Avaliação da Densidade do Transportador Dopaminérgico utilizando [99MTc]-TRODAT-1 E SPECT em pacientes com movimentos periódicos das pernas após teste de esforço máximo

DANIEL ALVES CAVAGNOLLI

AVALIAÇÃO DA DENSIDADE DO TRANSPORTADOR DOPAMINÉRGICO UTILIZANDO [99MTc]-TRODAT-1 E SPECT EM PACIENTES COM MOVIMENTOS

PERIÓDICOS DAS PERNAS APÓS TESTE DE ESFORÇO MÁXIMO

São Paulo 2011

DANIEL ALVES CAVAGNOLLI

AVALIAÇÃO DA DENSIDADE DO TRANSPORTADOR DOPAMINÉRGICO UTILIZANDO [99M_{Tc]-TRODAT-1 E SPECT EM PACIENTES COM MOVIMENTOS}

PERIÓDICOS DAS PERNAS APÓS TESTE DE ESFORÇO MÁXIMO

ORIENTADOR:Prof. Dr. Marco Túlio De Mello CO-ORIENTADORA:Profa. Dra. Andrea Maculano Esteves

São Paulo 2011

DANIEL ALVES CAVAGNOLLI

Avaliação da Densidade do Transportador Dopaminérgico utilizando [99MTc]-TRODAT-1 E SPECT em pacientes com movimentos periódicos

das pernas após teste de esforço máximo

Presidente da Banca: Prof. Dr. Marco Túlio De Mello

BANCA EXAMINADORA

Prof. Dr. Benedito Sergio Denadai Prof. Dr. Florindo Stella

Prof. Dr. Roberto Frussa Fillho

Prof. Dr. Ronaldo Vagner Thomatieli Dos Santos

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PSICOBIOLOGIA

Chefe do Departamento: Profa. Dra. Maria Lucia Oliveira de Souza Formigoni

Dedicatória

Dedico essa dissertação a minha esposa Cacilda Bezerra Cavagnolli, pelo apoio, compreensão e paciência dispensados diariamente a mim nos momentos mais difíceis desta jornada. Momentos estes que sem este estímulo não seria possível o

término deste trabalho tão importante e desejado para minha carreira acadêmica.

Agradecimentos

O meu muito obrigado a todos os voluntários que participaram do projeto possibilitando a realização da pesquisa.

Ao meu orientador Prof. Dr. Marco Túlio de Mello pelo incentivo e por acreditar em meu potencial. MUITO OBRIGADO TÚLIO.

A minha co-orientadora Dra. Andrea Maculano Esteves, que esteve comigo em todos os momentos (BONS e RUINS) sempre estimulando e ao mesmo tempo puxando a orelha, rsrs!!

A todos os professores do Departamento de Psicobiologia, pela ajuda, paciência e incentivo.

Ao amigo Ernani que esteve comigo em todos os momentos da coleta, Muito obrigado TIUZÃO!!

Aos amigos irmãos Vladi e Amaury (Caju) pela paciência, confiança e tudo mais.

A todos os funcionários do CEPE, CEMSA, PSICOBIO e HOSPITAL SÃO PAULO.

A amiga Ilza e Marilia pela ajuda na medicina nuclear.

E a todos que não estão citados, mas que de alguma forma tiveram uma participação essencial para a realização desse trabalho.

SUMÁRIO

Dedicatória... VI Agradecimentos... VII Sumário... VIII Lista de figura... IX Lista de tabela... X Lista de abreviaturas e símbolos... XI Resumo... XIII

1. INTRODUÇÃO....……….. 01

2. REVISÃO DE LITERATURA...………...… 04

2.1 Sono...………...…… 05

2.2 Movimento Periódicos das Pernas e Síndrome das Pernas Inquietas... 10

2.3 Exercício Físico e Movimentos Periódicos das Pernas...……… 13

4. MATERIAL E MÉTODOS...…… 19

4.1 Procedimento ético...………...… 20

4.2 Descrição da amostra...… 20

4.3 Triagem...………...… 20

4.4 Delineamento experimental...………...… 21

4.5 Procedimento experimental... 22

4.6 Análise estatística... 27

5. RESULTADOS... 29

6. DISCUSSÃO... 35

7. CONCLUSÃO... 40

8. ANEXOS... 42

9. REFERÊNCIA BIBLIOGRAFICA...………...……… 76

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. EEG do estágio N1 do sono NREM... 06

Figura 2. EEG do estágio N2 do sono NREM... 07

Figura 3. EEG do estágio N3 do sono NREM ou SOL... 08

Figura 4. EEG do estágio REM do sono... 09

Figura 5. Desenho experimental... 22

Figura 6. Esteira ergométrica utilizada para realização do protocolo TEM... 24

Figura 7. Equipamento SPECT utilizado para a aquisição das imagens... 26

Figura 8. Kit TRODAT-1 para marcação do exame SPECT para obtenção das imagens... 26

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Análise descritiva da amostra... 30

Tabela 2. Dados polissonográficos basal e após teste de esforço máximo... 32 Tabela 3. Densidade do transportador dopaminérgico [99mTc] TRODAT-1 e

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

AFIP Associação Fundo de Incentivo a Pesquisa

CAU Caudado

CEPE Centro de Estudos em Psicobiologia e Exercício

CNEN Companhia Nacional de Energia Nuclear

COMT Catecol-O-metil-transferase

CRTL Controle

DA Dopamina

DAT Transportador de dopamina

ECG Eletrocardiograma

EEG Eletroencefalograma

EMG Eletromiografia

EOG Eletrooculograma

IPEN Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares

IRLSSG International Restless Legs Syndrome Study Group

MPP Movimento periódico das pernas

PET Photon Emission Tomography

PL Potencial de ligação

PSG Polissonografia

ROI Região de interesse

SNC Sistema nervoso central

SOL Sono de ondas lentas

SPECT Single Photon Emission Computer Tomography

SPI Síndrome das pernas inquietas

STR Estriado

TEM Teste de esforço máximo

TRODAT-1 Tropane dopamine transporter

RESUMO

Objetivo: O objetivo do presente estudo foi avaliar o perfil da densidade do transportador dopaminérgico utilizando SPECT em pacientes com Movimento Periódico das Pernas (MPP) e a influência do exercício físico agudo na concentração do DAT após um teste de esforço máximo (TEM). Métodos: Para isso 16 pacientes (8 grupo CTRL e 8 grupo Experimental) realizaram uma polissonografia (PSG) basal para a avaliação do padrão de sono e do índice do MPP. Após a PSG basal foi realizado o SPECT basal. Posteriormente os voluntários realizaram um TEM no período da manhã, após 2 horas, um novo exame de SPECT, e na mesma noite uma PSG para avaliar o efeito do exercício físico agudo no DAT e no padrão do sono. Resultados: Os resultados encontrados demonstraram que o grupo experimental apresentou valores menores no perfil da densidade do DAT no momento basal na região do estriado (p=0,03), foi demonstrado também uma redução do índice de MPP no grupo experimental (p=0,01) e um aumento da porcentagem do estagio 1 do sono NREM em ambos os grupos após o TEM (p=0,02). O estagio 2 do sono (p=0,02) e sono de ondas lentas (p=0,01) apresentaram diferenças entre os grupos no momento basal. Conclusão: Nossos resultados mostram que pacientes com MPP apresentaram uma menor densidade de DAT na região do putâmen esquerdo comparado ao grupo CTRL e uma sessão de exercício físico agudo (TEM) não alterou este perfil. Esses achados sugerem que alterações na densidade do DAT, talvez estejam relacionados a prática de exercício físico crônico.

