Avaliação do método Western Blotting para diagnóstico de toxoplasmose congênita,.

(1)

www.jped.com.br

ARTIGO

ORIGINAL

Evaluation

of

the

Western

blotting

method

for

the

diagnosis

of

congenital

toxoplasmosis

夽

,

夽夽

Jaqueline

Dario

Capobiango

a,∗

,

Thaís

Cabral

Monica

b

,

Fernanda

Pinto

Ferreira

c

,

Regina

Mitsuka-Breganó

d

_,

_Italmar

_Teodorico

_Navarro

d

_,

_João

_Luis

_Garcia

d

e

Edna

Maria

Vissoci

Reiche

e

a_Universidade_Estadual_de_Londrina_(UEL),_Centro_de_Ciências_da_Saúde,_Departamento_de_Pediatria_e_Cirurgia_Pediátrica,

Londrina,PR,Brasil

b_Universidade_Estadual_de_Londrina_(UEL),_Centro_de_Ciências_Agrárias,_Programa_de_{Pós-graduac¸ão}_em_Ciência_Animal,

c_Universidade_Estadual_de_Londrina_(UEL),_Departamento_de_Medicina_Veterinária_Preventiva,_Laboratório_de_Zoonoses

eSaúdePública,Londrina,PR,Brasil

d_Universidade_Estadual_de_Londrina_(UEL),_Centro_de_Ciências_Agrárias,_Departamento_de_Medicina_Veterinária_Preventiva,

e_Universidade_Estadual_de_Londrina_(UEL),_Departamento_de_Patologia,_Análises_Clínicas_e_{Toxicológicas,}_Londrina,_PR,_Brasil

Recebidoem13deoutubrode2015;aceitoem16defevereirode2016

KEYWORDS Congenital Toxoplasmosis; WesternBlotting; Diagnosis; Serology

Abstract

Objective: ToevaluatetheWesternblottingmethodforthedetectionofIgGanti-Toxoplasma gondii(T.gondii)(IgG-WB)intheserumofchildrenwithsuspectedcongenitaltoxoplasmosis.

Methods: Weaccompanied 47 mothers with acquiredtoxoplasmosis inpregnancy and their children,betweenJuneof2011andJuneof2014.TheIgG-WBwasdoneinhouseandthetest wasconsideredpositive ifthechildhadantibodiesthatrecognizedatleastonebandonIgG blotsdifferentfromthemother’sorwithgreaterintensitythanthecorrespondingmaternal band,duringthefirstthreemonthsoflife.

Results: 15children(15.1%)metthecriteriaforcongenitaltoxoplasmosisand32(32.3%)had the diagnosis excluded. The symptomswere observed in12 (80.0%)children and themost frequentwerecerebralcalcificationin9(60.0%),chorioretinitisin8(53.3%),andhydrocephalus in4(26.6%).IgMantibodiesanti-T.gondiidetectedbychemiluminescence(CL)werefoundin 6(40.0%)childrenandthepolymerasechainreaction(PCR)fordetectionofT.gondiiDNAwas positivein5of7performed(71.4%).ThesensitivityofIgG-WBwasof60.0%[95%confidence interval(CI)32.3---83.7%]andspecificity43.7%(95%CI26.7---62.3%).ThesensitivityofIgG-WB

DOIserefereaoartigo:

http://dx.doi.org/10.1016/j.jped.2016.02.014

夽 _Como_citar_este_artigo:_Capobiango_JD,_Monica_TC,_Ferreira_FP,_{Mitsuka-Breganó}_R,_Navarro_IT,_Garcia_JL,_et_al._Evaluation_of_the_Western

blottingmethodforthediagnosisofcongenitaltoxoplasmosis.JPediatr(RioJ).2016;92:616---23.

夽夽_Estudo_feito_na_Universidade_Estadual_de_Londrina,_Londrina,_PR,_Brasil.

∗_Autor_para_{correspondência.}

E-mail:jaquedc@uel.br(J.D.Capobiango).

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increasedto 76.0and89.1% when associated to theresearchofIgM anti-T. gondiior PCR, respectively.

Conclusions: TheIgG-WBshowedgreatersensitivitythanthedetectionofIgManti-T.gondii; therefore,itcanbeusedforthediagnosisofcongenitaltoxoplasmosisinassociationwithother congenitalinfectionmarkers.

PALAVRAS-CHAVE Toxoplasmose Congênita; Westernblotting; Diagnóstico; Sorologia

Avaliac¸ãodométodoWesternBlottingparadiagnósticodetoxoplasmosecongênita

Resumo

Objetivo: Avaliar o método Western Blotting para detecc¸ão de IgG anti-Toxoplasma gondii

(T.gondii)(IgG-WB)nosorodecrianc¸ascomsuspeitadetoxoplasmosecongênita.

