Recebido em 11.07.2000. / Received in July, 11thof 2000.
Aprovado pelo Conselho Consultivo e aceito para publicação em 22.08.2002. / Approved by the Consultive Council and accepted for publication in August, 22ndof 2002. * Trabalho realizado na Universidade de Bradford, UK, como apoio da CAPES. / Work done at Bradford University, UK, with a grant from CAPES.
1Professora Adjunta do Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Instituto de Biologia/UFPEL. / Adjunct Professor of the Physiology and Pharmacology, Institute of Biology/UFPEL. 2Professor Adjunto de Dermatologia; Departamento de Medicina Especializada, Faculdade de Medicina/UFPEL. / Adjunct Professor of Dermatology; Department of Specialized Medicine,
Faculty of Medicine/UFPEL.
©2003by Anais Brasileiros de Dermatologia
Conhecimentos atuais sobre a biologia dos melanócitos
no folículo piloso humano
*
Current knowledge on the biology of melanocytes in
the human hair follicle
*
Isabel Oliveira de Oliveira
1Hiram Larangeira de Almeida Junior
2Resumo:Os processos de crescimento e pigmentação do cabelo não são completamente conhecidos. Da mesma forma, o papel que os melanócitos foliculares desempenham nesses processos ainda não foi esclarecido. A identificação do destino dos melanócitos foliculares ao final da fase de crescimento do folículo piloso e a localização do reservatório dessas células, que voltam a povoar a porção inferior do novo folículo ao final da fase telógena do ciclo de crescimento do cabelo, constituem objeto de estudo. Investigações têm sido realizadas visando identificar se os melanócitos são responsáveis por algum sinal molecular de comunicação envolvido com as mudanças observadas na estrutura do folículo piloso durante o ciclo do cabelo. Alguns fatores têm sido descritos como participantes dos processos essenciais para a biologia dos melanócitos. A importância da proteína antiapoptótica, Bcl-2, para a manutenção dos melanócitos já foi demonstrada. A via SCF/kit foi mencionada como um mecanismo primário para a regu -lação dos processos de proliferação e diferenciação dos melanócitos. Por outro lado, o mecanismo de ação dos androgênios sobre as células do folículo piloso tem sido objeto de muitos estudos que tentam explicar como esses hormônios participam da regulação dos processos de crescimento e pigmentação do cabelo. Portanto, o objetivo dessa revisão é apresentar os atuais conhecimentos envolvendo a biolo -gia dos melanócitos foliculares.
Palavras-chave: folículo piloso; genes Bcl-2; imunohistoquimica; melanócitos; pigmentação.
Summary:Hair growth and hair pigmentation processes have yet to be completely understood. The
INTRODUÇÃO
Os melanócitos são embriologicamente derivados a partir de uma população germinativa de melanoblastos ori-ginários de células da crista neural, pouco tempo após o fechamento do tubo neural. Na maioria das espécies, os melanoblastos começam o processo de melanização imedia-tamente antes ou logo depois de alcançar seu destino.1
Os melanoblastos migram do tronco da crista neural seguindo um caminho dorsolateral entre o dermátomo dos somitos e o ectoderma, até seu destino na camada basal da epiderme ou no folículo piloso.2Outros melanoblastos
deri-vados da crista neural migram para locais em torno do olho e da stria vascularisno ouvido interno. Uma subpopulação
de células diferencia-se do neuroectoderma in situ para se
tornar o epitélio pigmentar da retina. Além disso, alguns melanoblastos migram até as leptomeninges e as mucosas.
Apesar das diferenças que existem entre os subtipos de células pigmentadas, as quais estão restritas aos locais anatômicos específicos, o processo geral de melanização pode ser assim descrito:
A melanogênese, um processo de síntese da melani-na, acontece nas organelas chamadas melanossomas. Os eventos iniciais são catalisados por uma enzima tirosinase multifuncional. Há outras proteínas reguladoras conhecidas como proteína 1 relacionada à tirosinase, TRP I, e proteína 2 relacionada a tirosinase, TRP II.3Todas as proteínas são
membros da família tirosinase.