1. INTRODUÇÃO

O Movimento Periódico das Pernas (MPP) e a Síndrome das Pernas Inquietas (SPI) são distúrbios do movimento relacionados ao sono. Estudos com neuroimagem como, por exemplo, tomografia por emissão de pósitrons (PET) e a tomografia por emissão de fóton único (SPECT) são consistentes para demonstrar a relação da disfunção dopaminérgica com a sua origem (1,2). É visto que a utilização de marcadores que avaliam a densidade do Transportador de Dopamina (DAT), como o TRODAT-1 tem se mostrado uma técnica bastante apropriada na investigação da neurotransmissão dopaminérgica em seres humanos (3).

Steatd e colaboradores (1993) (4) demonstraram por meio de SPET, que pacientes com a SPI-MPP apresentaram menor densidade do receptor dopaminérgico D2 quando comparados ao grupo controle.

Ao analisar as formas de tratamento da SPI-MPP, estudos apontam os agonistas dopaminérgicos como primeira opção farmacológica para a melhora dos sintomas da SPI-MPP, visto que os antagonistas dopaminérgicos geralmente os exarcebam os sintomas (5-7). Entretanto, estudos vêm demonstrando que tanto o exercício físico agudo quanto o exercício físico crônico também promovem melhorias nos sintomas da SPI-MPP além da melhora na qualidade de vida dessa população (8-11). No entanto, ainda é pouco explorado em estudos o mecanismo de ação de como o exercício físico influencia no sistema dopaminérgico.

2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1 Sono

O sono é um estado funcional, cíclico e reversível, constituído por uma complexa combinação de processos fisiológicos, que envolvem parâmetros biológicos e modificação da atividade cerebral, além de processos comportamentais como uma imobilidade relativa e o aumento do limiar de respostas aos estímulos externos (12).

Os primeiros registros das descargas elétricas espontâneas observadas no seres humanos foram realizados por Hans Berger, 1929, por meio do eletroencefalograma (EEG) (13). Em 1937, Loomis e colaboradores descobriram que o sono é composto por uma série de estágios nos seres humanos que ocorrem de forma recorrentes e cíclica, esclarecendo parcialmente o estagiamento do sono. Esses estágios foram denominados de estágios 1, 2, 3 e 4 (14).

Com o transcorrer dos anos os autores Aserinski e Kleitman (1953) relataram a existência de uma fase do sono onde ocorriam os movimentos rápidos dos olhos, sendo denominado por Sono REM (Rapid Eye Movements) (15) e com isto, determinaram um marco histórico na Medicina e Biologia do Sono.

Para a verificação de cada estágio do sono, segundo o novo manual, durante a vigília predomina no EEG o ritmo alfa, com uma atividade elétrica cerebral em frequência de 8 a 13 ciclos por segundo. No Eletrooculograma (EOG) observa-se a presença de movimentos oculares rápidos e no Eletromiograma (EMG) se observa o tônus muscular (17)_.

No estágio N1 do sono NREM, observa-se no EEG o ritmo alfa com baixa amplitude e freqüência mista estando presente em menos de 50% da época. É característica desse estágio o surgimento de uma ou mais ondas do vertex, que são ondas com projeção nas regiões centrais, com duração de 50 a 20 milissegundos e com amplitude maior que 250 microvolts (18), acompanhado da ausência de fusos do sono e/ou complexos K bem definidos. No EOG se observa a presença de movimentos oculares lentos. No EMG se observa tônus muscular menor do que na vigília (Figura1).

No estágio N2 do sono NREM, observa-se no EEG a presença de um ou mais fusos do sono, que têm sua origem no tálamo e são descritos como disparos neuronais súbitos com duração de 0,5 a 1,5 segundos, com uma freqüência (12 a 14 Hz) que aumentam e diminuem em amplitude para produzir uma característica de fuso (20,21). Já o complexo K é uma onda com um componete negativo de alta amplitude seguido imediatamente por um componente positivo mais lento, algumas vezes está relacionado a estímulos auditivos, mas também pode ocorrer espontaneamente. Pode ter a presença de ondas delta com mais de 75 PV, estando presente em no máximo 20% da época e fazendo a transição de um estágio para o outro. No EOG se observa ausência de movimentos oculares rápidos e no EMG se observa tônus muscular menor do que na vigília (Figura 2)

No estágio N3 do sono NREM ou sono de ondas lentas (SOL) observa-se no EEG a presença de ondas delta com mais de 75 PV medido do valor mais baixo ao mais alto da onda, aparecendo em mais de 50% da época. No EOG se observa ausência de movimentos oculares e no EMG se observa tônus muscular menor do que na vigília (Figura 3).

No Sono REM, observa-se no EEG uma dessincronização (semelhante ao estágio N1 do sono NREM, sem presença de ondas do vértex), com uma freqüência mista e de baixa voltagem, podendo apresentar ondas em dente de serra com freqüência entre 2 e 6Hz e com maior amplitude nas regiões centrais (18). Uma característica importante do sono REM é a presença dos movimentos oculares rápidos e a atonia muscular, onde a atividade muscular atinge os níveis mais baixos durante o sono REM, podendo apresentar alguns abalos musculares esporádicos. Normalmente, o sono REM constitui aproximadamente 20 a 25 % do tempo total de sono (TTS) nos indivíduos adultos e saudáveis (Figura 4).

Cada ciclo de sono NREM-REM possui duração entre 90 e 110 minutos e ocorre de 4 a 6 vezes por noite, onde os estágios do sono NREM tendem a predominar na primeira metade da noite, enquanto o sono REM predomina na sua metade final (16).

Existem diversos fatores que podem interferir na arquitetura do sono, dentro os quais os distúrbios do sono. Como todas as patologias, os distúrbios podem ser agrupados de acordo com o esquema que relacione entre si certas características ou sintomas similares.

2.2 Disturbios do movimento do sono: Movimento Periódico das Pernas (MPP) e Síndrome das Pernas Inquietas (SPI)

Na classificação dos distúrbios do sono de 2005 foi definido que a Síndrome das Pernas Inquietas (SPI) e o Movimento Periódico das Pernas (MPP) estariam inseridos junto ao grupo de Distúrbios do Movimento relacionados ao Sono (22)_.

Sabe-se que a SPI e o MPP são patologias com características distintas e a descrição do MPP foi realizada em função da SPI. No entanto, pelo fato da origem destes distúrbios ainda não estar totalmente esclarecida, as formas de abordagem terapêutica, na maioria das vezes, são apresentadas de forma concomitante (23,24).

A presença do distúrbio SPI e o MPP têm demonstrado uma redução na qualidade de vida do paciente devido a uma diminuição da qualidade e eficiência do sono acompanhado de uma sonolência diurna (25).

Já o MPP se caracteriza por uma extensão rítmica dos membros inferiores, seguidos de uma dorsoflexão do tornozelo, ocasionando uma flexão dos joelhos e uma ativação motora generalizada nos membros inferiores. Os movimentos duram em média de 0,5-5 segundos e ocorrem com uma freqüência de um a cada 20-40 segundos, sendo que cada episódio do MPP pode durar de alguns minutos a horas (26)_.

Os estudos polissonográficos demonstram a existência do MPP em cerca de 70 a 90% dos pacientes com a SPI. No entanto, a estimativa é de que 30% dos pacientes com o MPP apresentem a SPI (27).

O MPP pode ser observado em três graus de gravidade (24):

• Leve, quando ocorrem de 5 a 24 movimento (mov)/hora (h), resultando em sonolência durante o dia;

• Moderado, quando ocorrem de 25 a 49 mov/h, resultando em insônia e sonolência moderada a grave;

• Grave, quando ocorrem mais de 50 mov/h com 25 despertares por hora, ocasionando sonolência e insônia graves.

catecol-O-metil-transferase (COMT) (29). Dessa maneira, o DAT é um regulador dos níveis de DA disponíveis na fenda sináptica (30) e suas concentrações refletem o tônus homeostático do sistema dopaminérgico (30,31).

