Marcos Leite Santoro
Estudos moleculares das regiões
cromossômicas 7q31 e 7q34 em portadores
de gagueira persistente familial
Orientador: Prof. Dr. Danilo Moretti-Ferreira
Co-Orientador: MSc. Gustavo Henrique Vieira
Botucatu
2009
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRATAMENTO DA INFORMAÇÃO.
DIVISÃO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: SELMA MARIA DE JESUS
Santoro, Marcos Leite.
Estudos moleculares das regiões cromossômicas 7q31 e 7q34 em portadores de gagueira persistente familial / Marcos Leite Santoro. – Botucatu : [s.n.], 2009.
Trabalho de conclusão (bacharelado – Ciências Biológicas – Modalidade Médica) – Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências de Botucatu, 2009
Orientador: Danilo Moretti-Fereira
Co-orientador: Gustavo Henrique Vieira
1. Gagueira 2. Distúrbios da fala - Aspectos genéticos 3. Genética
À Universidade Estadual Júlio de Mesquita Filho – UNESP – Campus de
Botucatu.
Ao Instituto de Biociências de Botucatu, sua direção corpo docente e
funcionários.
Ao departamento de Genética por disponibilizar sua estrutura para a realização
do trabalho.
Ao Serviço de Aconselhamento Genético.
À Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP – pela
bolsa de Treinamento Técnico (TT-II) no período de setembro de 2008 á
novembro de 2009 (2008/06994-0).
Ao Prof. Dr. Danilo Moretti-Ferreira, pelos ensinamentos, orientação e amizade.
Pela maneira como conduziu os problemas durante as fases difíceis deste
trabalho.
Ao MSc. Gustavo Henrique Vieira, por ter confiado em mim, e pela calma que
teve em me passar seu conhecimento.
À Profa. Dra. Cristiane Moço Canhetti de Oliveira, do Departamento de
Fonoaudilogia da Unesp de Marília, pela triagem das famílias, pelo auxílio nas
Medicina da Universidade de São Paulo, pela triagem das famílias e pelo
auxílio nesse trabalho.
Ao Prof. Dr. Henrique Krieger e ao Dr. Ricardo de Godói Mattos Ferreira, do
Departamento de Parasitologia do Instituto de Ciências Biomédicas da
Universidade de São Paulo, pela cooperação na avaliação dos resultados.
Ao Prof. Dr. Celso Luis Marino, do Departamento de Genética do Instituto de
Biociências – Unesp – Botucatu, por ter disponibilizado o uso do seqüenciador
para a realização das análises.
À Dra. Virgínia Elias Coscrato, pelo auxílio, grande apoio e otimismo.
Aos MSc. Carlos Eduardo Frigério Domingues e MSc. Bruno Faulin Gamba
pelo apoio na realização deste e de muitos outros trabalhos no SAG, e pela
paciência com que me ensinaram tudo o possível sobre genética.
À Minha Mãe pelo mesmo carinho e atenção de sempre com que me tratou
nestes anos de faculdade, nunca escondendo a saudades que, como eu,
sentia.
Ao meu pai, meu grande exemplo e espelho de pessoa, por ir além da
obrigação paterna e ser um grande amigo, e por construir com minha mãe esta
família maravilhosa que temos.
À minha irmã, pelas risadas, brigas e brincadeiras sem nexo que
Aos amigos da extinta República Bundeguita, que me acolheu e ensinou tudo o
que precisava saber nesta etapa da vida.
Aos meus irmãos da República Só-Kanela e parceiros de sala, Bruno Karia,
Raphael Sanches, Renan Padron e Rafael Borges, pelas risadas, festas,
estudos de madrugada, e loucuras que fizeram dos meus anos de faculdade os
melhores de minha vida.
Às minhas amigas Leila, Larissa, Karen, Juliana, e Maíra pelo carinho com que
sempre me trataram e por terem se tornado minhas irmãs.
Aos amigos de Encontro Regional de Biomedicina, por complementar minha
formação acadêmica, e ajudar a me tornar apto para o mundo fora da
faculdade.
Aos amigos Vinicius e Bianca, pela companhia e por me auxiliarem na
SUMÁRIO
RESUMO ... 3
1. INTRODUÇÃO ... 5
1.1 Definições da gagueira ... 5
1.2 Classificação ... 6
1.3 Diagnóstico ... 7
1.4 Prevalência ... 7
1.5 Etiologia ... 8
1.6 Estudos Moleculares ... 9
2. JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS ... 12
3. MATERIAS E MÉTODOS ... 13
3.1 Aspectos éticos ... 13
3.2 Casuística ... 13
3.2.1 Critérios fonoaudiológicos de inclusão e exclusão ... 14
3.2.2 Diagnóstico da gagueira e seleção das famílias... 14
3.2.3 Histórico Clínico ... 15
3.3 Obtenção das amostras biológicas ... 15
3.4 Obtenção do DNA genômico ... 15
3.5 Análise Molecular ... 16
3.5.1 Lócus e iniciadores microssatélites ... 16
3.5.2 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) ... 20
3.5.3 Genotipagem dos microssatélites ... 21
3.6 Procedimentos Analíticos ... 22
3.6.1. Estimativas de freqüências alélicas e genotípicas ... 22
3.6.2. Análise de segregação complexa ... 22
3.6.4 Análise de Ligação Não Paramétrica (NPL) ... 23
4. RESULTADOS ... 25
4.1 Grupo amostral... 25
4.2 Genotipagem dos marcadores microssatélites ... 33
4.3 Análise dos dados ... 50
4.3.1 Frequências Alélicas ... 50
4.3.2 Diversidade Gênica ... 52
4.3.3 Análise de segregação complexa ... 53
4.3.4. Análise dos genótipos ... 55
4.3.5 Análise de Ligação não paramétrica ... 56
5. DISCUSSÃO ... 58
6. CONCLUSÃO ... 60
7.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 61
RESUMO
A gagueira é um distúrbio no ritmo da fala no qual o indivíduo sabe
precisamente o que quer dizer, mas ao mesmo tempo é incapaz de dizê-lo devido à
repetição involuntária, ao prolongamento ou à cessação do som. Este distúrbio da
comunicação acomete cerca de 1 a 2 % da população mundial, e esta freqüência varia
de acordo com a idade, sendo mais comum em crianças com idade pré-escolar (de 2,4
a 5%); e com o sexo (3 M : 1 F). Desde a década de 50 a gagueira vem sendo
estudada por fonoaudiólogos e geneticistas. Vários fatores são tidos na literatura como
de risco para o desenvolvimento da gagueira persistente, dentre os quais destacamos:
idade, sexo, tipo e tempo de duração das disfluências, outros distúrbios
fonoaudiológicos, características secundárias, fatores genéticos, comportamentos
familiares e outros. Desta forma, a gagueira não deve ser tratada como uma entidade
nosológica única, pois apresenta característica multidimensional e multifatorial.