Métodos: Acompanhamos47mãescomtoxoplasmoseadquiridanagravidezeseusfilhos,entre junho de2011ejunho de2014. OIgG-WBfoi feitointernamente eoteste foiconsiderado positivo quando acrianc¸a apresentava anticorpos quereconheciam pelomenos uma banda nasmanchasdeIgGdiferentedasbandasdamãeoucommaiorintensidadedoqueabanda maternacorrespondente,duranteosprimeiros3mesesdevida.

Resultados: Atenderam aos critérios para diagnóstico de toxoplasmose congênita 15 crianças(15,1%)e32(32,3%)tiveramodiagnósticoexcluído.Ossintomasforamobservadosem 12crianças(80%)eosmaisfrequentesforamcalcificaçãocerebralemnove(60%),coriorretinite emoito(53,3%)ehidrocefaliaemquatro(26,6%).OsanticorposIgManti-T.gondiidetectados porquimiluminescência(QL)foramencontradosemseiscrianças(40%)eareaçãoemcadeia dapolimerase(RCP)paradetecçãodoDNAdeT.gondiifoipositivaemcincodesetereações (71,4%).AsensibilidadedoIgG-WBfoide60%[intervalodeconfiança(IC)de95%,32,3a83,7%] eaespecificidadefoide43,7%(ICde95%,26,7a62,3%).AsensibilidadedoIgG-WBaumentou para76e89,1%quandorelacionadaàpesquisadeIgManti-T.gondiiouàRCP,respectivamente.

Conclusões: OIgG-WBmostroumaiorsensibilidadedoqueadetecçãodeIgManti-T.gondii; portanto, podeserusadoparaodiagnóstico detoxoplasmosecongênitaemassociaçãocom outrosmarcadoresdeinfecçãocongênita.

eumartigoOpenAccesssobumalicenc¸aCCBY-NC-ND(http://creativecommons.org/licenses/ by-nc-nd/4.0/).

Introduc

¸ão

Amaioriadascrianc¸ascomtoxoplasmosecongênita(TC)não demonstrasinaisousintomasnonascimento.Aindaassim, háumriscodedesenvolversequelastardias,principalmente comprometimentooculareneurológico.1

Todas as crianças cujas mães tiveram toxoplasmose aguda no curso da gravidez são consideradas suspeitas; portanto, devemser submetidasa umainvestigação soro-lógicacomdetecção deanticorposanti-Toxoplasmagondii

(T.gondii).1,2

Contudo, um diagnóstico sorológico que confirme a infecção por T. gondii por meio da detecção de anticor-pos específicos IgMe/ou IgA contrao parasitanão ocorre emtodososrecém-nascidos.1,3---5_Portanto,_os_anticorpos_IgG contra o T. gondii em amostras de soro em série devem seranalisadose acriançadevecontinuarsob acompanha-mentoambulatorial,quepodelevarmesesatéadefinição dodiagnóstico.1,6

Emumfetoinfectado,osanticorposIgGeIgMproduzidos contraos determinantesantigênicos deT. gondii poderão diferirdosanticorposIgGeIgManti-T.gondiidetectadosno soromaterno,oquesugereumaneossíntesedeanticorpos específicos. Assim, crianc¸as com TC com não reatividade em testes convencionais para detecc¸ão de IgM foram

diagnosticadas nos primeiros meses de vida por meio do métodoWesternBlot(WB).7---9

Existe a necessidade de um diagnóstico precoce e rápidocomummétododebaixacomplexidadequepermita que os laboratórios de referência em toxoplasmose dife-renciem os resultados duvidosos obtidos com os métodos sorológicos convencionais de rotina, como imunofluo-rescência indireta (IFI), ensaio imunossorvente ligado a enzima (Elisa) e imunoensaio de micropartículas com quimiluminescência(QL).

O objetivo desteestudo foi avaliar o métodoWB para detecc¸ãodeanticorposIgGanti-T.gondii(IgG-WB)nosoro dacrianc¸a e de sua mãe com toxoplasmose adquirida na gravidezparaajudarnodiagnósticoprecocedeTC.