Existe na literatura controvérsia a respeito da relação DAT e MPP em estudos realizados com imagem (SPECT, SPET, PET). Isto se deve às diferenças metodológicas durante a realização do exame em relação à aquisição da imagem.

Alguns estudos realizados com SPECT, usando traçadores que se ligam ao receptor dopaminérgico D2, demonstraram uma redução do receptor D2 no estriado, nos pacientes que apresentavam a SPI-MPP (4, 32, 33).

Connor e colaboradores (2009) (34) encontraram uma correlação inversa entre a gravidade dos sintodas da SPI e receptor D2 em amostras de autopsias, demonstrando que quanto maior a gravidade da SPI menor a quantidade de receptor D2.

Earley e colaboradores (2011) (35) _{investigaram pacientes com SPI utilizando}

PET. O exame foi realizado em diferentes horários do dia (pela manhã às 08:30 hs e pela noite às 19:30 hs) em grupos distintos, onde a pergunta principal do estudo foi a avaliação do potencial de ligação do DAT no estriado. Os resultados demonstraram uma redução significativa do DAT no estriado em pacientes com SPI, tanto no período da manhã quanto da noite, visto que a expressão do DAT foi reduzida nas áreas do putamen e caudado.

empregado nas pesquisas. Michaud e colaboradores (2002) (33) investigaram o distúrbio do sono SPI-MPP com [123I]B-CIT- SPECT e não encontraram diferenças significativas no potencial de ligação do DAT entre os grupos. Esse resultado talvez tenha occorrido, uma vez que o [123I]B-CIT é também um marcador do transportador serotoninérgico, não apresentando características tão seletivas para o DAT.

No entanto, a utilização de marcadores que avaliam a densidade do DAT, como o TRODAT-1 tem se mostrado uma técnica bastante apropriada na investigação da neurotransmissão dopaminérgica em seres humanos (3).

O TRODAT-1 é um derivado tropano que quando marcado com Tecnécio99 metaestável (99mTc) cruza a barreira hematoencefálica, onde possui elevada afinidade pelo DAT. Ele é captado pela cintilografia em modo SPECT, produzindo imagem sítio específica do DAT (38).

O radiofármaco TRODAT-1 já é aplicado como uso clínico em diversos países. O produto já foi aprovado pela U.S. Food & Drug Administration - FDA (IND# 56,623) dos Estados Unidos da América para pesquisa e não há relato de reações adversas ou efeitos colaterais relativo ao uso do traçador.

2.3 Exercício Físico, Síndrome das Pernas Inquietas e Movimentos Periódicos das Pernas

O exercício físico é caracterizdo por uma seqüência de movimentos realizados pela musculatura estriada esquelética de forma planejada, estruturada, com intenção, mantendo ou melhorando um ou mais componentes físicos, e sob supervisão de um profissional qualificado (39, 40).

e os aspectos psicobiológicos como: o sono, os transtornos de humor e a memória (41), dentre os quais o sono merece um lugar de destaque. Apesar da função do sono não estar totalmente elucidada pela ciência, o exercício físico parece promover melhoras na qualidade do sono, e acredita-se que essa relação pode ser o reflexo de mecanismos fisiológicos baseados em três hipóteses: da conservação de energia, da restauração corporal e da função termorregulatória (42).

A teoria termorregulatória se deve pelo aumento acentuado da temperatura corporal central antes do horário de dormir ativando os mecanismos de perda de calor, que por sua vez estão relacionados à indução do sono (42). O exercício físico pode ser considerado um dos fatores que proporcionam aumentos na temperatura corporal ativando dessa maneira esses mecanismos termorregulatórios (42). Já as teorias da restauração corporal e conservação de energia, predizem que o sono, por reduzir o requerimento metabólico, pode ter a função de conservação de energia e/ou restauração tecidual. A duração do sono e a quantidade de SOL podem aumentar em função do aumento da energia despendida e das micro-lesões teciduais ocorridas durante o dia. As contrações musculares exigidas no exercício físico são estímulos capazes de promover depleção dos estoques de energia e micro-lesões, ou seja, uma alta atividade catabólica durante a vigília pode favorecer a atividade anabólica durante o sono, em especial, durante o SOL onde ocorre a maior liberação de hormônio do crescimento (GH) durante as 24 horas de um dia (42).

A influência do exercício físico na melhora dos sintomas da SPI-MPP também tem sido objeto de investigações clínicas no tratamento não farmacológico dessa patologia (8 -11,43).

entre exercício físico e sono (46-48), no qual o exercício físico é considerado pela American Sleep Disorders Association (1991) uma intervenção não farmacológica para a melhora da qualidade do sono (49).

Nas últimas décadas, uma grande variedade de estudos envolvendo diferentes tipos de populações e o exercício físico aeróbio foi realizado na tentativa de avaliar os efeitos desse tipo de intervenção na quantidade e qualidade do sono (50-60). Entretanto, ainda não existe um consenso na literatura sobre quais os efeitos do exercício físico nos parâmetros do sono (42, 45, 60).

Em alguns estudos os principais resultados são a melhora na percepção subjetiva do sono de idosos (54), aumento do Tempo Total de Sono (TTS) (55), diminuição da latência de sono (57), aumento da latência para o início do sono REM (55,57)_{, aumento do SOL} (50, 52,57) _{e diminuição no sono REM} (53,57)_.

De Mello e colaboradores (1996, 2002, 2004) ( 8-10) _{avaliaram por meio da PSG,} que em pacientes com lesão medular, o exercício físico agudo (teste de esforço máximo) e o exercício crônico (treinamento por 44 dias no limiar ventilatório 1) reduziram significativamente o MPP durante o sono. O efeito do exercício físico não foi significativamente diferente dos resultados obtidos quando tratados com L-Dopa, que é o tratamento preconizado para a SPI-MPP. Esses estudos demonstraram que, para os pacientes paraplégicos, o exercício físico pode ser visto como um tratamento não farmacológico para o distúrbio do sono MPP, e somente nos casos que não respondem a essa primeira abordagem (exercício físico), empregar o tratamento farmacológico.

foram submetidos a exercícios aeróbios e a musculação com freqüência de 3 vezes por semana. Para analisar a variável SPI aplicou-se o questionário “International RLS

Study Group Scale” (IRLSSG) (62), o qual avalia os sintomas da gravidade, da

freqüência e do impacto da SPI na qualidade de vida. O questionário foi aplicado no início e após 3, 6, 9 e 12 semanas de treinamento. Os resultados demonstraram que a partir da 6ª semana os sintomas da SPI apresentaram uma redução significativa em relação ao grupo controle, não havendo diferença significativa da 6ª em relação a 12ª semana. Os autores concluíram que o programa de exercício combinado foi efetivo na melhora dos sintomas da SPI, sendo necessários futuros estudos demonstrando a diferença entre os tipos de exercício físico, para que melhor se compreenda a influência de cada um destes na SPI.

3. OBJETIVO

4. MATERIAS E MÉTODOS

4.1 Procedimento ético:

O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de São Paulo/ Hospital São Paulo (0546/08). Após os esclarecimentos necessários para participação deste estudo e antes de iniciar o protocolo experimental, todos os voluntários assinaram um Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Anexo 2), concordando em participar da presente pesquisa.

4.2 Descrição da amostra

Foram selecionados para a amostra 16 pacientes adultos homens, sedentários com idade média de 50,25 ± 5,43 anos. Para inclusão no estudo os voluntários não deveriam apresentar anormalidades nos exames laboratoriais, clínico e no eletrocardiograma de repouso e esforço que contra-indicassem a prática do exercício físico. O estudo foi conduzido no Centro de Estudos em Psicobiologia e Exercício (CEPE) e no Instituto do Sono.