Dentre os principais fatores que sugerem etiologia genética para a gagueira
destacamos: 1)Gagueira presente em agregados familiais; 2)Maior probabilidade de se
desenvolver em indivíduos consanguíneos; 3)Semelhança dos traços fenotípicos
característicos, independente da língua e cultura; 4)Maior concordância entre gêmeos
monozigóticos do que em gêmeos dizigóticos.
A triagem genômica em famílias de gagos provenientes do Paquistão, e dos
Estados Unidos, Suécia e Israel indicaram uma possível ligação da gagueira com o
cromossomo 7. O objetivo deste trabalho foi a análise de ligação nas regiões
cromossômicas 7q31 e 7q34 através de marcadores microssatélites em 31 famílias
brasileiras com gagueira persistente, com mais de um indivíduo gago em idade acima
de 6 anos. Utilizou-se para a classificação da gagueira, o SSI aplicado por
profissionais especializados nesta disfluência. Foram incluídos todos os indivíduos
social.Todos os participantes tiveram amostras de seu DNA coletadas a partir de
amostras de sangue periférico.
Foram selecionados 10 marcadores microssatélites do cromossomo 7,
genotipados após PCR em seqüenciador automático. Na análise dos dados foram
utilizados programas SIMWALK 2, GENEPOP e POINTER. A análise de ligação entre
os 9 marcadores microssatélites (um excluído por não ser informativo) e a gagueira,
demonstrou não ligação deste fenótipo com as regiões 7q31 e 7q34 na população
brasileira estudada.
1. INTRODUÇÃO
1.1 Definições da gagueira
Segundo a American Speech-Language-Hearing Association (ASHA) a
gagueira afeta a fluência da fala, e se inicia na infância podendo em alguns casos
perdurar pela vida adulta. O distúrbio é caracterizado por dificuldades na produção da
fala, também chamado de disfluências. A ASHA ainda propõe que a fluência é um
aspecto de produção de fala que se refere à continuidade, suavidade, velocidade e/ou
esforço, com as quais unidades da linguagem fonológica, lexical, morfológica e/ou
sintática são expressas. Assim, é chamado de disfluência qualquer recurso que
prejudique a comunicação correta.
Disfluências não são necessariamente um problema, no entanto, podem
comprometer e impedir a comunicação quando em excesso. Assim sendo, os gagos
se deparam desde cedo com problemas dentro e fora de suas famílias. A correção por
parte dos pais e as eventuais brincadeiras de cunho preconceituoso feitas por outras
pessoas só ajudam a reforçar o quadro de gagueira (Canhetti-Oliveira, 2004).
Pode-se caracterizar as disfluências em típicas, as quais qualquer falante
normal pode apresentar durante a vida, seja devido a uma incerteza lingüística ou por
uma dificuldade na pronúncia das palavras (Perkins, 1990), e também em disfluências
atípicas presentes no comportamento de indivíduos gagos (Riley, 1972; Bloodstein &
Grossman, 1981; Schwartz & Conture, 1988; Peters & Guitar, 1991; Yairi & Ambrose,
1992a; Yairi et al., 1993; Throneburg et al., 1994; Bloodstein, 1995; Leeper & Culatta,
1995; Degiovani et al., 1999; Zackiewicz, 1999), tais como: bloqueios na fonação;
pausas silenciosas; frases incompletas; repetição ao nível do fonema, da sílaba ou do
sintagma; alongamento de sons; inserção de sons estranhos à fala; mudanças súbitas
na tonalidade e na intensidade da voz; falha no ritmo; falta de sincronização entre a
respiração e a fonação; introdução sistemática de pequenas frases ou interjeições;
Em alguns casos indivíduo portador da gagueira pode apresentar
comportamentos secundários, compensatórios acessórios dos quais se destacam:
artifícios de atraso (utilizar palavras sem significado ou palavras de preenchimento ou
esperar para tentar falar), iniciadores (piscar os olhos, inspirar fundo antes de iniciar a
fala, antecipar um momento de fala para iniciar a emissão da palavra temida),
comportamento de evitação (não falar quando deseja fazê-lo, utilizar sinônimos para
palavras temidas, parafrasear a emissão pretendida), reações de disfarce (cobrir a
boca simulando uma tosse para esconder o fato de estar gaguejando), reações de
interrupção (sacudir a cabeça, fazer caretas para sair de um bloqueio), movimentos de
busca (usar hesitações, vogal inapropriada ou alterar a velocidade de sons e sílabas
repetidas), entre outros (Andrade et al., 2001).
1.2 Classificação
Em um estudo da avaliação de comportamento e aspectos evolutivos em
crianças que apresentavam gagueira, Yairi & Ambrose (1992a) encontraram indícios
que a diferença entre o grupo de gagos persistentes e gagos recuperados era mais
evidente após o 20° mês do início do distúrbio. Baseando-se neste estudo Yairi et al,
(1996) realizaram um novo trabalho longitudinal, utilizando os seguintes parâmetros
para se considerar um indivíduo como gago:
a) abaixo de seis anos de idade;
b) considerados pelos pais como gagos;
c) considerados por dois investigadores como gago;
d) tempo de duração das disfluências menor que 12 meses;
e) gravidade da gagueira classificada pelos pais com no mínimo dois
em oito pontos ( 0 = normal; 1 = limítrofe; a 8 = muito grave);
f) taxa de gravidade maior ou igual a dois designada pelos
g) exibir pelo menos 3% de disfluências atípicas (ou gagas);
h) não apresentar nenhum distúrbio neurológico, nem outras
anormalidades.
Assim, apoiado-se nestes dois trabalhos a gagueira foi divida em três grupos:
1) Gagos de recuperação precoce: recuperação em 18 meses ou
menos após o inicio do distúrbio;
2) Gagos de recuperação tardia: recuperação entre 18 e 36 meses
após o inicio do distúrbio;
3) Gagos Persistentes: indivíduos que apresentam a gagueira mesmo
após 36 meses do inicio do distúrbio.
1.3 Diagnóstico
Diversas abordagens são utilizadas para diagnosticar o distúrbio de fluência.
Os critérios diagnósticos para a gagueira segundo o Diagnosis and Statistical Manual of Mental Disorder (DSM-IV) (1994) da American Psychological Association (APA) definem-se como:
a) Perturbação na fluência e padrão de tempo normal da fala (inapropriado
para a idade do indivíduo);
b) A perturbação na fluência interfere no rendimento escolar e profissional ou
na comunicação social;
c) Em presença de um déficit motor da fala, déficit sensorial, as dificuldades na
fala excedem aquelas habitualmente associadas com estes problemas.
1.4 Prevalência
A gagueira apresenta prevalência média de 1% da população mundial, e varia
principalmente de acordo com o sexo e idade do indivíduo (Craig et al., 2002). A
prevalência da gagueira é mais elevada no sexo masculino, cerca de 3 a 4% em
Andrews et al., 1983). Quanto á faixa etária, a prevalência da gagueira é maior na
infância, principalmente em crianças com idade pré-escolar, 2,4%, e diminui de acordo
com a faixa etária, chegando a menos de 1% na idade adulta (Bloodstein, 1995).