Métodos

Indivíduos

(3)

o cuidado pré-natal. As amostras de sangue dos pares criança/mãeforamcoletadassimultaneamentedurante os primeiros3mesesdevidadacriançaearmazenadasa---20◦_C paraoWB.Ogrupodecontroleconsistiaemcriançascujas mãesmostraram suspeita detoxoplasmose agudadurante agravidez, masnãoatendiam aoscritérios para TC.2,10,11 Nesseperíodo,47criançasesuasmãesforammonitoradas. Dessas, 15 (15,1%) crianças foram diagnosticadas com TC eem 32(32,3%)essediagnósticofoi excluído.As grávidas receberamespiramicinaousulfadiazinamaispirimetamina e ácido folínico atéo nascimento dacriança. As crianças comsuspeitadeinfecçãoreceberamsulfadiazinamais piri-metaminaeácidofolínicoatéadefiniçãododiagnóstico.

Critériosdediagnósticoemcrianc¸as

ConsideramosaTCquandoacriançaapresentouelevaçãode títulosespecíficosdeIgGanti-T.gondiiemamostras sequen-ciaisnosprimeirosmesesdesuavidae/ouapersistênciade títulosdeIgGanti-T.gondiiapós12mesesdevidae/ou reati-vidadeparaIgManti-T.gondiie/oucoriorretinitee/oulesão dosistemanervosocentral(SNC)comreatividadeparaIgG e/oupositividadeparaoDNAdeT.gondiicomreaçãoem cadeiadapolimerase(RCP).2,10,11

Testesorológicoparadetecc¸ãodeIgMeIgG

anti-T.gondii

Os testes sorológicos durante o cuidado pré-natal e em amostrasdecrianc¸as foramfeitos pormétodos laboratori-aisderotinaconvencionais.OsanticorposIgGanti-T.gondii foramdeterminadosporimunofluorescênciaindireta(IFI)12 (Immunoblot, Biolab-Mérieux, Rio de Janeiro, RJ, Brasil), comT. gondiiobtidos do fluidoascéticode ratos infecta-dos,equimioluminescência(QL)(Architect,SistemaAbbott, Wiesbaden, Alemanha) com antígenos recombinantes de

T.gondiip30(SAG1)ep35(GRA8).OsanticorposIgManti-T. gondii tambémforam detectados com QL (Architect, Sis-tema Abbott,Wiesbaden, Alemanha) com antígeno p30 e lisadototaldeT.gondii.

AntígenosdeT.gondii

Cinco ratas albinas entre 45 e 60 dias e entre 25 e 40g foram usadas na obtenção de taquizoítos da cepaRH de T.gondii. Osanimaisforam inoculadospelavia intraperi-toneal com umasuspensão de taquizoítos vivos (105_/mL) em uma solução salina estéril. O exsudato foi obtido 48horasapósainoculaçãopormeiodalavagemdacavidade peritonealcom3mLdesoluçãosalinaestéril.Asamostras passaramporumaagulha27Gpararuptura dascélulasdo hospedeiro.Então,foram centrifugadase osedimento foi padronizadoa109_{taquizoítos/mL}_por_meio_da_contagem_em umacâmaradeNeubauer.13

MétodoIgG-Westernblotting

AsproteínasdeT.gondiiaseremusadasnoIgG-WBforam quantificadascom o método deLowry et al.14 _e _o _gel_de poliacrilamida12%foiusadonaseparac¸ãoeletroforéticade

proteínas com a transferência subsequente das proteínas paraumamembranadenitrocelulose (iBlot® Gel Transfer System,Califórnia,EUA).Opapeldenitrocelulosefoi man-chadocomPonceaue,apóslavagemcomáguadestilada,as tirasdenitroceluloseforamcortadasebloqueadascomleite desnatado a 5% mais Tween® salina tamponada com Tris (TBS)(Sigma-Aldrich,MO,EUA).Posteriormente,lavamosas tirascomTBSeleitedesnatadoa5%e,então,adicionamos o soro do paciente diluído em Tween TBS (Sigma-Aldrich, MO,EUA) e leite desnatadoa 5%, lavamose adicionamos conjugadoIgGanti-humano(Invitrogen,LifeTechnologies, CA,EUA)diluídoemTweenTBSeleitedesnatadoa5%.Após lavagensadicionais, adicionamos o substratocromogênico diaminobenzidina (DAB) a 0,2% (Acrös Organics, Thermo Fisher Scientific, Geel, Bélgica) e peróxidode hidrogênio (100␮L).Quandoasbandasforamvisualizadas,areac¸ãofoi

interrompidacomáguadestilada.Asamostrasdecontrole positivoenegativodeanti-T.gondiiforamincluídasemcada teste.