Após a triagem os voluntários foram distribuídos em 2 grupos:

Grupo Experimental: pacientes que apresentaram Movimento Periódico das Pernas (MPP) com um índice >5/hora (24).

Grupo Controle (CTRL): pacientes sem distúrbios de sono.

4.3 Triagem

Exames Laboratoriais: Os exames laboratoriais são parte integrante da avaliação médica necessária à verificação da existência de patologias nos pacientes para quem a realização de exercícios físicos seria contra-indicado, permitindo também tornar homogênea a amostra do estudo. Os exames realizados foram: hemograma; colesterol HDL, LDL, e VLDL; ferritina; ferro sérico; transferrina; triglicérides; TSH; T4 livre; glicemia em jejum; ácido úrico e urina. Todos eles foram realizados no laboratório da Associação Fundo de Incentivo a Pesquisa (AFIP) e os resultados avaliados pelo médico integrado à equipe do Instituto do Sono / CEPE.

Eletrocardiograma de Repouso e Esforço: A eletrocardiografia é um instrumento diagnóstico vital para evidenciar as anormalidades na função cardíaca, especialmente aquelas relacionadas ao ritmo cardíaco, à condução elétrica, ao fornecimento do oxigênio para o miocárdio e a um possível dano tecidual real. O objetivo do eletrocardiograma (ECG) de esforço é o de determinar as respostas fisiológicas do estresse físico controlado, cujas aplicações clínicas incluem o diagnóstico das doenças cardiovasculares, apesar da ocorrência de eventos cardíacos fatais e não-fatais associados ao exercício físico ser baixa numa população supostamente saudável (63). Os exames foram realizados nas dependências do CEPE.

4.4 Delineamento experimental

Desenho experimental

Figura 5: Cronograma de avaliação: Avaliação basal: ECG de repouso e esforço, PSG, análise sanguínea e SPECT. Avaliação Aguda: Teste de Esforço Máximo (TEM), SPECT efeito agudo do exercício físico aeróbio (TEM), PSG efeito agudo do exercício físico aeróbio (TEM) no sono.

4.5 Procedimento Experimental

Polissonografia: O estudo polissonográfico foi realizado nas normas padronizadas por Ilber e colaboradores (2007) (17). Para o registro do sono foi utilizado o equipamento polissonográfico EMBLA S7000®. A PSG consistiu de registros simultâneos de 4 canais para o EEG, 2 para o EOG, 2 para o EMG, 1 para o fluxo aéreo nasal, 2 para os movimentos tóraco-abdominais, 1 para o ECG, 1 para o registro do som traqueal, 1 para a oximetria de pulso e 1 para o registro da posição corpórea. O EEG foi obtido pela colocação dos eletrodos nas posições F3/M2, F4/M1, C3/M2, C4/M1, 01/M2, 02/M1, de acordo com o sistema internacional 10-20 de alocação de eletrodos (64). O EOG foi obtido pela colocação dos eletrodos que permitiram a medida da voltagem entre a parte anterior e a posterior do globo ocular, sendo o mesmo realizado a partir de duas derivações, uma no canto ocular externo direito com referência para a orelha contralateral (ROC/A1) e outra no esquerdo também para a orelha contralateral (LOC/A2). As variáveis respiratórias foram monitorizadas por cintas para a avaliação do esforço respiratório do tórax, na altura da linha intermamilar e do abdomen, na altura do epigástrio. Uma cânula para registro do fluxo aéreo nasal foi colocada nas saídas dos Avaliação Basal:

ECG, PSG Análise sanguínea

PSG - AGUDA SPECT - AGUDO

orifícios nasais e conectada a um transdutor de pressão (PTAF-Protech). O sensor de dedo para a oximetria foi colocado sobre a face dorsal e palmar de uma das falanges distais. O registro do tônus muscular pelo EMG foi feito pela colocação de dois eletrodos nas regiões mentoniana/submentoniana. Para a avaliação dos movimentos das pernas foi colocado, em ambas, um eletrodo sobre o músculo tibial anterior. Os microdespertares foram identificados de acordo com os critérios estabelecidos pela Força Tarefa da American Sleep Disorders Association (65). Os eventos respiratórios sono-relacionados foram avaliados de acordo com os critérios estabelecidos pela Força Tarefa da American Academy of Sleep Medicine (66). Os MPP foram mensurados de acordo com os critérios estabelecidos pelo relatório da Força Tarefa “International Restless Legs Syndrome Study Group” (IRLSSG) (67).

Figura 6: Esteira ergométrica (Lifefitness® 9700HR) utilizada para realização do protocolo TEM.

obtidas foram transferidas para um programa Xeleris (estação de trabalho para processamento das imagens).

A metodologia de marcação e o controle de qualidade do TRODAT-1 foram estabelecidos no Centro de Radiofarmácia do IPEN-CNEN/SP - Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares (IPEN), autarquia estadual associada à Universidade de São Paulo (USP) gerenciada pela Companhia Nacional de Energia Nuclear (CNEN).

A reação de marcação foi iniciada com a adição de 1-2 mL de 99mTcO4 recém-eluído (inferior ao tempo de 2 horas a partir da eluição do gerador 99Mo/99mTc), sempre com a atividade total entre 65-68 mCi. Após a adição do 99mTcO4 o frasco foi levemente agitado e alocado no banho para aquecimento à 100 C, durante 30 minutos. Terminado o período de reação, o frasco foi retirado do banho e alocado no castelo de chumbo. Ao atingir a temperatura ambiente, foi realizado o controle de qualidade.

O método de avaliação da pureza radioquímica descrito na bula do kit [99m_Tc] TRODAT-1 (Figura 8) foi o daCromatografia Líquida de Alta Eficiência, que informa que o mesmo deve apresentar um rendimento superior a 90%. No entanto, o método utilizado nas dependências da Medicina Nuclear do HSP_ UNIFESP, é o método de coeficiente de partição, que considera as fases orgânicas e aquosas, utilizando em partes iguais: acetato de etila e hexano (1:1) e bicarbonato de sódio saturado.

Figura 7: Equipamento SPECT utilizado para a aquisição das imagens

Figura 8: Kit TRODAT-1 para marcação do exame SPECT para obtenção das imagens

cortes transaxiais, coronais e sagitais foram adquiridas através de imagens com matriz de aquisição de 128 x 128. Os algoritmos de correção de atenuação tendem a homologar a concentração nos núcleos basais à concentração no córtex cerebral (69). A correção de atenuação foi feita através de imagens de tomografia computadorizada obtidas na câmara de SPECT.

A avaliação dos estudos SPECT com [99mTc]-TRODAT-1 consiste em inspeção visual e semiquantitativa. Antes de iniciar as analises as mesmas foram randomizadas para que não houvesse tendência para com os grupos. Foram considerados os cortes transaxiais do corpo estriado (STR) caudado (CAU) putamen (PUT) e do occipital (OCC), com espessura de corte de 2,05mm. Para avaliação quantitativa dos DAT foi calculado o potencial de ligação (PL), utilizando as regiões de interesse (ROI). O PL foi calculado pela formula PL= [STR ou CAU ou PUT - OCC]/OCC (70,71). O STR representa a concentração de traçador no estriado, CAU representa a concentração de traçador no caudado, PUT representa a concentração de traçador no putâmen (regiões onde se concentram o maior número os neurônios dopaminérgicos), e OCC corresponde à concentração de traçador no occipital (região de referência sem ligação especifica de neurônios dopaminérgicos).