Em estudos realizados, observa-se que indivíduos do sexo feminino
apresentam uma maior taxa de recuperação espontânea da gagueira (Bloodstein,
1995; Buchel e Sommer, 2004; Felsenfeld, 2002; Yairi & Ambrose, 1999), sugerindo,
desta maneira, que a gagueira se apresenta mais prevalente no sexo masculino em
todas as faixas etárias, aumentando sua razão com o passar da idade, 1,5 M : 1 F em
crianças de 2 a 3 anos (Yairi, 1983; Ambrose et al., 1997), 2,1 M : 1 F em crianças de
2 a 6 anos de idade (Yairi & Ambrose, 1992a) e 4 a 5 M: 1 F em adultos (Bloodstein,
1995; Felsenfeld et al., 2000). Drayna et al. (1999) observou em uma amostra de
gagos persistentes uma razão de 3,8 M : 1 F, porém quando subdividiu em grupos de
gagos com familiares igualmente gagos e gagos sem histórico familiar ele encontrou
uma razão de 1,5M : 1F no grupo familial, e uma razão significativamente maior no
grupo não familial, 7M : 1F.
1.5 Etiologia
Nos últimos anos foi mostrado que o componente genético tem um papel
fundamental na susceptibilidade à gagueira (Andrews et al.,1991; Felsenfeld & Plomin,
1997; Felsenfeld et al., 2000), no entanto, apesar da forte influência genética, o
fenótipo pode sofrer influências do ambiente. Desta forma, a gagueira não pode ser
considerada uma entidade nosológica única, pois apresenta características
multifatoriais e multidimensionais (Andrade, 2000).
Dentre os fatores ambientais destacam-se, o histórico pré-natal, o histórico
médico, fatores estressantes (físicos e/ou emocionais) relacionados a danos cerebrais
precoces, já outros fatores como a ordem de nascimento e o “imitar” não têm sido
Kid et al., (1978) observou que a gagueira estava presente em agregados
familiais e que este padrão de agregação fugia do aprendizado por imitação de pais
igualmente gagos. A gagueira tem ainda maior probabilidade de se manifestar em
indivíduos consangüíneos (Andrews et al.,1991; Felsenfeld & Plomin, 1997; Felsenfeld
et al., 2000).
Bloodstein (1995) e Wingate (1964) observaram que familiares gagos
apresentavam uma semelhança dos traços fenotípicos característicos, sem estarem
ligados a diferenças culturais. Howie et al., (1981) realizaram um estudo com gêmeos
e observaram que apresentava uma concordância quanto ao distúrbio de 62,5 a 90%
em gêmeos monozigóticos, e de apenas 6,6 a 9%. Estes resultados demonstram que
a genética tem significante influência na gagueira, mas por outro lado mostram que a
genética por si só não é o único fator, uma vez que os gêmeos monozigóticos não
apresentaram 100% de concordância.
Modelos de herança genética têm sido elaborados para a gagueira, mesmo
havendo a possibilidade de este ser diferente em cada população (Alm et al., 2006),
acredita-se que exista um gene principal combinado a outros genes, o qual aumentaria
o risco de ocorrência da gagueira (Yairi & Ambrose, 2005). A dificuldade em elaborar
estes modelos se deve em grande parte à heterogeneidade genética e à relação
gene/ambiente.
1.6 Estudos Moleculares
Com estes indicativos tiveram início estudos moleculares de gagueira. Cox &
Yairi (2000), realizaram uma análise de ligação em uma população de gagos Huteritas
(população geneticamente isolada). Os resultados mostraram um desequilíbrio de
ligação nos cromossomos 1, 13 e 16, obtendo-se um NPL (escores de ligação não
paramétricos) de 1,1; 1,38; 0,58, respectivamente. Shugart et al., (2004) também
e encontraram na análise não paramétrica escores >5 em 18p e de >2.5 em 18p e 18q
proximal, um relevante resultado que sugeriu a existência de lócus para a
predisposição a gagueira familial no cromossomo 18.
Riaz et al., (2005) utilizaram triagem genômica em 56 famílias paquistanesas
consangüíneas, e encontraram uma ligação nos cromossomos 1, 5, 7, 12, com estes
resultados foram colocados marcadores adicionais no cromossomo 12 e sugeriu-se
após a análise estatística não-paramétrica uma ligação da gagueira familial com a
região 12q. Estes resultados apontaram heterogeneidade genética desta condição,
uma vez que regiões e cromossomos diferentes foram associados à gagueira quando
estudada em populações diferentes.
Suresh et al., (2006) através de varredura genômica com SNP´s (polimorfismo
de nucleotídeo único) e análise de ligação com 100 famílias americanas, suecas e
paquistanesas observaram indícios de ligação sexo-específico no cromossomo 7 (LOD
= 2,99 – 153 cM) no sexo masculino e no cromossomo 21 (LOD = 4,5 – 34 cM) no
sexo feminino. Nesta mesma análise foi observada no grupo de gagos recuperados e
persistentes uma ligação com o cromossomo 9 (LOD = 2.3 – 60 cM), e com o
cromossomo 15 (LOD = 1,95 – 23 cM) apenas no grupo de gagos persistentes.
Recentemente Pan et al., (2009) trabalharam com indivíduos gagos da
população chinesa (Han chinese) visando correlacionar 5 SNP´s com os genes de
DAT (transportador da dopamina) e DRD2 (receptor da dopamina) localizados nas
regiões 5p15.3 e 11q23, respectivamente. Eles encontraram que um destes SNP´s
estava associado à gagueira quando o alelo C estava presente, e associado à
proteção a gagueira o alelo T.
O gene SPCH1, localizado na região 7q31, (Fisher et al., 1998; Lai et al., 2001), encontrado em uma família com vários afetados pelo distúrbio de linguagem,
quando alterado, parece ser o responsável pelo desenvolvimento anormal de
da fala e linguagem. Esta região é também relacionada com o desenvolvimento de
autismo por Warburton et al. (2000) e Cheung et al. (2001). Desta forma, a região
7q31, do cromossomo 7 é candidata a realização de estudos com indivíduos gagos.
Tabela 1. A tabela mostra estudos moleculares já realizados, indicando as regiões cromossômicas encontradas em cada população.
CROMOSSOMO N° DE FAMÍLIAS
MÉTODO DE ANÁLISE
POPULAÇÃO
2. JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS
O entendimento da gagueira ainda tem um longo e complexo caminho a ser
seguido. É fundamental descobrir os mecanismos biológicos que a fazem ser expressa
em cada indivíduo, e diferenciá-la em gagueira persistente daquela que será uma
gagueira recuperada naturalmente, e desta forma, termos um tratamento precoce e
direcionado aos afetados.
O gene SPCH1, localizado na região 7q31, quando alterado, parece ser o responsável pelo desenvolvimento anormal de estruturas neurais, ligadas diretamente
ao desenvolvimento da fala e linguagem. Esta região é também relacionada com o
desenvolvimento de autismo. Desta forma, a região 7q31, do cromossomo 7 é
candidata a realização de estudos com indivíduos gagos.