A síntese da melanina começa com oxidação enzi-mática de L-tirosina à L-Dopa e oxidação de L-Dopa à dopaquinona. Com a transformação espontânea da dopaqui-nona em leucodopacromo e dopacromo inicia-se uma cas-cata bioquímica, a qual termina com a formação de pigmen-to castanho-prepigmen-to chamado eumelanina. A conjugação de dopaquinona com cisteína ou glutationa resulta em cistei-nildopa e glutatiocistei-nildopa. Ambos passam por uma série de transformações, gerando finalmente um pigmento verme-lho-amarelo chamado feomelanina.
Os melanossomas são transferidos de seu local de sínte-se, a região perinuclear dos melanócitos, até as pontas de seus dendritos. Posteriormente, são transferidos aos queratinócitos, os quais podem fagocitar algumas porções de dendritos carre-gados de melanina ou melanossomas livres no espaço intrace-lular. Apesar do modo de transferência, os melanosomas são envolvidos por lisossomas secundários, individualmente ou em grupo, dependendo do tamanho ou de sua superfície química.
Os melanócitos foliculares diferem dos melanócitos epi-dérmicos por seu maior tamanho e dendritos mais longos, e por estarem relacionados somente a 4 a 5 queratinócitos em con-traste com os 36 a 40 no caso de melanócitos epidérmicos.4
A atividade melanogênica dos melanócitos folicula-res é estreitamente relacionada com a fase anágena do ciclo de crescimento do cabelo, o que se pode afirmar com base na observação de que o cabelo só é pigmentado na fase de crescimento. Na fase catágena a formação de melanina é interrompida e permanece ausente também na fase telógena.5
INTRODUCTION
Melanocytes are embryologically derived from a stem population of melanoblasts that originate from neural crest cells soon after closure of the neural tube. In most of the species, the melanoblasts begin melaniza -tion just before or just after they have reached their des-tination.1
Melanoblasts migrate from the trunk neural crest on a dorsolateral pathway, between the dermatome of the somites and overlying ectoderm to their eventual destina-tion in the basal layer of the epidermis or the hair follicle.2
Other neural crest-derived melanoblasts migrate to sites around the eye and to the stria vascularis of the inner ear. A population of pigment cells differentiates from neuroecto-derm in situ to become the retinal pigment epithelium. Furthermore some melanoblasts migrate to leptomeninges and mucosae.
In spite of the differences that exist among these sub-types of pigmented cells, which are restricted to specific anatomic sites, the general process of melanization can be described as follows.
Melanogenesis, the process of synthesizing melanin, occurs in organelles named melanosomes. The initial events are catalysed by a multifunctional enzyme tyrosinase. There are other regulating proteins known as tyrosinase-related protein-1 and tyrosinase-related protein-2, respectively, TRP I and TRP II.3All these proteins are members of the
ty-rosinase gene family.
The multi-step process starts with an enzymatic oxi-dation of L-tyrosine to L-DOPA and oxioxi-dation of L-DOPA to DOPAquinone. Spontaneous transformation of DOPA -quinone to leukoDOPAchrome and DOPAchrome initiates a biochemical cascade that ends with the formation of brow-nish black pigment named eumelanin. The conjugation of DOPAquinone with cysteine or glutathione yields cys-teinylDOPA and glutathionylDOPA. Both undergo a series of transformations to finally generate a reddish-yellow pig-ment named pheomelanin.
Melanosomes are transferred from their synthesis site, the melanocyte perikarion, to the tips of its den-drites. They are thereafter transferred to keratinocytes, which may phagocytize portions of melanin-laden dendrites of melanocytes or free melanosomes in the extra -cellular space. Regardless of the mode of transferring, melanosomes are packaged in secondary lysosomes either singly or as a group, depending on their size and/or chemical surface.