4.6 Análise estatística

A analise estatística foi realizada pelo programa Statistica® for Windows® versão 7.0. Inicialmente foi realizado o teste Shapiro-Wilk´s W test para verificação da curva de normalidade e após foi realizada uma análise descritiva dos dados. Posteriormente foi realizando Teste T para amostras independentes (idade, massa corporal, estatura, índice de massa corpórea, VO2Pico, ventilação máxima e freqüência cardíaca

grupo e interação para variáveis polissonográficas e dopaminérgicas. O nível de significância adotado em todas as análises foi de pd0,05.

5. RESULTADOS

Na tabela 1 estão apresentados os dados referentes à análise descritiva da amostra para idade, massa corporal, estatura e índice de massa corpórea e parâmetros

fisiológicas como VO2Pico, ventilação máxima e freqüência cardíaca máxima, considerando os grupos CTRL e experimental. Não foram encontradas diferenças estaticamente significantes entre os grupos CRTL e Experimental.

Tabela 1. Análise descritiva da amostra

Test t para amostras independentes. Grupos (CTRL X Experimental). Dados expressos em media desvio-padrão. O nível de significância adotados em todas as análises foi de p 0,05. Entre parênteses está expresso o número de voluntários para cada grupo.

VARIÁVEIS GRUPO

CTRL (n=08) Experimental (n=08)

Idade (anos) 47,75±5,23 52,75±4,65

Massa Corporal (kg) 78,25±6,69 78,75±11,74

Estatura (m) 1,72±0,05 1,73±0,06

IMC (kg/m2) 26,32±1,72 25,99±2,86

2 O

V Pico (ml/kg/min-1) _{39,20±7,31 35,66±5,44}

Ventilação Máxima (L/min-1) 116,97±19,16 111,10±11,37

Nos dados polissonográficos das duas noites de sono (Basal e após TEM) foi encontrada diferença no tempo para estagio 1 do sono (F(1,14)=6,3418, p=0,02) após o TEM, apresentando um aumento significativo na sua porcentagem.

Foi demonstrado também diferenças significativas para o estagio 2 do sono (F(1, 14)=6,8534, p=0,02) e SOL (F(1, 14)=10,786, p=0,01) em relação aos grupos CRTL e Experimental no período basal. O grupo CRTL apresentou valores maiores para SOL nos dois momentos em relação ao grupo experimental. Já o estágio 2 foi maior nos dois momentos no grupo experimental em relação ao CRTL.

A variável MPP do grupo experimental apresentou índices maiores em relação ao grupo CRTL tanto no momento basal como após o TEM. Dessa forma foram encontradas diferenças estatisticamente significante no grupo experimental em relação ao grupo (F(1, 14)=13,485, p=0,01), tempo (F(1, 14)=9,5857, p=0,01) e interação (F(1, 14)=8,7854, p=0,01). No entanto houve uma redução significativa no índice de MPP (30,66± 17,41 PLM/h para 20,33 ± 22,13 PLM/h) no grupo experimental após o TEM.

Tabela 2. Dados polissonográficos basal e após teste de esforço máximo

BASAL APÓS TEM ANOVA F (1, 14)

DADOS POLISSONOGRÁFICOS CTRL (n=08) Experimental (n=08) CTRL (n=08) Experimental (n=08) P GRUPO P TEMPO P INTERAÇÃO

Tempo total de sono (min) 351,75±35,72 333,50±37,85 341,43±48,02 345,33±37,94 0,59 0,96 0,47

Eficiência do sono (%) 85,88±5,31 79,21±10,42 85,03±8,45 82,78±6,81 0,13 0,63 0,44

Latência para o sono (min) 6,97±5,58 17,43±19,80 11,57±11,22 14,87±9,10 0,21 0,76 0,29

Latência para o sono REM (min) 114,50±43,09 93,56±41,64 96±46,49 68,77±28,13 0,12 0,14 0,82

Estágio 1 (%) 4,55±1,74a 5,22±1,95c 6,05±2,34b 7,61±2,80d 0,19 0,02* 0,57

Estágio 2 (%) 47,65±5,59e 53,70±10,06f 47,53±7,68 54,05±7,29 0,02* 0,96 0,94

Sono de ondas lentas (%) 26,72±5,95e 20,52±8,03f 25,50±8,77 17,31±5,45 0,01* 0,47 0,74

REM (%) 21,72±3,24 20,52±4,48 21,32±5,73 21,03±2,68 0,61 0,97 0,76

MPP (Índice /hora) 0,51±0,71ae 30,66±17,41cf 0,28±0,58bde 20,33±22,13bdf 0,01* 0,01* 0,01*

O potencial de ligação da densidade do transportador dopaminérgico utilizando [99mTc]-TRODAT-1 apresentou uma diferença significativa entre o grupo CRTL e grupo experimental na região do putamen esquerdo (F(1, 14)=5,7869, p=0,03), visto que o grupo CRTL apresentou maiores valores em relação ao grupo experimental no momento basal. Para as outras variáveis dopaminérgicas não foram encontradas diferenças significativas (figura 9, tabela 3). Não foram encontradas diferenças significantes entre os grupos após a realização do TEM.

Imagem obtida com o exame de SPECT utilizando o marcador [99mTc]-TRODAT-1

Tabela 3. Densidade de Transportador Dopaminérgico [99mTc]-TRODAT-1e SPECT

Dados expressos em media ± desvio- padrão. O nível de significância adotados em todas as análises foi de p 0,05.

ANOVA, seguido de post-hoc Bonferroni. Legenda: Comparação para o fator grupo (e-f).

BASAL APÓS TEM ANOVA F (1, 14)

Densidade de transportador de dopamina

CTRL Experimental CTRL Experimental P grupo

P tempo

P interação

Estriado Direito 1,30±0,23 1,26±0,47 1,28±0,29 1,09±0,11 0,37 0,35 0,43

Caudado Direito 1,76±0,31 1,58±0,58 1,74±0,39 1,40±0,24 0,14 0,38 0,46

Putamen Direito 1,43±0,24 1,28±0,58 1,16±0,31 1,04±0,25 0,25 0,12 0,92

Estriado Esquerdo 1,32±0,16 1,27±0,42 1,35±0,24 1,15±0,20 0,24 0,64 0,42

Caudado Esquerdo 1,77±0,28 1,64±0,66 1,83±0,28 1,57±0,18 0,22 0,96 0,62

6. DISCUSSÃO

No presente estudo avaliamos o perfil do DAT por intermédio do marcador TRODAT em pacientes com MPP e também qual a influencia do exercício físico (TEM) na densidade desse transportador. Os resultados encontrados demonstraram que o grupo experimental apresentou valores menores no potencial de ligação da densidade do DAT no momento basal na região do putamen esquerdo comparado ao grupo CRTL.

Os nossos resultados confirmam a hipótese de que pacientes com SPI/MPP apresentam uma disfunção do sistema central dopaminérgico.

Alguns estudos realizados com SPECT, utilizando traçadores que se ligam ao receptor dopaminérgico D2, demonstraram uma diminuição do receptor D2 no estriado, nos pacientes que apresentavam a SPI-MPP (4,33). Chiu e colaboradores (2010) (72)

relatam que indivíduos saudáveis, porém, maus dormidores apresentam uma menor

disponibilidade DAT pré-sináptica na região do caudado, porém em nossos resultados

encontramos uma menor disponibilidade de DAT somente na região do putamen

esquerdo no grupo experimental. Nossos dados sugerem que os pacientes com

SPI-MPP tem uma perda das concentrações de DAT na região do putamen, que parece ser

especifica desta fisiopatologia, uma vez que Chiu e colaboradores (2010) (72) em seu

estudo utilizaram maus dormidores sem relato de distubios do sono.