A busca por um gene que cause ou simplesmente predisponha o indivíduo à
gagueira, e a maneira como este gene é transmitido, são de grande importância para o
diagnóstico e conseqüente tratamento do distúrbio. Desta maneira, indivíduos que
possivelmente recuperarão a fluência será atribuído apenas um acompanhamento
fonoaudiológico. Em contrapartida, em afetados por gagueira crônica, o tratamento
poderá começar mais cedo, desenvolvendo recursos de linguagem desde a infância.
Este trabalho apresenta como objetivos principais:
x O estudo da segregação genética em famílias de indivíduos gagos com
pelo menos um familiar igualmente gago.
x Mapeamento genético através da análise de 10 marcadores
microssatélites localizados no cromossomo 7, nas regiões 7q3.1 e
3. MATERIAS E MÉTODOS
3.1 Aspectos éticos
A presente pesquisa foi estruturada em quatro grandes centros: três deles
foram responsáveis pela triagem das famílias: o Centro de Estudos da Educação e da
Saúde (CEES – Unesp - Marília), o curso de Fonoaudiologia CEPRE/IEL/FCM –
Unicamp – Campinas e o Departamento de Fisioterapia, Fonoaudiologia e Terapia
Ocupacional (FOFITO – FMUSP – São Paulo); e um centro responsável pelas análises
moleculares, o Serviço de Aconselhamento Genético – Unesp – Botucatu.
Este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) do Hospital
das Clínicas da Unesp de Botucatu – SP, através do parecer OF. 311/2007-CEP e
pelos respectivos CEPs dos centros de triagens. Antes da coleta de material biológico
os indivíduos gagos e fluentes das famílias selecionadas foram informados quanto aos
objetivos da pesquisa, e esclarecidos quanto aos procedimentos que seriam adotados,
possíveis riscos de desconfortos gerados e que a recusa em participar da pesquisa
não lhe traria prejuízo algum no seu atendimento no centro de origem. Os pacientes
que aceitaram participar do estudo, assinaram o Termo de Consentimento Livre e
Esclarecido (TCLE) nos termos da Resolução CONEP/CNS196/1996, 340/2004 e
347/2005, no qual consta a autorização por parte do indivíduo ou responsável para
armazenamento de amostras de DNA em freezer -80°C sob responsabilidade do
Instituto de Biociências de Botucatu/UNESP (Anexo A).
3.2 Casuística
Este estudo contou com a participação de 31 famílias totalizando 185
indivíduos. A seleção das famílias foi realizada nos centros de fonoaudiologia, que as
selecionaram independente do sexo, etnia, grau de escolaridade ou nível social. O
Centro de Estudos da Educação e da Saúde (CEES – Unesp - Marília) selecionou 23
Fisioterapia, Fonoaudiologia e Terapia Ocupacional (FOFITO – FMUSP – São Paulo)
com 7 famílias com gagueira persistente originárias das regiões metropolitanas de São
Paulo e o curso de Fonoaudiologia CEPRE/IEL/FCM – Unicamp – Campinas com 1
família proveniente da região metropolitana da cidade de Campinas.
3.2.1 Critérios fonoaudiológicos de inclusão e exclusão
Os requisitos de inclusão dos probandos foram:
• Ser falante nativo do português brasileiro;
• Ter idade acima de seis anos;
• Apresentar histórico familial positivo para a gagueira, ou seja,
apresentar no mínimo outro parente gago;
• Ser diagnosticado como gago persistente.
Os critérios de exclusão para o grupo de probandos foram:
• Apresentar qualquer distúrbio neurológico genético ou não, nos
familiares, tais como distonia, doenças extras piramidais, deficiência
mental, epilepsia, transtorno do déficit de atenção e hiperatividade
(TDAH); sintomas ou condições psiquiátricas;
• Outras condições pertinentes que possam gerar erros no diagnóstico.
3.2.2 Diagnóstico da gagueira e seleção das famílias
Solicitou-se pareceres de dois profissionais com experiência no diagnóstico de
doenças fonoaudiológicas, isto foi feito através de registro audiovisual dos pacientes e
familiares. O diagnóstico de gagueira foi estabelecido a partir da metodologia de coleta
da amostra de fala proposta por Andrade (2000) – fala auto-expressiva obtida num
mínimo de 200 sílabas expressas (fluentes), eliciada por estímulo visual de figura
(adaptada às diferentes faixas etárias).
A partir da análise da amostra de fala foram considerados participantes do
1992b) e receberam 11 pontos ou mais (gravidade = leve) no Stuttering Severity Instrument – 3 (SSI-3) (Riley, 1994).
3.2.3 Histórico Clínico
O histórico clínico foi obtido através de entrevista com os pais do probando ou
mesmo com os probandos, quando estes eram maiores de idade. Foram dirigidas
perguntas com relação ao inicio, tempo de duração e fatores estressantes que podem
ter levado ao distúrbio.
Concomitantemente o histórico familiar foi analisado, através de informações
quanto à recorrência da gagueira em antecedentes familiais, para construção dos
heredogramas, levantamento do número de gagos dentro do núcleo familial e
determinação da razão sexual.
3.3 Obtenção das amostras biológicas
Na região oeste do Estado de São Paulo (Centro de Estudos da Educação e
Saúde CEES – Unesp – Marília) as coletas foram feitas em domicílio, após a triagem
dos probandos e de seus familiares na Clínica escola, e em São Paulo e em Campinas
as coletas foram feitas nas própias clinicas, no Departamento de Fisioterapia,
Fonoaudiologia, e Terapia Ocupacional – FMUSP; e no CEPRE/IEL/FCM – Unicamp,
respectivamente.
De cada participante foi retirado de 4ml de sangue periférico, armazenados em
tubos contendo anticoagulante EDTA a 6% (frasco Vacuette® EDTA 4 ml). As
amostras foram mantidas sob refrigeração a 4°C até o seu processamento no
Laboratório de Genética Molecular do Serviço de Aconselhamento Genético – IBB –
Unesp.
3.4 Obtenção do DNA genômico
O DNA foi extraído a partir de alíquotas de 1ml das amostras de sangue com o
segue os seguintes passos: lise das hemácias; lise dos leucócitos; precipitação salina
das proteínas nucleares e citoplasmáticas seguido da precipitação do DNA genômico
com isopropanol a 100%; lavagem do DNA com etanol a 70% e secagem a
temperatura ambiente por 15 minutos; hidratação do pellet de DNA em 100μL de tampão TE (Tris-HCl / EDTA); e por fim, incubação em banho-maria por 60 minutos a
65°C.
Posteriormente as amostras de DNA hidratado foram quantificadas através de
leitura em ND-100 Spectrophotometer da NanoDrop®. Neste processo utilizou-se 1μL
da amostra, otimizando o consumo das amostras. O material foi armazenado em
freezer -80°C e posteriormente descongelados e diluídos em água MiliQ para uma
concentração final de 20ng/μL, para que todas as amostras estivessem em uma
mesma concentração e facilitasse sua utilização nas análises moleculares.
