XXVI Congresso de Iniciação Científica
Extração de DNA e PCR de Anelídeos Utilizados como Biomarcadores de Contaminação do Solo
Ana Caroline Conrado, Patrícia Gleydes Morgante, Patrícia Soares Santiago. Câmpus Experimental de Registro, Curso de Agronomia, anacarol_conrado@hotmail.com.
Palavras Chave: Amyntas gracilis, PCR, identificação molecular.
Introdução
As minhocas têm sido amplamente utilizadas como bioindicadores da qualidade do solo, mas os ensaios ecotoxicológicos têm usado espécies que não são representativas de solos brasileiros [1].
Análises prévias mostraram que Amyntas gracilis, não empregada nos ensaios supracitados, é uma espécie de anelídeo mais representativa de nossos solos [1]. Dessa forma, pretende-se avaliar o potencial dessas oligoquetas como bioindicadores da qualidade do solo e, para isso, a identificação precisa da espécie será crucial no trabalho. O presente estudo se insere nesse contexto uma vez que visa estabelecer os métodos necessários para a identificação molecular de A. gracilis por meio de marcadores de DNA.
Objetivos
Realizar extrações de DNA de A. gracilis e reações de PCR com marcadores de DNA para viabilizar seu sequenciamento e, consequentemente, a identificação molecular da espécie.
Material e Métodos
As extrações de DNA foram realizadas com exemplares de A. gracilis adquiridos de minhocario, retirando-se o fragmento de tecido no momento de seu uso, a partir de indivíduos criados no laboratório. A padronização do método foi feita com base em protocolos descritos anteriormente [2, 3].
As reações de PCR foram feitas com uso de dois marcadores descritos na literatura, sendo eles: 16S rDNA [4] e COI [5]. As condições químicas das reações seguiram padrões utilizados no laboratório [6]. Os ciclos de amplificação contaram com: uma desnaturação inicial (94 °C; 5 min.), seguida de 30 ciclos compostos por desnaturação (94 °C; 1 min.), anelamento (T °C; 1 min.)* e extensão (72 °C; 1min.
e 30s.) e, uma extensão final (72 °C; 5 min.). O resultado das reações foi avaliado por meio de eletroforese em gel de agarose. *O anelamento para 16S rDNA foi em 44 °C e para COI foi em 49 °C.
Resultados e Discussão
Foram realizadas um total de 35 extrações de DNA para padronização do método, obtendo-se, ao final,
20 amostras com boa qualidade e quantidade.
Observou-se que a limpeza e isolamento apenas de tecido muscular foram essenciais para alcançar o resultado desejado. As reações de PCR foram bem sucedidas nas condições estabelecidas, obtendo-se produtos de tamanho esperado (figura 1).
Figura 1. Resultado de PCR para COI (1 e 2) e para 16S (3 e 4). M = Marcador DNA Ladder 100 pb.
No momento estão sendo realizadas as PCRs das amostras de DNA obtidas, a fim de enviar os fragmentos para o sequenciamento.
Conclusões
A padronização dos métodos foi alcançada com sucesso e o sequenciamento dos fragmentos permitirá sua comparação em bancos de dados para a identificação molecular. No caso do marcador 16S haverá, ainda, importante contribuição no tema uma vez que há somente uma sequência depositada para A. gracilis no GenBank.
Agradecimentos
À G. Bertini pelo espaço para a manutenção das minhocas e pelas orientações sobre sua morfologia.
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1 Brown, G. G.; Oliveira, L. J. ; Korasaki, V. e Santos, A. A. dos.
EMBRAPA: Documento 308, 2006, 165-172.
2 Miller, A. S.; Dykes, D. D. e Poleski, H. F. Nucleic Acids Research, 1988, 16, 1215.
3 Siqueira, F.F.; Sandes, S.H.C.; Drumond, M.A.; Campos, S.H.;
Martins, R.P.; Fonseca, C.G. e Carvalho, M.R.S. Pedobiologia, 2013, 56, 15-21.
4 Palumbi, S. R. In: Hillis, D.M.; Moritz, C. e Mable, B. K. (eds).
Molecular systematics, 1996, Sinauer, Sunderland, 205-247.
5 Folmer, O.; Black, M.; Hoeh, W.; Lutz, R. e Vrijenhoek, R. Molecular Marine Biology and Biotechnology, 1994, 3, 294-299.
6 Morgante, P.G.; Sebastião, I.; Silveira, L.E.D.; Mori, G.M.; Conte, M.
e Coffani-Nunes, J.V. American Journal of Botany, 2012, 99, 434-436.