Especula-se que, essa alteração no sistema dopaminérgico nesses pacientes

com SPI-MPP se deva ao aumento de DA. O aumento na dopamina endógena geraria um possível aumento de DA na fenda sináptica diminuindo assim a densidade do

transportador de DA (33). Outra disfunção fisiológica que poderiam levar a um aumento da concentração de DA na fenda sináptica seria uma diminuição da atividade de monoamina oxidase e/ou de catecol-O-metiltransferase, que são enzimas responsáveis por degradar a DA (33).

E qual seria a influência do exercício físico na densidade do transportador de DA e no padrão de sono de pacientes com SPI-MPP?

Nossa hipótese inicial seria que o exercício físico (TEM) estaria tentando

modular a densidade do transportador dopaminérgico. No entanto nossos resultados

demonstraram uma diferença na densidade do DAT entre os grupos no momento

somente uma sessão de exercício físico não foi suficiente para que essas alterações no

SNC se perpetuassem, sugerindo assim, que esse efeito talvez seja exercício crônico

dependente.

Em concordância com os dados obtidos neste estudo em relação à redução do MPP após o TEM, trabalhos realizados por nosso grupo, já vem demonstrando que a prática do exercício físico aeróbio reduz o índice de MPP em diferentes populações (8,11)_{. De Mello e colaboradores (1996)} (8)_{, observaram, por meio da PSG, que, nos}

individuos com lesão medular, o exercício físico agudo reduziu significantemente o índice de MPP durante o sono. Esses efeitos não foram diferentes dos produzidos pelo tratamento farmacológico (L-dopa) ao comparar as duas formas de intervenção (tratamento farmacológico e exercício físico aeróbio por 45 dias) (9,10). Esteves e colaboradores (2009) (11) demonstraram uma correlação negativa e significante da porcentagem de liberação da -endorfina após o TEM com os índices do MPP avaliados na PSG, demonstrando uma relação entre os sistemas dopaminérgicos e opiodérgicos.

comparado ao grupo experimental. Porém essas diferenças encontradas nos parâmetros polissonográficos estão dentro de um parâmetro de normalidade (77).

No entanto, uma limitação do nosso estudo foi não ter realizado um co-registro das imagens obtidas pelo exame de SPECT cerebral para quantificar com uma melhor acurácia o DAT.

Assim nossos resultados mostram que pacientes com MPP apresentaram uma menor densidade de DAT na região do putâmen esquerdo comparado ao grupo controle e uma sessão de exercício físico agudo (TEM) não alterou este perfil, fornecendo evidências de que essa alteração talvez seja o resultado da prática do exercício físico crônico.

Novos estudos associados à prática de exercício físico crônico devem ser

7. CONCLUSÃO

Pode-se concluir que o perfil da densidade do DAT apresentou valores significativamente maiores no grupo controle em relação ao experimental no momento

basal.

Não foram encontradas diferenças nas concentrações de DAT no grupo CRTL e

experimental após o TEM.

Anexo 2: Termo de concentimento livre e esclarecido

Universidade Federal de São Paulo

Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

O Departamento de Psicobiologia da Universidade de São Paulo – Escola Paulista de Medicina vem através deste termo, esclarecer os procedimentos a que você, enquanto voluntário, será submetido durante o período da pesquisa.

Projeto

Avaliação da Densidade do Transportador Dopaminérgico utilizando [99mTc]-TRODAT-1 e SPECT em pacientes com movimentos periódicos das pernas após teste de esforço máximo.

Objetivos

Pretende-se com este estudo avaliar a densidade do transportador de DA em pacientes que apresentam Movimentos Periódicos das Pernas (MPP) antes e após um teste de esforço máximo.

Procedimentos

No primeiro contato com a Instituição você passará por um processo de triagem que inclui um eletrocardiograma em esforço físico, exame de polissonográfico para constatar a presença de MPP, exames laboratoriais (coleta de sangue e urina).

Verificados os dados do processo de triagem e aceito conforme os critérios para participação como voluntário neste estudo, você passará por um exame de tomografia computadorizada – SPECT e um teste de esforço máximo.

Protocolo experimental

Nesta fase do estudo, você deverá freqüentar o laboratório durante o período de aproximadamente 1 semana, para a realização dos exames de polissonografia, teste de esforço máximo e exame clinico SPECT.

Os exames e as avaliações serão realizados da seguinte maneira:

x Avaliação Basal: eletrocardiograma de repouso e de esforço, exame

polissonográfico, exame de sangue, teste de esforço máximo (ergoespirometria), x Avaliação clínica por um médico, que analisará os resultados obtidos nas

avaliações acima descritas, para a liberação ou não da prática do exercício físico. x Avaliação do SPECT, o qual receberá material radioativo por via endovenosa. A

anual de exposição total a radiação recomendada pela OMS a indivíduos que participem de projetos de pesquisa.

x Análise da resposta aguda do exercício através do exame clinico – SPECT.

Desconfortos e riscos

Tendo em vista o total conhecimento dos parâmetros fisiológicos e clínicos observados neste estudo, procurar-se-á minimizar os riscos associados à execução deste estudo. No entanto, ao longo da execução do mesmo, podem ocorrer desconfortos físicos e/ou psicológicos durante ou após os exames.

Quanto aos seus direitos

x Abandonar a pesquisa em qualquer fase da mesma, sem declarar justificativa

pela decisão tomada e sem prejuízo pessoal pela desistência;

x Obter todos os dados referentes às avaliações realizadas, caso expresse

interesse;

x Solicitar esclarecimento para os responsáveis pela pesquisa, sobre todos os

procedimentos envolvidos com você em qualquer momento da mesma;

x Preservar sua identidade como sujeito da pesquisa, bem como de estar

assegurado que seu nome não será divulgado em qualquer meio de comunicação e reuniões científicas, entre outros.

x Se responsabilizam pelo projeto os estudantes Daniel Alves Cavagnollii, bem

x Se você tiver alguma consideração ou dúvida sobre a ética da pesquisa, entre

em contato com o Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) – Rua Botucatu, 572 – 1º andar – cj. 14, telefone: 5571-1062, Fax: 5539-7162, email: cepunifesp@epm.br.

Quanto aos seus deveres

x Não fazer uso de bebidas alcoólicas um dia antes ou nos dias da avaliação física

e dos exames de polissonografia;

x Informar aos responsáveis pela pesquisa sobre o uso de qualquer medicamento

Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

Eu, _________________________________________________________, concordo voluntariamente em participar do estudo acima. Recebi informações detalhadas sobre a natureza e objetivos do mesmo e, sobre as solicitações que me foram feitas, bem como os principais procedimentos que deverei adotar na época dos experimentos. Fui informado também sobre os possíveis riscos em minha saúde ou bem estar que possam ocorrer. Declaro estar ciente de todos os procedimentos aos quais serei submetido. Concordo em ser totalmente cooperativo nos procedimentos envolvidos e em informar de imediato qualquer sintoma inesperado. Tenho o conhecimento de que sou livre para desistir da minha participação no estudo a qualquer momento, sem que isso acarrete em prejuízos de qualquer natureza à minha pessoa. Tenho conhecimento de que os dados obtidos serão utilizados apenas para fins científicos e que meus dados pessoais serão mantidos em sigilo. Declaro estar ciente que minha imagem e voz poderão ser divulgados no âmbito do projeto, desde que sem qualquer finalidade comercial. Estou ciente dos meus direitos e deveres como voluntário deste estudo.

Nome: _____________________________________________________ Data: ___/___/____

Assinatura: __________________________________________________ Como responsável pela pesquisa, confirmo ter explicado a natureza, objetivos e possíveis efeitos indesejáveis deste estudo ao voluntário acima.