3.5 Análise Molecular
Esta etapa foi realizada no Departamento de Genética – IBB – Unesp e teve
como objetivo a genotipagem de marcadores polimórficos microssatélites presentes
nas regiões 7q31 e 7q34.
3.5.1 Lócus e iniciadores microssatélites
Este estudo analisou 10 marcadores microssatélites selecionados a partir do
banco de dados do Marshield Genetic Maps e do Ensembl Genome, nos quais os marcadores escolhidos apresentavam taxa de heterozigose média de 0,7 e distância
média de 2cM entre um marcador e outro (tabela 2). Os iniciadores forward (right)
foram marcados com os fluoróforos FAM e HEX, como pode ser observado na
Na figura 2 é apresentado o esquema do cromossomo 7, na qual se
esquematiza o tamanho e a marcação utilizada nos marcadores: D7S2453, D7S2459,
D7S692, D7S471, D7S643, D7S2486, D7S509, D7S684, D7S1824, D7S661.
Faixa de tamanho esperada dos produtos de PCR (pb)
Tabela 2. Ficha descritiva dos 10 iniciadores utilizados na análise de marcadores microssatélites.
Marcador Posição
(cM) Sequência Iniciadores (5´- 3´) Tamanho Gerado
(pb)
Tipo de
Microssatélite N° possível De Repetições
Banda Taxa
De Heterozigose Forward (right) /
Reverse (left)
D7S2453 116 GGTAACTGACCCTATGAACCA /
CTTGACCCCAGGAAGTG
167 – 183 2 16 7q22.3 0.68
D7S2459 119,8 TAGTAAAACCCATTTGAAG /
CAGAACTATTATTTAGGAG
165 – 175 2 10 7q22.3 0.77
D7S692 121,4 TGTAAACACTTTTGTAGAAGAACCT/
CTGATGATTGCTTATAGATATTCATC
161 – 171 2 10 7q31.1 0.71
D7S471 123 CAACATATGCAAGGTGCCTA /
AGCAGCTATTATGGAATTGC
181 – 199 2 18 7q31.1 0.77
D7S643 125,2 CAAGTTTTGGCCCTAGTCTT /
CTAATATTGCTGCCTTTTTCTG
122 – 136 2 14 7q31.31 0.75
D7S2486 127,8 AATACTGGNAAAGATAATACTGAAT /
TTCTCATGGAACAGCCTC
196 – 236 2 40 7q31.32 0.89
D7S509 143,3 TTCTTCTTGGGAAAAGATAC /
GATATTAGCACTATACACTG
154 – 176 2 22 7q33 0.73
D7S684 147,2 GATGTTGATGTAAGACTTTCCAGCC /
GCTTGCAGTGAGCCGAC
169 – 187 2 18 7q34 0.81
D7S1824 149,9 TGGGATAGAACAGAATAG /
GTTTGATTCAGTCAGTGG
70 – 118 4 48 7q34 0.85
D7S661 155,1 TGGAGCATGACCTTGGAA /
TTGGCTGGCCCAGAAC
3.5.2 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
A técnica de PCR permite que regiões selecionadas sejam amplificadas
milhões de vezes. Utilizou-se neste ensaio iniciadores específicos que flanqueiam os
marcadores polimórficos. As amplificações in vitro foram realizadas no termociclador
Eppendorf Mastercycler ep gradient S seguindo o programa descrito por Douglas et al. (2003), conforme tabela 3.
As temperaturas de anelamento (Tm, do inglês melting temperature) para cada
iniciador baseou-se na sugestão do fabricante e em testes preliminares com reações
em temperatura de anelamento gradiente. A análise da amplificação dos fragmentos
bem como sua qualidade foi verificada em duas etapas: primeira, gel de agarose 2%,
no qual será utilizado um marcador de peso molecular (ladder) de 100 pares de base (pb) como referência, na condição de corrida de 100 Volts por 30 minutos, contendo
0,5 μg/ml de brometo de etídeo. Os produtos de PCR no gel foram visualizados em
transluminador sob luz UV e fotografados em foto-documentador modelo Eagle-Eye® (Stratagene); uma vez verificado, em agarose, a amplificação dos fragmentos, a
segunda etapa, verificação da qualidade, foi realizada por eletroforese de capilar no
seqüenciador ABI Prism 3100 (Applied Biosystems).
Cada reação de PCR empregou aproximadamente: 20 ng do DNA genômico
por reação. O reagente da PCR foi preparado contendo 10 pmoles de cada primer
diluídos em tampão 5x (Tris-HCl 50,25mmol/l, pH 8,8; (NH4)2SO4 1M; MgCl2 2mmol/l;
BSA 127,5Pg/ml); 200Pmol/l dos nucleotídeos dATP, dCTP, dTTP; 150Pmol/l do
dGTP; 50Pmol/l do 7-deaza-2’dGTP, dimetilsulfoxido à 10% e 2,5U de Platinum£ Taq
DNA polimerase (Invitrogen) no volume final de 10Pl. Todos os iniciadores forward
foram marcados na extremidade 5’ com um dos fluoróforo 6-FAM ou HEX. Os
produtos de PCR foram sempre protegidos da luz, para evitar a degradação do
Tabela 3. Programa modelo para a amplificação dos fragmentos, Douglas, et al., (2003).
FASES Temperatura Tempo Ciclos
Desnaturação inicial 94°C 5 min.
Desnaturação 94°C 45 seg. 35
Anelamento* * 45 seg. 35
Extensão 72°C 45 seg. 35
Extensão Final 72°C 50 min.
* Temperatura de anelamento específica de cada marcador
Tabela 4. Marcadores microssatélites e suas respectivas temperaturas de anelamento.
Marcador Microssatélite Temperatura de Anelamento
D7S2453 52°C
D7S2459 40°C
D7S692 53°C
D7S471 53°C
D7S643 50°C
D7S2486 50°C
D7S509 45°C
D7S684 55°C
D7S1824 48°C
D7S661 54°C
3.5.3 Genotipagem dos microssatélites
A genotipagem dos microssatélites amplificados, seja durante a fase de
otimização, seja durante a genotipagem do conjunto de amostras, baseou-se na
realização de PCR, com iniciadores marcados com fluorescência, de acordo com a
metodologia sugerida por Kondo et al. (2000) e análise através de eletroforese capilar
no sequenciador automático - Sequenciador ABI Prism 3100 – 16 capilares (Applied Biosystem).
Para genotipagem, (com volume final de reação de 10 μl) foram adicionados 1
μl de produto de PCR, 0,5μl de GeneScanTM – 500 ROXTM Size Standard e 8,5μl de
desnaturação por 5 minutos a 95 °C e acondicionada em gelo até o momento das
análises.
Após eletroforese os arquivos com informações de cada uma das amostras
foram analisados utilizando os programas GeneScan®, e GeneMapper® v.4.0 (Applied Biosystems).