O teste foi considerado positivo no caso de a crianc¸a terproduzidoanticorposquereconheceramnomínimouma banda deproteínas diferentedamãeoucommaior inten-sidadedoqueabanda maternacorrespondente(fig.1),o que caracterizou a neossíntese de anticorpos IgG anti-T. gondii.15---18 _Para_controlar _a_{subjetividade}_da_leitura, _dois observadores independentes leram os padrões do IgG-WB àscegase semoconhecimentodos resultadossorológicos anterioresdostestesconvencionais;houveconcordânciaem 100%dosresultados.

A especificidade do método IgG-WB foi determinada com 26amostrasséricas obtidasdeindivíduos soronegati-vosparatoxoplasmose(anticorposIgGeIgManti-T.gondii

nãoreativoscom QL)ecomsororreatividade aanticorpos comrelac¸ãoaoutrospatógenos,comoTreponemapallidum

(n=5), Trypanosoma cruzi (n=5), Leishmania spp (n=2),

Paracoccidioides brasilienses (n=5) ou sororreatividade a marcadoressorológicosdedoenc¸asautoimunes,como anti-corposantinucleares(n=5)eanticorposanti-DNAdecadeia dupla(n=4).

Usodareac¸ãoemcadeiadapolimerasepara

detecc¸ãodoDNAdeT.gondii

O DNA foi extraído de células sanguíneas periféricas de crianças, coletado com o etilenodiaminotetracético (EDTA)como anticoagulante,atétrêsmesesapós o nasci-mento, comokitEasyPrepDNAMiniI(EasyGen,Favorgen Biotech, Áustria). A amplificação do DNA de T. gondii foi feita com o método descrito por Homan et al.19 _Os Primers Tox4 (CGCTGCAGGGAGGAAGACGAAAGTTG) e Tox5 (CGCTGCAGACACAGTGCATCTGGATT) foram usados para amplificação deum fragmento de529 paresde base (pb) (GenBankn◦ _AFI46527)_do_DNA_de_T._gondii._A_RCP_foi_feita emumvolumefinalde22,5␮L,com2,5␮LdeDNAextraído

da amostra; 1␮L de 1mM para cada primer, 100mM de

desoxirribonucleotídeosfosfatados(dNTP)(Invitrogen,Life Technologies,CA,EUA),60mMdeTris-HCl(pH9),15mMde (NH4)2SO4,2mMdeMgCl2e0,25␮LdeTaqDNApolimerase

(Invitrogen, Life Technologies, CAa, EUA), também finali-zadacom7,75␮Ldeágua MilliQ.Aamplificac¸ãofoifeita

(4)

55

kDa kDa

94

77

67

58

37 30

23

20

13

6 72

64

58

kDa kDa

68

50

45

40

27

16

14

M C M C M C CP CN

B

A

C

D

46 44

39 31

25 22

16

11

160 154 130 121

104 101 94 78 77 76 67 64 58 50 46 44 40 37 33 31 30 25 23

20 13

10 6

Figura1 Reconhecimentopadrão deproteínasde cepasRHdeToxoplasmagondiiporanticorpos IgG comométodo Western Blotting(IgG-WB) em amostrasdesorodemães comtoxoplasmoseadquiridaduranteagravidezeseusfilhos comsuspeitade toxoplasmosecongênita.A,IgG-WesternBlottingpositivoparatoxoplasmosecongênita.Bandasiguaisreconhecidasporanticorpos IgGcomintensidademaisfortenaamostradacriançaemcomparaçãocomaamostramaterna.B,IgG-WesternBlottingpositivopara toxoplasmosecongênita.BandasdiferentesreconhecidasporIgGdaamostradacriançaemcomparaçãocomaamostramaterna. C, IgG-Western Blottingnegativopara toxoplasmose congênita. Bandasiguais reconhecidasporanticorpos IgG de amostrasda criançaedamãe.M,mãe;C,criança;CP,controlepositivo;CN,controlenegativo.

CA, EUA),com a seguintecondic¸ão deciclo: 7 minutos a 94◦_C_para _desnaturac_¸ão _no₁◦ _ciclo, _seguido _de ₃₃ _ciclos de 1 minuto a 94◦_C _para_desnaturac_¸ão, ₁ _minuto _a ₅₅◦_C paraemparelhamentoe1minutoa72◦_C_para_extensão;_o ciclo35foiseguidoporumaextensãofinalde10minutosa 72◦_C._Uma_amostra_de_cada_produto_da_RCP_foi_submetida à eletroforese em gel de agarose a 2%. O DNA de cepas RH de taquizoítos (107_/mL) _foi _extraído _para _ser _usado como controlepositivo.A águafoiconsiderada ocontrole negativo.Amostrasdoscontrolespositivosenegativospara T.gondiiforamincluídasemcadateste.