Nome: _____________________________________________________ Data: ___/___/____

Anexo 3: Artigo Submetido

BRAIN-2011-00656

Dopamine transporter density profiles in patients with periodic leg movements Cavagnolli, Daniel; Esteves, Andrea; Castiglione, Mario; Batista, Ilza; Bressan, Rodrigo; Tufik, Sergio; de Mello, Marco Tulio

Dear Mrs. Esteves

The manuscript you submitted to Brain has been successfully uploaded to Manuscript Central. As contact author for the editorial process, you will receive all future communications via email. Please disseminate this information to your fellow authors. Please note that you are the contact author for the editorial process and this has no bearing on the name used as the corresponding author in any final publication. For this, we would take the corresponding author as set out on the title page of your manuscript.If you should need to contact the Editorial Office, please quote the manuscript ID number above. This number will also appear in an e-mail from Brain to your co-authors within 24 hours of the end of this process, confirming receipt of your submission. If you have not already done so, please download the declaration of

authorship from the Manuscript Central homepage http://mc.manuscriptcentral.com/brain. In the top right hand corner, click on Instructions

1. emailing scanned form(s) to brain@medschl.cam.ac.uk 2. posting to address below

OPTIONAL OPEN ACCESS – Please note that if your manuscript is accepted for publication in Brain, you will have the option, at an additional charge, to make your paper freely available online immediately upon publication, under the Oxford Open initiative. Please see http://www.oxfordjournals.org/oxfordopen

Thank you for submitting your manuscript to Brain.

BRAIN

ED Adrian Building Forvie Site

Robinson Way Cambridge UK, CB2 0PY

Tel: ++44 (0)1223 331141 Fax: ++44 (0)1223 767382

Dopamine transporter density profiles in patients with periodic leg movements

Daniel Alves Cavagnolli1_{, Andrea Maculano Esteves}1_{, Mario Luiz Vieira Castiglione}1_, Ilza Rosa Batista2, Rodrigo Afonseca Bresan2, SergioTufik1, Marco Túlio de Mello1

1 _{Departamento de Psicobiologia – Universidade Federal de São Paulo - UNIFESP, São}

Paulo, Brazil

2 _{Laboratório Interdisciplinar de Neurociências Clínicas (LiNC) - Universidade Federal}

de São Paulo - UNIFESP, São Paulo, Brazil

Correspondence to: Marco Túlio de Mello, PhD

Departamento de Psicobiologia, Universidade Federal de São Paulo Rua Professor Francisco de Castro 93, Vila Clementino,

Abstract:

(maximal exercise test) did not alter this profile, providing evidence that this improvement is the result of chronic physical exercise.

Introduction

Restless Legs Syndrome (RLS) and Periodic Leg Movement (PLM) are movement disorders related to sleep (ICSD-DCM, 2005). The PLM disorder is characterised by a rhythmic extension of the lower limbs followed by ankle dorsiflexion, causing bending of the knees and generalised motor activation in the lower limbs. The movements last an average of 0.5 to 5 seconds and occur once every 20-40 seconds, and each PLM episode can last from minutes to hours (ASDA, 1993). The RLS disorder is characterised by unpleasant sensations in the legs followed by an irresistible urge to move them (Montplaisir et al., 1994).

A better understanding of the physiopathology of these movement disorders has been gained through several published studies, several of which implicate dopaminergic dysfunction (Rachel et al., 2010; Richard, 2004). Dopamine (DA) is a neurotransmitter

that is involved in emotional, cognitive and motor functions (Nieoullon and Coquerel,

2003). Different neural receptors are responsible for the uptake of this neurotransmitter

in the synaptic cleft. Among these, the dopamine transporter (DAT), which is a molecule that is located in the presynaptic neuron, modulates the uptake of DA by means of an electrical mechanism coupled to Na+ and Cl- (Reith et al., 1997). Seventy percent of the

DA removed from a synaptic cleft in the striatum occurs through presynaptic reuptake by DAT. The catechol-O-methyl transferase (COMT) enzyme metabolises the other 30% (Boulton and Eisenhofer, 1998). Thus, DAT regulates the levels of available DA in the synaptic cleft (Jaberet al., 1997),and its concentrations reflect the homeostatic tone

of the dopaminergic system (Jaberet al., 1997; Jones et al., 1998). Using markers like

TRODAT-1 to assess DAT density has proven to be a highly appropriate technique for investigating dopaminergic neurotransmission in humans (Shih et al., 2006; Martins et

TRODAT-1 is a tropane derivative that, when marked with metastable technetium 99 (99mTc), crosses the hematoencephalic barrier, where it has a high affinity for DAT. The resulting binding/labelling is captured by scintigraphy in Single Photon Emission Computer Tomography (SPECT) mode to produce site-specific imaging of DAT density (Meegallaet al., 1997).

According to studies evaluating treatment for RLS-PLM, both the DA precursor and DA agonists improve or alleviate the symptoms of these disorders, whereas dopamine antagonists often exacerbate the symptoms (Ondo, 1999; Stiasny et al., 2000; Odin et

al., 2002).

The use of exercise as a form of non-pharmacological treatment to improve RLS-PLM symptoms has also been the subject of clinical research (ASDA, 1991), and studies have already demonstrated that acute or chronic physical activity provides benefits and significantly reduces PLM symptoms in patients with or without medullar injury (De Mello et al., 1996; 2002; Esteves et al., 2009). However, the mechanism by

Materials and methods

This study was approved by the Ethics Research Committee of the Universidade Federal de São Paulo/ Hospital São Paulo (0546/08). After receiving information required for volunteer participation in this study and before starting the experimental protocol, all volunteers signed a consent form agreeing to participate in the research.

Contact details of the patients were collected from the Centre for Psychobiology and Exercise (CPE) and the Sleep Institute. We selected 16 sedentary male adult volunteers with an average age of 50.25 ± 5.43 years. The volunteers selected for inclusion in the study showed no abnormalities in their laboratory tests (clinical and ECG) that contraindicated the practice of physical exercise. After screening, the volunteers were divided into the following two groups:

Experimental Group: volunteers had periodic leg movements (PLM) with an index >5/hour (Walters, 1995).

Control group: volunteers did not exhibit any sleep disorders.

Experimental Design

Experimental Procedure

Acute Physical Exercise: Maximal Exercise Test (MET) were performed on the CPE premises. The tests were performed on a treadmill (Lifefitness® 9700HR). The protocol adopted for the progressive load test employed a maximum speed of 1 km per minute; the initial charge for warming up was two minutes at 4 km/h, and the test was terminated when the patient reached maximal voluntary exhaustion. Throughout the test, we used a fixed slope of 1% to simulate the physical stress of open spaces (Jones and Doust, 1996).

Cerebral SPECT: Cerebral SPECT tests were conducted on the premises of the São Paulo Hospital - Nuclear Medicine Centre. The images from patients who underwent the cerebral SPECT scan were acquired 4 h after injection of 22-25 mCi of [99m Tc]-TRODAT-1 using a dual-head camera equipped with fan-beam collimators. The images were transferred to the Xeleris software program (workstation for image processing).

The marking methodology and TRODAT-1 quality control were established in the IPEN-CNEN/SP Radiopharmacy centre - Institute for Energy and Nuclear Research (Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPEN), the state authority associated with the University of São Paulo (USP) and managed by the National Nuclear Energy Agency (Companhia Nacional de Energia Nuclear - CNEN).

