e, R I e D MT2 rs1801282 3 PPARG C/G (FWD)

Tavares et al., 2005; Gouda et al., 2010; Passaro et al., 2011; Queiroz et al., 2015; Rocha et al., 2015

rs4721 7 RARRES2 G/T (FWD) Müssig et al., 2009; Fonseca 2014; Leiherer et al., 2016

rs17173608 7 RARRES2 G/T (FWD)

Müssig et al., 2009; Hashemi et

al., 2012; Fonseca 2014; Leiherer et al., 2016

FN: Fenótipo CR: Cromossomo RI: resistência à insulina DMT2: Diabetes Mellitus tipo 2 REV: do inglês Reverse FWD: do inglês Forward

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93 5.8.3.2 Técnica de discriminação alélica pelo sistema TaqMan

Para a análise deste painel, foi utilizada a técnica de discriminação alélica pelo sistema TaqMan (Applied Biosystems) com sondas TaqMan® MGB (minor groove binder) através da PCR em tempo real (qPCR) utilizando um conjunto de iniciadores e sondas específicas para cada SNP. Todas as análises de genotipagem foram feitas no equipamento 7500 fast Real-Time PCR Systems (Applied Biosystems) no Setor de Biologia Molecular do Laboratório de Epidemiologia da Escola de Medicina da Universidade Federal de Ouro Preto.

As amplificações obedeceram aos seguintes ciclos:

Desnaturação inicial: 95ºC, 10min

40 ciclos: 95ºC, 15seg

Extensão final: 60ºC, 1min

Volume de reagentes/amostra de DNA:

Volume final – 10 µl 1X

TaqMan™ Universal PCR Master Mix 5 µl

20x Primer Mix 1 µl

Água 4,5 µl