Análiseestatística

FoifeitanoGraphPadPrism5(GraphPadSoftware,Inc.,San Diego,EUA).Asvariáveiscategóricasforamexpressasemum númeroabsoluto(n)eumpercentual(%)eanalisadaspelo teste qui-quadrado ouexato de Fisher. Foram calculados parâmetrosdesensibilidade,especificidade,valorpreditivo positivo(VPP)e valor preditivonegativo (VPN)com inter-valodeconfianc¸a(IC)de95%.Osvaloresdep<0,05foram consideradosestatisticamentesignificativos.

OestudofoiaprovadopeloComitêdeÉticaemPesquisa comSeres Humanos. Todasasmães participaram volunta-riamente e assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido.

Resultados

Das15criançascomTC,12(80%)eramsintomáticase aten-diamaoscritérios clínicosparadefinição dadoença(nove com calcificação cerebral, oito com coriorretinite e qua-trocomhidrocefalia),seis(40%)apresentaramreatividadea IgManti-T.gondii,cinco(33,3%)apresentaramelevaçãonos níveisdeIgGanti-T.gondiinosprimeirosmesesde vidae umadelas(6,7%)mostroupersistênciadetítulosdeIgG anti--T.gondiiemamostrassequenciais.Cincodassetecrianças (71,4%)submetidas àPCR para detectarDNAde T.gondii apresentaramresultadospositivos(tabela1).

Entreas15criançascomTC,otesteIgG-WBfoipositivo em nove (60%) e entre as32 crianças sem TCo testefoi positivoem18(56,3%),oqueresultouemumasensibilidade de60% (ICde95%, 32,3a83,7%),especificidadede43,7% (ICde95%,26,4a62,3%),VPPde33,3%(ICde95%,16,5a 54,0%)eVPNde70%(ICde95%,45,7a88,1%)(p=0,05875). Entre as crianças com TC, duas apresentaram IgG-WB negativoe IgManti-T.gondiipositivo;cincoapresentaram IgG-WBpositivoeIgManti-T.gondiinegativo;quatro apre-sentaramambosostestespositivosequatroapresentaram ambosostestesnegativos.

(5)

Tabela1 Característicasclínicaselaboratoriaisde15crianc¸ascomtoxoplasmosecongênitadejunhode2011ajunhode2014 Caso IgM

anti-T.gondii

RCP Primeiraamostra deIgGa

IgG seguintesb

Western Blottingb

Sinaisesintomasno1◦_mês_de_vida

IFI QL

1 Negativo NR 1:512.000 NR ↓ Negativo coriorretinite+calcificac¸ão+ hidrocefalia

2 Positivo NR 1:32.000 926,8 ↑ Positivo coriorretinite+calcificac¸ão 3 Positivo NR 1:512.000 NR ↓ Positivo vitrite(coriorretinite

após)+calcificac¸ão+hidrocefalia 4 Negativo NR <1:16 NR ↑ Positivo coriorretinite

5 Negativo NR 1:1024 162,0 ↔ Positivo calcificação 6 Negativo Positivo NR 200,0 ↑ Positivo assintomático 7 Negativo Positivo 1:32.000 147,5 NR Negativo hidrocefalia 8 Negativo Negativo 1:8.000 312,0 ↑ Negativo assintomático 9 Negativo Positivo 1:512.000 175,6 ↓ Negativo assintomático 10 Positivo Positivo 1:512.000 188,1 ↓ Positivo coriorretinite 11 Negativo Positivo 1:32.000 139,8 NR Positivo calcificação 12 Positivo Negativo NR 84,8 ↑ Negativo vitrite+calcificação 13 Positivo NR NR 200,0 NR Positivo coriorretinite+calcificação 14 Negativo NR NR 173,9 ↓ Positivo coriorretinite+calcificação+

hidrocefalia

15 Positivo NR NR 1655,0 ↓ Negativo coriorretinite+calcificac¸ão

IFI,ImunofluorescênciaindiretaparadetecçãodeIgGanti-T.gondii;NR,nãorealizada;QL,imunoensaioquimioluminescentede micro-partículasparadetecçãodeIgGanti-T.gondii,expressoemUI/mL;RCP,reaçãoemcadeiadapolimeraseparadetecçãodoDNAde

Toxoplasmagondii;↑,aumentonosníveisdeanticorposIgGanti-T.gondiiemamostrasdesoroemsérie;↔,persistênciadeníveis deIgGanti-T.gondiiemamostrasdesoroduranteoacompanhamento;↓,reduc¸ãodeanticorpos.

a_Amostra_coletada_no₁◦_mês_de_vida.

b _Amostra_coletada_nos_primeiros₃_meses_de_vida,_com_todas_as_crianc_¸as_em_tratamento.

seteapresentaram bandasdiferentesdaquelas observadas nosoromaternoeduasapresentarambandasdemaior inten-sidadedoqueaquelasapresentadaspelasamostrasdesuas mães.Asbandasdominantesreconhecidaspelosanticorpos IgG em amostras de crianc¸as com TC e em crianc¸as não infectadassãoapresentadasnafigura2.