The labelling reaction was initiated by the addition of 1-2 ml of freshly eluted 99m_{TcO4 (less than 2 hours after elution of the} 99_Mo/99m_{Tc generator), always with a total}

High Efficiency Liquid Chromatography was used to assess the radiochemical purity, as described in the instructions of the [99mTc] TRODAT-1 kit, which advises that the yield must be at least 90%. We also used the partition coefficient (quality control) method, which employs a simple partition between organic and aqueous phases formed with equal parts of ethyl acetate and hexane (1:1) and saturated sodium bicarbonate. The latter method was used on the HSP - UNIFESP Nuclear Medicine premises.

The HSP Nuclear Medicine results showed a correlation (r=0.98) with the results of TRODAT-1 samples analysed by High Performance Liquid Chromatography.

Processing and Analysis of SPECT imaging: SPECT images were processed using a filtered retro-projection algorithm and a Butterworth filter (order 10, cut off 0.45). Dimensional images in the form of transaxial, coronal and sagittal sections were acquired through a 128 x 128 acquisition matrix. The attenuation correction algorithms tended to support merging the basal ganglia and cerebral cortex concentrations (Kung

et al., 1997). The attenuation correction was accomplished using CT scans obtained in

the SPECT camera.

The evaluation of SPECT studies with [99mTc] TRODAT-1 consists of visual inspections and semi-quantitative analyses. Before analysis, images were coded without identifying group membership to allow blind assessment. We used 2.05-mm-thick transaxial sections of the striatum (STR), caudate (CAU), putamen (PUT) and occipital (OCC) regions. For quantitative evaluation of DAT density, the binding potential (BP) was calculated for the regions of interest (ROI) using the following formula: BP = [STR or CAU or PUT - OCC] / OCC (Martins et al., 2010; Felicio et al., 2010), where

(regions containing the highest number of dopaminergic neurons), and OCC represents the tracer concentration in the occipital region (the reference region in which there is no specific binding associated with dopaminergic neurons).

Statistical analysis

Statistical analyses were performed using Statistica® for Windows® version 7.0. Initially, we performed the Shapiro-Wilk's W test to verify the normality curve. Then, a descriptive analysis was performed. Subsequently, Student’s t test was performed for

independent samples (age, body mass, height, body mass index, VO2peak, maximum ventilation and maximum heart rate). Repeated measurements were analysed by two-way ANOVA followed by post-hoc Bonferroni, using the following dopaminergic and

Results

Table 1 presents control and experimental data related to descriptive analysis of the sample including age, body mass, height, body mass index and physiological

parameters, such as VO2 peak, maximum ventilation and maximum heart rate. There were no statistically significant differences between the control group and the experimental group.

In the PSG data for two nights of sleep (basal and after MET), time differences were found for sleep stage 1 (F(1,14) = 6.3418, p = 0.02) after MET, corresponding to a significant percentage increase.

Significant differences were also observed for sleep stage 2 (F(1, 14) = 6.8534, p=0.02) and Slow Wave Sleep (SWS) (F(1, 14)=10.786, p=0.01) between the control and Experimental groups at baseline. The control group showed higher SWS values compared to the experimental group, whereas Stage 2 values were higher for the experimental group compared to Control.

The PLM variables in the experimental group had higher rates compared to the control group both at baseline and after MET. Thus, statistically significant differences were found for the experimental group compared to the control group (F(1, 14)= 13.485, p=0.01), time (F(1, 14)=9.5857, p=0.01) and interaction (F(1, 14)=8.7854, p=0.01). However, there was a significant reduction in the rate of PLM (30.66±17.41 PLM/h to 20.33±22.13 PLM/h) in the experimental group after MET. No significant differences were observed for the other sleep variables (Table 2).

showed higher values compared to the experimental group at baseline. For the other dopaminergic variables, there were no significant differences (Figure 2, Table 3).

Discussion

In this study, we used the TRODAT marker to evaluate DAT density profiles in patients with PLM and to assess the influence of exercise (MET) on density of this transporter. The results show lower baseline DAT-binding values for the experimental group in the region of the left putamen brain region.

Our results support the hypothesis that patients with RLS-PLM exhibit dysfunction of the central dopaminergic system.

Some SPECT, SPET and PET studies that use tracers that bind to the dopamine D2 receptor have demonstrated a decrease in striatal D2 receptor expression in patients exhibiting RLS-PLM symptoms (Staedtet al., 1993; 1995; Michaud et al., 2002; Cervenka et al., 2006; Connor et al., 2009). Tsing Chiu et al. (2010) have reported that

otherwise healthy, poor-sleeping individuals have lower presynaptic DAT concentrations in the caudate brain region.

However, the relationship between DAT concentrations and RLS-PLM in SPECT studies remains controversial, in large part due to differences in image acquisition methods.

Turjanski et al. (1999) have conducted a Positron Emission Tomography (PET)

study involving 13 patients with RLS. The results demonstrated reduced uptake of the F-dopa drug in the putamen region, which occurred in patients who exhibited lower D2 binding receptors in the putamen.

dopamine can generate an increase of DA in the synaptic cleft, thereby decreasing the density of DAT (Michaud et al., 2002). Another physiological dysfunction that could lead

to an increased concentration of DA in the synaptic cleft would be a decrease in the activity of enzymes responsible for degrading DA, specifically monoamine oxidase and catechol-O-methyltransferase (Michaud et al., 2002).

In this regard, we wished to evaluate how physical exercise might affect the density of DA transporters and the sleep patterns of patients with RLS-PLM.

Our initial hypothesis was that physical exercise (MET) would modulate the density of DAT. Our results showed a difference in the baseline DAT densities obtained for the control and experimental groups; however, a MET did not alter this profile. A relationship between the intensity of physical exercise and the release of -endorphin is well known. Both incremental and shortterm anaerobic exercise leads to increased -endorphin levels as a result of the activation of endogenous opiates by a variety of stressors. This release of -endorphin, which is based on the intensity and volume of exercise, results in a change in the dopaminergic system (Schwarz and Kindermann, 1992). However, our results showed that a single session of physical exercise was not enough to perpetuate these changes, suggesting that this effect may depend on chronic physical exercise.

In agreement with the data obtained in this study regarding the reduction of PLM after MET, previous studies performed by our group have demonstrated that physical exercise reduces the rate of PLM in different populations (De Mello et al., 1996; De Mello et al., 2002; Esteves et al., 2009). Using PSG, De Mello et al. (1996) have

2002; 2004). Also using PSG, Esteves et al. (2009) have shown a significant negative

correlation of -endorphin release with PLM indexes after MET, indicating a relationship between dopaminergic and opioid systems.

The majority of studies concerning the influence of exercise on sleep patterns have reported an increase in SWS and an increase in REM sleep latency in addition to reduced REM sleep (Hague et al., 2003; Youngstedt, 2005). However, our results,

which focus specifically on the PLM sleep disorder, showed an increased percentage of stage 1 non-REM sleep, both at baseline and after MET, for both control and experimental groups; but for sleep stage 2 and SWS, significant differences were only demonstrated between groups. These results may be due to the fact that the experimental group presented PLM because this group had higher values for sleep stage 2 when compared with the control group. Likewise, the control group had higher SWS values compared to the experimental group. However, these differences in polysomnographic parameters are within normal parameters (Carskadon and Dement, 1994).

A possible limitation of our study may result from the fact that cerebral SPECT images were not co-recorded to quantify variations in DAT with greater accuracy.

In brief conclusion, our results showed that patients with PLM had lower left-putamen DAT densities compared to the control group and an acute physical exercise (MET) no altered these densities.

Acknowledgements

References

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American Academy of Sleep Medicine. International classification of sleep disorders, 2nd ed.: Diagnostic and Coding Manual. Westchester, Illinois: American Academy of Sleep Medicine, 2005.

American Sleep Disorders Association (ASDA), Atlas Task Force. EEG Arousals: Scoring Rules and Examples. Sleep 1992; 15: 174-84.

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