Follicular melanocytes differ from epidermal melanocytes by a larger size, longer dendrites and the fact of supplying four to five keratinocytes in contrast with 36-40 in the case of epidermal melanocytes.4
and remains absent throughout the telogen period.5The
factors that control melanocyte re-population of hair follicles during each hair cycle are not completely established.
It is not known whether these cells move up with the epithelial column during the hair cycle and rest or whether they die and are replaced from a stem cell source elsewhere in the skin. During the catagen stage of mouse follicles, undifferentiated melanocytes are present in the epithelial column and it has been suggested that these cells are trans-ferred into the future resting hair germ.6Radiation studies
on murine follicular melanocytes also suggest the exis -tence of melanocytes reservoir.7More recently, special
ref-erence to the area below the sebaceous gland, called the bulge area, has been made as a reservoir of human melanocytes.8Additional studies are therefore required in
this area.
The aim of this review is to discuss the factors described as being present in melanocyte migration and activity during the hair follicle cycle, such as Bcl-2 and c-kit. Furthermore, this paper considers the melanocyte-lin-eage markers, NKI-beteb, HMB-45 and Mel-5, which have been used to differentiate melanocyte-lineage cells in the hair follicle. Finally, it offers a brief review of two addi-tionally interesting aspects: hair follicle stem cell melanocytes and the action of androgens on the hair folli-cle cells, including melanocytes.
DISCUSSION Bcl-2 and c-kit
The transition from anagen to catagen has been thought to be an apoptotic process, followed by matrix remodeling. In contrast to necrosis, apoptosis describes a basic physiological process of programmed cell death that plays a major role in the development and mainte -nance of homeostasis within all multicellular organ-isms.9,10Among other factors, the Bcl-2gene product has
been identified inflencing the apoptotic process. The
Bcl-2 gene was initially found as a product of translo-cation t(14:18) (q32;q31) in the most common form of follicular B cell lymphoma. The translocation juxtapos-es the transcriptionally active immunoglobulin heavy-chain locus on chromosome 14 to the Bcl-2 gene on chromosome 18, resulting in overexpression of the Bcl-2 protein.11In vitro models have demonstrated that Bcl-2
inhibits the apoptosis process induced by diverse stimuli such as radiation, hyperthermia, growth factor with-drawal, glucocorticoids and multiple classes of chemotherapeutic agents. Bcl-2 blocks programmed cell death rather than promote proliferation by blocking the plasma membrane blebbing, volume contraction, nuclear condensation, and endonucleolytic cleavage of DNA.12More recently, Bcl-2was described to be the
car-dinal member of a new category of oncogene regulators of programmed cell death.13
Os fatores que controlam a repopulação melanocítica do folículo piloso, durante cada ciclo de crescimento do cabelo, não são completamente compreendidos.
Desconhece-se se essas células sobem junto com a colu-na epitelial durante o ciclo do cabelo e então descansam, ou se elas morrem e são substituídas a partir de uma fonte de células germinativas oriundas de outro local da pele. Durante a fase catá-gena observada nos folículos de camundongos, os melanócitos não diferenciados estão presentes na coluna epitelial. Tem sido aventada a possibilidade de que essas células sejam transferidas para o futuro germe de cabelo em repouso.7Os estudos de
radia-ção sobre os melanócitos foliculares de murinos também suge-rem a existência de um reservatório de melanócitos.8Mais
recen-temente, uma referência especial tem sido feita sobre a região sob a glândula sebácea, uma área chamada "bulge" (protuberância), como sendo um reservatório de melanócitos humanos. Assim sendo, são necessários estudos adicionais a esse respeito.