3.6 Procedimentos Analíticos
Para a análise dos dados dos 185 indivíduos utilizou-se os programas
SIMWALK 2 (Sobel & Lange, 1996; Sobel; Sengul; Weeks, 2001; Sobel; Papp; Lange,
2002), Genepop version 4.0.10 (Raymond M. & Rousset F, 1995; Rousset, F., 2008) e
POINTER (Lalouel et at., 1983).
3.6.1. Estimativas de freqüências alélicas e genotípicas
As freqüências alélicas e genotípicas dos microssatélites foram estimadas pelo
programa Genepop version 4.0.10 (Raymond M. & Rousset F, 1995; Rousset, F.,
2008) que calcula as frequências levando em conta a agregação familial. Este
programa também analisou a diversidade gênica, ou heterozigosidade, dos
marcadores estudados, e comparou estes dados com a do banco Marshfiled Genetic
Maps (grupo amostral de 520 indivíduos caucasianos).
3.6.2. Análise de segregação complexa
A análise complexa de segregação complexa permite identificar qual o melhor
modelo genético que explica a agregação familiar observada para um dado fenótipo.
Assim, procura-se saber se o mesmo ocorre devido a um ou mais genes principais ou
a inter-relação gene - ambiente. Uma vez havendo evidências genéticas, a partir deste
tipo de análise, pode-se partir em busca de genes relacionados à manifestação
de várias características influenciadas por um gene principal ou por um pequeno
número de genes (Feitosa & Krieger, 2002).
O modelo de análise de segregação utilizado no presente estudo, proposto por
Lalouel et al. (1983), assume de forma independente e aditiva todos os efeitos,
genéticos e ambientais, em particular as relações de parentesco familial, na
contribuição para os fenótipos em estudo.
Desta forma, as análises foram conduzidas com a utilização do programa
POINTER, baseado no modelo unificado de Lalouel et at. (1983), que incorpora as
frequências de transmissão de Elston & Stewart (1971) ao modelo misto de Morton &
MacLean (1974) e tem como objetivo averiguar a possível existência de um gene,
passível de condicionar o fenótipo em estudo.
3.6.3. Análise dos genótipos
A verificação da segregação ao longo das genealogias foi realizada a partir dos
genótipos obtidos de 10 marcadores microssatélites estudados, os quais foram
submetidos ao programa SIMWALK 2 (Sobel & Lange, 1996; Sobel, Sengul, Weekes,
2001; Sobel, et al., 2002). Baseando-se no algoritmo MCMC, este teste verifica a
integridade dos dados e das informações obtidas sobre os indivíduos, pré-requisito
para a posterior execução dos programas de análise de associação, uma vez que a
presença de inconsistências quanto à correta segregação inviabilizaria a próxima
etapa.
3.6.4 Análise de Ligação Não Paramétrica (NPL)
Utilizou-se o programa Simwalk2 para a análise de ligação não paramétrica,
este programa analisa 5 modelos. O primeiro é chamado de BLOCKS e mede a
contribuição de um alelo fundador nos afetados, levando em consideração o modelo
de herança recessiva. O segundo, MAX-TREE, analisa o maior número de afetado
estatística ENTROPY analisa a entropia dos alelos nas famílias afetadas. O quarto e
quinto modelos consideram a herança aditiva, sendo que o NPL_PAIR mede o
coeficiente de parentesco entre os afetados, e o NPL_ALL mede se alguns alelos
fundadores estão aumentados nos afetados. É considerado significativo os modelos
4. RESULTADOS
4.1 Grupo amostral
Este estudo contou com a participação de 31 famílias, todas elas com mais de
um gago na família além do probando. A figura 3 representa o heredograma destas
famílias, indicando os indivíduos afetados e os não afetados. De alguns indivíduos que
se encontram nos heredogramas, não foi possível a obtenção do material biológico e
consequentemente não foram genotipados, porém foi coletado informações de
familiares quanto ao acometimento de outros parentes gagos, e estes foram incluídos
nos heredogramas para outras análises.
Para genotipagem a pesquisa contou com 185 indivíduos dos quais 75
apresentavam gagueira persiste, 14 gagos recuperados (consangüíneos aos
probandos gagos) e 96 indivíduos fluentes. Em relação à diferença sexual a pesquisa
contou com a participação de 108 indivíduos do sexo masculino e 77 do feminino, com
prevalência sexual à gagueira persistente familial de 3,68 M : 1 F (70 M : 19F). Estes
dados referentes a distribuição sexual, acometimento da gagueira e origem dos
Tabela 5. Caracterização do grupo amostral. Origem Número de famílias Número de Indivíduos Distribuição
por sexo Diagnóstico fonoaudiológico
M F Fluentes
Gagos
Recuperados Gagos
M F M F M F
Noroeste do estado de
São Paulo 23 157 91 66 36 53 10 4 45 9
Região Metropolitana da
cidade de São Paulo e
Campinas
8 28 17 11 2 5 0 0 15 6
Total 31 185 108 77 38 58 10 4 60 15
* M=masculino e F=feminino
4.2 Genotipagem dos marcadores microssatélites
A distribuição alélica nas famílias está representada nos heredogramas na
figura 4. Os alelos são apresentados de cima para baixo na seguinte ordem: D7S2453,
D7S2459, D7S692, D7S471, D7S643, D7S2486, D7S509, D7S684, D7S1824,
D7S661. Em alguns heredogramas e marcadores houveram falhas, simbolizados por
4.3 Análise dos dados 4.3.1 Frequências Alélicas
Nesta análise observou-se o número de alelos encontrados em cada marcador
microssatélite, e as frequências dos marcadores microssatélites obtidas no programa
Genepop version 4.0.10 (Raymond M. & Rousset F, 1995; Rousset, F., 2008) são
apresentados na tabela 7. Para cada marcador são utilizadas duas linhas, a superior
com o número do alelo e a inferior com a freqüência observada. Além disso, são
apresentadas as regiões cromossômica em que se localiza cada marcador, bem como
sua posição em centiMorgans (cM). Observamos que dentre os 10 marcadores
microssatélites utilizados nas análises, o que se apresentou mais polimórfico
(dezessete alelos) foi o marcador D7S2486 enquanto que, os menos polimórficos,
foram o D7S1824 (um alelo), excluindo-os das análises de associação alélica e
Tabela 6. Frequência observada dos marcadores microssatélites.