Quantoàs26amostrasdepacientescomoutrasdoenc¸as, duas não apresentaram reatividade e 24 apresentaram

P 94 0 10 20 30 40

P 78 P 58

Sem toxoplasmose congênita Com toxoplasmose congênita

P 44

Bandas antígenos (kDa)

Frequência, %

P 31 P 30 P 13

Figura 2 Distribuic¸ão das proteínas de Toxoplasma gondii

mais frequentesreconhecidas por anticorpos IgG nosoro de criançascomtoxoplasmosecongênitaecriançassemadoença, deacordocomseupesomolecular(kDa)(p>0,05paratodasas proteínasreconhecidas).

reatividade de anticorpos IgG, que reconheceram proteí-nascomPMentre17e118kDa.As proteínasreconhecidas commaisfrequênciaforamp22(11/40,7%),p34(9/33,3%), p38 (8/29,6%), p94 (6/22,2%), p56 (5/18,5%) e p30 (5/18,5%).

A análise dos resultados de IgM anti-T gondii com QL apresentousensibilidadede40%(ICde95%,16,3a67,6%), especificidadede100%(ICde95%,89,1a100%),VPPde100% (ICde95%,54,1a100%)eVPNde78,1%(ICde95%,62,4a 89,4%)(p=0,0005).Noquedizrespeitoàdetecc¸ãodoDNA doparasitacomRCP,asensibilidadefoide71,4%(ICde95%, 29a96,3%),especificidadede100%(ICde95%,69,2a100%), VPPde100%(ICde95%,47,8a100%)eVPNde83,3%(ICde 95%,51,6a98%)(p=0,0034).

A sensibilidade e a especificidade do IgG-WB, quando relacionadasaoutrosmarcadoresdeTC,comoapresenc¸a deIgManti-Tgondii,RCPpositivaesintomasclínicos,são apresentadasnatabela2.

OIgG-WBfoipositivoemseisdosnovepacientes(66,7%) com lesões oculares e em três dos seis pacientes (50%) comTCsemlesõesoculares(p=0,6224),comsensibilidade de66,7%(ICde95%,29,9 a92,5%),especificidadede50% (ICde95%,11,8a88,2%),VPPde66,7%(ICde95%,29,9a 92,5%)eVPNde50%(ICde95%,11,8a88,2%).

Discussão

(6)

Tabela 2 Sensibilidadeeespecificidadedométodo Wes-ternBlottingparadetecc¸ãodeIgGanti-Toxoplasmagondii

(IgG-WB), IgM anti-Toxoplasma gondii, reação em cadeia da polimerase (RCP) ao Toxoplasma gondii e presença de sintomas clínicos compatíveis coma toxoplasmose congê-nita,avaliadosemsérieeparalelamente,deacordocoma presençaouausênciadetoxoplasmosecongênita

Teste Sensibilidade (%)

Especificidade (%)

IgG-WB+ 60 43,7

IgMT.gondii+ 40 100

IgManti-T.gondiiouIgG-WB+ 76 43,7 IgManti-T.gondiieIgG-WB+ 24 100

RCP+ 71,7 100

RCP+ouIgG-WB+ 89,1 43,7 RCP+eIgG-WB+ 42,6 100 Sintomas+ 80 100 Sintomas+ouIgG-WB+ 92 43,7 Sintomas+eIgG-WB+ 48 100

IgG-WB, Western Blotting para diagnóstico de infecção con-gênita com detecção de anticorposIgG; IgManti-Toxoplasma gondiidetectadoporquimiluminescência;Sintomas, presença desintomase/ousinaisclínicoscompatíveiscomtoxoplasmose congênita;+testepositivo

convencionais varia amplamente, de 48,3% a 75%.3---5 _A ausênciadeIgManti-T.gondiipodeserjustificadapelofato de a infecção fetal ter ocorrido no inícioda gravidez ou como resultado de o tratamento materno para toxoplas-mosetersidofeitoduranteosdoisprimeirostrimestresde gravidez,oqueteriacausadoobloqueiodarespostaimune ouseuatraso.20_Ademais,_o_atraso_ou_a_ausência_de_resposta imune detectável pormétodos padrão(dosagem deIgGe IgMouWB)podeestarrelacionadoadiferençasnaresposta imune individual.Outra desvantagem dessemarcador é o atrasonacoletadeamostras,compositividadereduzidade IgM depoisdos primeiros30 dias devida.21 _Assim,_muitas vezes é necessário monitorar os resultados sorológicos com a identificação de títulos estáveis ou crescentes de IgG anti-T. gondii, que atrasam o diagnóstico e causam incertezaà família.16 _Nesse _contexto, _o _IgG-WB_pode _ser usado para comparar os padrões de anticorpos com o