O objetivo deste estudo é discorrer sobre os fatores que têm sido descritos como estando presentes na migração e na ati-vidade de melanócitos durante o ciclo de vida do folículo pilo-so, como Bcl-2 e c-kit. Adicionalmente, considera os
indicado-res da linhagem melanocítica, NKI-beteb, HMB-45 e Mel-5, os quais foram utilizados para diferenciar as células dessa linha-gem, no folículo piloso, e finalmente oferece uma revisão de dois aspectos interessantes: células germinativas de melanóci-tos no folículo piloso e a ação dos andrógenos sobre células do folículo piloso incluindo os melanócitos.
DISCUSSÃO Bcl-2 e c-kit
A transição da fase anágena para a catágena tem sido considerada um processo apoptótico, seguido por remodela-gem da matriz. Ao contrário da necrose, a apoptose descreve um processo fisiológico básico de morte celular programada que desempenha importante papel para o desenvolvimento e a manutenção de homeostase dentro de todos os organismos multicelulares.9,10Entre outros fatores, o produto do gene Bcl-2
foi inicialmente achado como um produto de translocação t(14:18)(q32;q31) na forma mais comum do linfoma folicular de célula B. A translocação justapõe o locus transcripcional-mente ativo da cadeia pesada da imunoglobulina localizado no cromossomo 14 para o gene Bcl-2no cromossomo 18,
resul-tando na superexpressão da proteína Bcl-2.11Os modelos in vitrotêm demonstrado que Bcl-2 inibe o processo apoptótico
induzido por estímulos diversos: tais como a irradiação, hiper-termia, ausência do fator de crescimento, os glicocorticóides e as classes múltiplas de agentes quimioterapêuticos. Bcl-2 blo-queia a morte celular programada em vez de promover a pro-liferação bloqueando o "blebbing" da membrana plasmática, a
contração do volume, a condensação nuclear e a clivagem endonucleolítica do DNA.12Mais recentemente, Bcl-2foi
des-crito como membro cardinal de uma nova categoria de onco-genes reguladores de morte celular programada.13
O gene Bcl-2codifica uma proteína 25-kDa, a qual tem
incluindo a membrana mitocondrial externa, a membrana do retículo endoplásmico e a membrana nuclear externa.14,15,16 A
expressão de Bcl-2 é muito difundida em tecidos imaturos no período pré-natal. Portanto, a expressão torna-se muito restrita com a maturação. No adulto, Bcl-2 é encontrado em popula-ções imaturas (os progenitores da medula óssea de todas as linhagens, os progenitores epiteliais nos intestinos e na epider-me), no epitélio hormônio-dependente, que atravessa ciclos de hiperplasia e de involução, e nos neurônios do sistema nervoso periférico.19
No folículo piloso adulto Bcl-2 é expresso ao longo do ciclo nas células da papila dérmica, mas sua expressão no epitélio folicular depende da fase do ciclo. Durante a etapa anágena, Bcl-2 é expresso no epitélio das porções do folículo que crescem mais ativamente, tal como o bulbo, a camada basal da bainha externa radicular e na área "bulge". Na fase telógena, Bcl-2 está ausente no epitélio do folículo em repouso, inclusive na região bulge.20
Estudos a partir de três linhagens de camundongo trans-gênico que não expressam ("knock-out") Bcl-2, revelaram
anor-malidades pleiotrópicas semelhantes após o nascimento, incluindo a apoptose fulminante de células linfóides, rins poli-císticos, intestino delgado (deformado), e hipopigmentação da pelagem.21,22,23Com base na observação de que os camundongos knock-outpara Bcl-2se tornaram cinza durante o segundo ciclo
piloso, alguns estudos têm sido feitos com o objetivo de anali-sar melanócitos e melanogenêse folícular nesses animais. Uma redução próxima de 30% de hastes pigmentadas no segundo ciclo piloso nesses camundongos foi descrita nesses estudos.