Região Microssatélite UNISTS Posição (cM) Alelos/Frequência
7q22.3
D7S2453
116 1
0,0082 2 0,0272 3 0,0489 4 0,0326 5 0,0679 6 0,3804 7 0,2826 8 0,1060 9 0,0326 10 0,0054 11 0,0082 D7S2459
119,8 1
0,0055 2 0,0110 3 0,2280 4 0,0714 5 0,2253 6 0,2033 7 0,1731 8 0,0604 9 0,0192 20 0,0027 7q31.1 D7S692
121,4 1
0,0027 2 0,2908 3 0,1495 4 0,0978 5 0,4185 6 0,0408 D7S471
123 1
0,0082 2 0,0246 3 0,1366 4 0,2131 5 0,0929 6 0,0219 7 0,2650 8 0,1639 9 0,0437 10 0,0082 11 0,0219
7q31.31 D7S643 125,2 1
0,0055 2 0,3033 3 0,0464 4 0,0109 5 0,0191 6 0,0874 7 0,1311 8 0,2514 9 0,1011 10 0,0273 11 0,0082 12 0,0082
7q31.32 D7S2486 127,8
1 0,0249 2 0,0221 3 0,0331 4 0,0718 5 0,3066 6 0,2017 7 0,0608 8 0,0055 9 0,0193 10 0,0304 11 0,0166 12 0,0580 13 0,0580 14 0,0470 15 0,0276 16 0,0110 20 0,0055
7q33 D7S509 143,3 1
0,9973 2 0,0027
7q34
D7S684
147,2 1
0,0165 2 0,0027 3 0,0220 4 0,2363 5 0,0907 6 0,0110 7 0,0907 8 0,1126 9 0,1786 10 0,1758 11 0,0467 12 0,0165 D7S1824
149,9 1
1,0
7q35 D7S661 155,1 1
tabela 7.
Tabela 7: Distribuição dos marcadores microssatélites quanto à homozigose, heterozigose,
heterozigosidade observada e heterozigosidade (Marshfield Genetic Maps)
Microssatélite N Heterozigotos Observados Homozigotos Observados Heterozigosidade Observados
Heterozigose (Marshfiled
Genetics Maps)
D7S2453 184 142 42 0,7717 0.68
D7S2459 182 140 42 0,7692 0.77
D7S692 184 134 50 0,7282 0.71
D7S471 183 153 30 0,8360 0.77
D7S643 183 145 38 0,7923 0.75
D7S2486 181 96 85 0,5303 0.89
D7S509 184 1 183 0,0054 0.73
D7S684 182 154 28 0,8461 0.81
D7S1824 184 0 184 0,0 0.85
4.3.3 Análise de segregação complexa
Diversos modelos adotados não convergiram e desta forma foi então realizado
um mapeamento de superfície de verossimilhança máxima utilizando-se mais de
20.000 pontos iniciais, variando a dominância (d), deslocamento (t), frequência gênica
(p) e a herdabilidade multifatorial (H).
A figura 7 exemplifica a variação da medida de ajuste ao modelo (-2 ln L) com a
dominância (d) fixada em 1 e a frequência (q) fixada em 0,40. No eixo x está
representada a distância (t) e no eixo z está representada a herdabilidade (h). Nos
modelos aleatórios (d, t, q, H = 0) e sem gene principal (d, t, q = 0) não houve
convergência, impedindo o cálculo do coeficiente de verossimilhança máxima (tabela
13). O modelo sem a herdabilidade multifatorial (H = 0), entretanto, foi estimado.
Tabela 13: Análise de segregação de gagueira
Modelo d t q H -2 ln L AIC
1.Misto [1] [0,75] [0,4] [0,1] 251,72 251,72
2.Aleatório [0] [0] [0] [0] N.C. -
3.Sem gene principal [0] [0] [0] - N.C. -
4.Sem componente multifatorial [1] [1] [0,3] [0] 262,61 262,61
5.Recessivo (d=0) [0] [0,5] [0,6] [0,1] 260,12 260,12
6.Aditivo (d=0,5) [0,5] [2,25] [0,4] [0,1] 253,94 -
7.Dominante (d=1) [1] [0,75] [0,4] [0,1] 251,72 251,72
Parâmetros entre colchetes foram fixados no valor indicado.
V = variância; m = média: d = grau de dominância; t = deslocamento; q = frequência alélica; H = herdabilidade multifatorial; -2 ln L = menos duas vezes o logaritmo neperiano do likelihood.
$ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $
4.3.4. Análise dos genótipos
As amostras uma vez genotipadas também foram submetidas ao programa
SIMWALK 2. Das 1850 amostras de genotipagem inicialmente planejadas, foram
aplicadas nas análises 1779 amostras, tal diferença (71 amostras), deve-se tanto a
falhas na etapa de amplificação da PCR e análise dos fragmentos, quanto a erros de
genotipagem e de segregação. Além disso, dentre estas exclusões, um indivíduo foi
retirado do grupo amostral, por apresentar completa incompatibilidade genotípica.
Desta forma, a taxa de erro total estimada foi de 2,85. Os dados referentes à
genotipagem dos microssatélites estão apresentados na tabela 10.
Tabela 10. Distribuição do número de amostras e porcentagem de erro.
MARCADOR
NÚMERO DE AMOSTRAS
ERRO (%) Proposta para genotipagem Não genotipadas Genotipadas total Excluídas das análises Genotipadas e analisadas
D7S2453 185 1 184 4 180 2,17
D7S2459 185 3 182 4 178 2,19
D7S692 185 1 184 1 183 0,54
D7S471 185 2 183 4 179 2,18
D7S643 185 2 183 4 179 2,18
D7S2486 185 4 181 26 155 14,36
D7S509 185 1 184 2 182 1,09
D7S684 185 3 182 3 179 1,67
D7S1824 185 1 184 1 183 0,54
D7S661 185 1 184 3 181 1,63
4.3.5 Análise de Ligação não paramétrica
Na tabela 8 estão os resultados dos 5 modelos analisados pelo programa
SIMWALK 2. Todos estes modelos ficaram abaixo de 2,0.
Concomitantemente observou-se a recombinação dos marcadores e
concluiu-se que o aumento da freqüência de recombinação entre os marcadores analisados e a
gagueira não foi verificado, já que todos estes resultados ficaram dentro do esperado
(tabela 9).
Tabela 8. Segregação complexa realizada pelo programa Simwalk.
MARCADOR
Posição em cM (Haldene)
-LOG10 (p-Values)
BLOCKS
MAX-TREE ENTROPY NPL_PAIR NPL_ALL
D7S2453
0.0000 0.191 0.138 0.120 0.130 0.164
D7S2459
3.9522 0.197 0.229 0.138 0.166 0.195
D7S692
5.5783 0.204 0.206 0.139 0.161 0.182
D7S471
7.2045 0.209 0.210 0.142 0.163 0.180
D7S643
9.4543 0.253 0.217 0.172 0.185 0.194
D7S2486
12.1244 0.552 0.213 0.358 0.299 0.265
D7S509
30.6776 0.647 0.419 0.519 0.455 0.417
D7S684
34.7381 0.704 0.466 0.572 0.500 0.466
D7S661
Tabela 9. Recombinação dos marcadores microssatélites.