T.gondiiemamostrasdesorodas mãesedeseusfilhose paradeterminarseosanticorpossãotransmitidos passiva-mente ou sintetizados pelo feto ou neonatoem casos de TC.15

Outros autores observaram umamaior contribuição do IgG-WB parao diagnóstico de TCnos primeiros meses de vida.22,23 _Além _disso, _a _associac_¸ão _do _IgG-WB _com _outros métodossorológicospodeaumentaraprobabilidadedo diag-nóstico. Em uma coorte de crianças, a sensibilidade do IgG-WBerade82,4%eaumentoupara85,7%quandoo IgG--WBeraassociadoà presençadosanticorposIgMe/ouIgA anti-T. gondii com o Elisa.16 _Outro _estudo _mostrou _que _a combinaçãodostestesdeimunocapturadeIgAeIgM,a aná-lisedospadrõesdoWBparaIgGeIgMeacombinaçãodas duastécnicaspermitiramadetecçãode94%,94%e100%dos casos,respectivamente.24

OsresultadosdoIgG-WBobtidosnopresenteestudoestão próximosdaquelesencontradosporoutrosautores,que rela-taramumasensibilidadede73,5%.18_Esses_mesmos_autores relataramqueacombinac¸ãodeIgG-WBeIgM-WBaumentou asensibilidadepara86,5%.18

Asensibilidademaisbaixaobtidanesteestudopodeser explicada,emparte,devidoaofatodetodosospacientes comsuspeitadeTCterem sidotratadoscomsulfadiazina, pirimetaminaeácidofolínicoduranteainvestigac¸ão,oque poderiainibiraneossíntesedeanticorpos.20

Outra estratégia para melhorar a sensibilidade desse métodopropostoéarepetiçãodoIgG-WBduranteos primei-ros3mesesdevida.8_Em_um_estudo_com_coleta_de_amostras nonascimento,asensibilidadedoanticorpoIgManti-T. gon-diipormétodos convencionais(reação deaglutinaçãopor imunoabsorção[Isaga]eElisa)foide52%epelométodoWB (comIgGeIgM),de67%.Aocombinarambososmétodos,a sensibilidadeaumentoupara78%nonascimentoe85%nos primeiros3mesesdevida,comdetecçãode94%doscasos deTC.17

Nesteestudo,analisamosalgumasamostrassequenciais doIgG-WB.Entreascriançasinfectadascomresultadofalso negativo na primeira amostrasegundo o método IgG-WB, duasdeseis(33,3%)reconheceramproteínasdiferentesem comparação comaamostramaternanasegundacoleta,o quecaracterizouaneossíntesedeIgGanti-T.gondiie justi-ficaanecessidadedarepetiçãodoIgG-WBemamostrasem série.

Em uma análise anterior, o momento da coleta da amostramaternainfluenciouoresultado dotesteIgG-WB, poisasmãesquereceberamtratamentoparatoxoplasmose durante a gravidezpodem deixar dereagir aos antígenos de T. gondii no período posterior ao nascimento, com resultado falso negativo.16 _Neste _estudo, _esse _fenômeno foi observado em uma mãe de uma criança infectada. Contudo,a maiorparte dasmãesapresentouumaumento nonúmerodebandasreconhecidasnasamostrascoletadas imediatamenteapósainterrupçãodotratamentonoparto. Em um estudo anterior, o PM de bandas antigênicas reconhecidas pela IgG de neonatos com TC variou entre 21e116kDa.18 _Neste_estudo, _{semelhantemente}_aos_dados encontrados por outros autores,15,16 _os _anticorpos encon-tradoscom alta frequênciaem crianças infectadas foram aqueles relacionados às proteínas de PM maiores do que 30kDa. As diferenças no PM de proteínas reconhecidas relatadasemestudosanteriorespodemserexplicadaspor diferentesexigênciasmetodológicas,comoapreparaçãodo antígenodeT.gondii,ascondiçõesdaeletroforeseemgel deacrilamidaeasdiluiçõesdesoro.20_Outra_explicac_¸ão_é_a diversidadegenéticaentreascepasdeT.gondii,oquepode levaraoreconhecimentodediferentesproteínas,alémdo fatodealgunsindivíduosapresentaremIgGquereconhece váriasproteínas, aopassoque outrosapresentamIgGque reconheceumaúnicaproteína.25

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demonstraroanticorpoIgGanti-T.gondii,quereconheceu as proteínas p22 e p46, ausentes no soro materno. Após 12 mesesde vida, essa crianc¸aque apresentou cicatrizes coriorretinianas continuou não reativa a anticorpos IgG anti-T.gondii avaliadosporQL eIFI; contudo,apresentou resultadopositivonoIgG-WB.