POSIÇÃO (Haldene Cm)
MARCADOR FRAÇÃO DE RECOMBINAÇÃO
OBSERVADO ESPERADO SIGNIFICÂNCIA
(P-Value)
0.000 D7S2453
0.03800 15.421 15.73 0.56747
3.952 D7S2459
0.01600 7.374 6.624 0.43598
5.578 D7S692
0.01600 8.996 6.624 0.22243
7.204 D7S471
0.02200 8.359 9.108 0.64537
9.454 D7S643
0.02600 14.331 10.76 0.16980
12.124 D7S2486
0.15500 68.504 64.17 0.29738
30.678 D7S509
0.03900 17.153 16.14 0.43363
34.738 D7S684
0.07900 36.154 32.70 0.28936
5. DISCUSSÃO
Nos últimos anos, publicações com estudos de genoma completo têm
demonstrado possíveis relações entre a gagueira e a genética uma vez que regiões
cromossômicas, principalmente nos cromossomos 1, 5, 7, 9, 12, 16, 18, 21 têm sido
apontadas. Em trabalhos realizados por Riaz et al., (2005) encontraram ligação no
cromossomo 1,5,7,12. Posteriormente Suresh et al., (2006), observaram indícios de
ligação sexo-específico no cromossomo 7 em indivíduos do sexo masculino. Desta
forma, pautando-se nestes e em outros trabalhos, no fato do gene SPCH1 estar
localizado na região 7q31, e ser o provável responsável pelo desenvolvimento da fala
e linguagem (Fisher et al., 1998; Lai et al., 2001) e por se tratar de um estudo pioneiro
no Brasil, e que está associado a variações genéticas e populacionais, demos
continuidade ás analises de modo a tentar confirmar ou não essa relação em nossa
população. Para isso estudamos em 31 famílias portadoras de gagueira persistente
familial as regiões 7q31 e 7q34 através de 10 marcadores microssatélites.
Dentre os marcadores estudados, apenas o marcador D7S1824 mostrou-se
não polimórfico (heterozigosidade=0.000), e assim foi excluído das análises. Os
marcadores D7S509 e D7S2486 também apresentaram heterozigosidade abaixo do
esperado com 0.0054 e 0.5303, respectivamente. Apesar da heterozigose baixa do
D7S2486, este foi o marcador que apresentou maior número de alelos, dezessete.
Tais resultados podem ser possivelmente atribuídos a diferenças genéticas entre a
população brasileira analisada e a população que serviu para a constituição do banco
de dados do Marshfiled Genetics Maps, famílias caucasianas apenas, o que nos
permite inferir que o fator miscigenação deva ser levado em conta na seleção dos
marcadores bem como durante o processo de análise.
Quanto à análise de segregação complexa dentre os modelos com gene
Porém as análises foram prejudicadas, provavelmente devido à forma de averiguação
adotada, na qual o probando e ao menos mais um membro da família, diagnosticado
como gago, são necessários para a inclusão da família no grupo amostral. A seleção
de uma população que já apresenta traços de herança genética para o distúrbio tornou
o grupo enviesado para as análises, comprometendo as análises de segregação
complexa e não permitindo inferir com precisão quanto aos modelos de herança
genética. Entretanto, quando os genótipos foram analisados pelo programa
SIMWALK2 durante a análise de ligação não paramétrica observou-se que nenhum
dos cinco modelos propostos indicou correlação significativa a nenhum modelo de
herança. Da mesma maneira não se encontrou indicativos de ligação dos marcadores
microssatélites com a gagueira, uma vez que os escores obtidos ficaram
significativamente abaixo do limiar adotado na análise de ligação não paramétrica
(p-Value > 2,0).
O diagnóstico e a terapia fonoaudiológica dos pacientes com gagueira foram
feitos em nosso estudo por profissionais da área especializados nessa afecção e
também pela triagem das famílias. Tal medida adotada visou reduzir possíveis erros
de diagnóstico uma vez que são capazes de definir critérios específicos, muitas vezes
pautados em normas internacionais e aplicá-los de forma criteriosa na seleção das
famílias. Este pode ser um fator pelo qual nosso estudo não demonstrou, a princípio,
ligação com a gagueira, uma vez que o padrão de critério de seleção adotado em
outros trabalhos pode ter sido distinto.
A história da população brasileira, constituída pela miscigenação de povos
africanos, ameríndios e europeus, pode ser apontado como outro motivo pela falta de
ligação das regiões 7q31 e 7q34 em famílias brasileiras, reforçando a possível
6. CONCLUSÃO
Os 9 marcadores microssatélites analisados (D7S2453, D7S2459, D7S692,
D7S471, D7S643, D7S2486, D7S509, D7S684, D7S661) nas regiões 7q31 e 7q34 não
apresentaram indicativos de ligação com a gagueira persistente familial. Ainda, para
se ter uma confirmação exata destes resultados aparentemente negativos, outras
análises ainda serão feitas na região 7q31 e 7q34.
Entender os efeitos de supostos genes da gagueira nas diferentes populações
e assim, auxiliar quanto à melhor compreensão dos componentes biológicos
envolvidos no mecanismo da fala, são aspectos que fazem parte de um processo que
envolve o planejamento do estudo, métodos de análise adequados e a interpretação
dos resultados. O potencial do estudo em relação ao tamanho do grupo amostral e a
possíveis erros nos genótipos pode estar relacionado à interpretação de resultados
negativos.
Assim, a busca por genes que levem ou predisponham á gagueira enfrenta
barreiras quanto à heterogeneidade genética desta condição, porém a busca por um
gene principal continuará, para que haja uma melhora no diagnóstico e possível
7.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Depto. de Genética - Inst. de Biociências - UNESP Tel. (14) 3811-6016 Fone/Fax (14) 3815-3131
Cx.P. 529 18618-000 Botucatu/SP E-Mail: sag@fmb.unesp.br
TERM O DE CONSENTIM ENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Nós estamos convidando vocês a participarem do projeto de pesquisa intitulado “Análise Molecular em Portadores de Gagueira Familial” do Serviço de Aconselhamento Genético (SAG) – UNESP - Botucatu cujo responsável é o Prof. Adj. Dr. Danilo Moretti-Ferreira e o responsável pela apresentação e obtenção deste termo é de responsabilidade da Profa. Dra. Cristiane Moço Canhetti de Oliveira e gostaríamos que vocês soubessem que:
- Participar deste projeto é uma opção de vocês, podendo decidir participar ou não;
- Caso vocês decidirem não participar ou desistirem de participar a qualquer momento vocês não perderão nenhum benefício ou tratamento que estiverem fazendo nesta instituição – Centro de Estudos da Educação e da Saúde (CEES – UNESP – Marília).
- A qualquer momento você terá a liberdade de buscar junto aos responsáveis pelo projeto, esclarecimentos de qualquer natureza, inclusive os relativos à metodologia de trabalho.
- Sua participação nesta pesquisa é total e completamente isenta de qualquer ônus financeiro. Caso você venha a ter qualquer despesa decorrente de sua participação nesta pesquisa, será imediatamente ressarcido, mediante a devolução dos valores despendidos.
- Você receberá uma cópia deste Termo de Consentimento Livre e Esclarecido.
- O presente trabalho tem por objetivos:
Diagnosticar indivíduos gagos e caracterizá-los por meio de avaliações realizadas pela equipe de fonoaudiólogas do CEES – UNESP - Marília.
A partir de um indivíduo considerado gago serão realizados estudos no sentido de analisar os fatores genéticos envolvidos com esse distúrbio.