ATCcomnãoreatividadeparaIgGe IgManti-T.gondii

poderá ser resultante do tratamento de toxoplasmose na mãee noneonato.20 _O_tratamento _da_crianc_¸a_durante_um anoapósonascimentotambémpoderácausaranticorponão reativo.Contudo,namaioriadessescasos,háadetecc¸ãode IgGanti-T. gondiilogo após a interrupc¸ão dotratamento, denominadaefeitorebote.1,7,20

No presenteestudo, o Paciente1 mostrou não reativi-dade;masapresentouanticorposanti-T.gondiidetectáveis após a interrupção do tratamento. Semelhantemente ao Paciente4, ospacientes6,8e 9tambémmostraramuma queda nos anticorpos até a nãoreatividade e assim per-maneceram após a interrupção do tratamento. Existe a possibilidade de que esses pacientes deixem de reconhe-cerasproteínasp30ep35presentesnotestedeQL,oque justificaa nãoreatividadenesse testecoma evolução da infecção.

Portanto,em vez deavaliarsomente a persistênciade IgGanti-T.gondiipormeiodeQL,sugerimosousodo IgG--WBnomonitoramentosorológico,poisacrianc¸ainfectada podeproduzir anticorposcontraoutrasproteínas do para-sitae, assim, continuar positivaapós 12 meses deidade. Nesse caso, a ausência de IgG anti-T. gondii na QL não poderá excluir a TC, o que também justificaria a menor especificidadedoIgG-WB encontradadurante este estudo emcomparac¸ãocomestudosanteriores.16---18,22,23_Contudo, maisestudosdevem serfeitosantesdouso doIgG-WBno monitoramentosorológico.

Deacordocomumestudofeitonapopulac¸ãobrasileira, pacientescomIgMreativa pelométodoWB(IgM-WB) mos-trarammaiorriscodelesãomacularativadoquepacientes comIgM-WBnegativo.18_Contudo,_nenhuma_diferenc_¸a signi-ficativafoiencontradaentreapositividadedoIgG-WBea presenc¸adelesãomacular,comonesteestudo.Nãoé elu-cidado se há proteínas específicas de cepas de T. gondii

relacionadasalesõesoculareseseelaspoderiamexplicara maiorfrequênciadelesõesocularesemcriançasbrasileiras comTCdoqueemcriançasdeoutrospaíses.26 _A_principal limitaçãodesteestudofoiaausênciadeavaliaçãodas amos-trascomoIgM-WB,oquepoderiamelhorarasensibilidade dediagnósticodoteste.

O procedimento técnico do IgG-WB é de baixa com-plexidadee de custo disponível, o que o torna viável na rotina laboratorial. A desvantagem do método interno é sualentidão,quepoderiaserreduzidacomapadronização de um conjunto de reagentes de fabricação nacional. Asemiautomação do método com o uso de umprograma para leitura da intensidade da banda visualizada por meiodoWB facilitariaaleitura e a reprodutibilidadedos resultados.20

Os resultados reforçam a utilidade do método IgG-WB paraavaliaçãosorológicadepacientescomTC,commaior sensibilidadedoque a detecção deIgM anti-T. gondiipor métodosconvencionais.Portanto,oIgG-WBpodeserusado paraobterodiagnósticoprecocedeTCemcombinaçãocom outrosmarcadoresdainfecçãocongênitaporT.gondii.

Financiamento

ProgramadeApoioàExtensãoUniversitáriadoMinistérioda Educac¸ãodoBrasil(Proext---MEC/SESu)eConselhoNacional deDesenvolvimentoCientíficoeTecnológico(CNPq).

Conflitos

de

interesse

Osautoresdeclaramnãohaverconflitosdeinteresse.

Agradecimentos

Atodosospacienteseparentesquecontribuíramparaeste trabalho, ao Programa de Pós-Graduac¸ão em Ciências da SaúdedaUniversidadeEstadualdeLondrina(UEL)eao Pro-gramadePós-Graduac¸ãoemCiênciaAnimaldaUEL.

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