Adicionalmente, foi relatado que após a depilação com uma mistura de cera/resina para induzir novos pêlos anáge-nos, mais de 97% dos pêlos desses camundongos não apresen-taram grânulos de melanina visíveis, enquanto que 100% das hastes em camundongos não transgênicos foram pigmentadas. Paralelamente, os resultados de um estudo por meio de microscopia eletrônica demonstraram que a maioria dos folí-culos pilosos anágenos testados nos camundongos knock-out
para Bcl-2não contém melanócitos dopapositivos ou grânulos
melanínicos transportados e dispersados nos ceratinócitos foliculares mais próximos. A contagem de melanócitos reve-lou que o camundongo knock-out paraBcl-2raramente tem a
capacidade de reproduzir melanócitos após a depilação em laboratório. Assim, concluiu-se que a hipopigmentação dos pêlos no segundo ciclo de crescimento nos camundongos
knock-out para Bcl-2 é causada pelo desaparecimento de
melanócitos e a falta conseqüente dos grânulos de melanina. Em razão da cor da pelagem dos camundongos knock-outpara Bcl-2se apresentar normal durante o primeiro ciclo após o
nascimento, os autores sugeriram que a diferenciação e a maturação dos melanócitos nesses camundongos são proces-sos aparentemente normais durante as etapas embriônicas, sendo, os melanócitos ainda ativos até o momento do nasci-mento. Os autores concluíram que Bcl-2 é essencial para o ciclo vital dos melanócitos.24
O receptor c-kité outro fator relatado como
participan-The Bcl-2gene encodes a 25-kDa protein, which has been reported to be present in multiple membrane loca-tions, including mitochondrial outer membrane,12
endoplas-mic reticulum membrane, and nuclear outer mem-brane.14,15,16Bcl-2 expression is widespread in immature
tis-sues prenatally.17 However, the Bcl-2 expression becomes
highly restricted with maturation. In the adult, Bcl-2 is found in immature populations (bone marrow progenitors of all lineages, epithelial progenitors in intestine and epi-dermis), hormonally responsive epithelia that undergo cycles of hyperplasia and involution18 and neurons of the
peripheral nervous system.19
In the adult hair follicle, Bcl-2 is expressed through-out the cycle in the dermal papilla cells, but its expression in the follicular epithelium is dependent upon the phase of the cycle. During the anagen stage, Bcl-2 is expressed in the epithelium of the most actively growing portions of the cycling follicle, such as bulb, basal layer of the outer root sheath and bulge region. In telogen, it is absent from the epithelium of the resting follicle, including the bulge region.20
Studies from three lines of Bcl-2knock-out mice, a mouse homologously lacking Bcl-2 gene, revealed similar pleiotropic abnormalities after birth, including fulminate apoptosis of lymphoid cells, polycystic kidney, distorted small intestine, and hair hypopigmentation.21,22,23 Based
on the observation that the Bcl-2 knock-out mice turned gray during the second hair cycle, studies were undertak-en with the aim to analyze hair follicle melanocytes and melanogenesis in these animals. A decrease of approxi-mately 30% of pigmented hair shafts in the second hair cycle in Bcl-2 knock-out mice was described. Furthermore, it was reported that after depilation with wax/rosin mixture to induce new anagen hair, more than 97% of the hair shafts did not show visible melanin gran -ules in these mice, whereas 100% of the hair shafts in
The C-kit receptor is another factor reported to participate in the regulatory processes that maintain the number and activity of melanocytes within normal human skin. The C-kit gene, located on chromosome 4,25
encodes the cell surface transmembrane receptor protein tyrosine kinase for the Stem Cell Growth Factor (SCF, also known as mast cell growth factor, KIT ligand and steel factor). In humans, mutations of the c-kit proto-oncogene result in an autosomal dominant genetic pig-mentation disorder named Piebaldism. This is a disorder characterized by congenital patches of white skin and hair, and it is thought to result from defective melanocyte proliferation or migration from the neural crest during development. "Dominant white spotting" is a similar dis -order, resulting from deletions or point mutations of c-kit proto-oncogene in mice. It is characterized by defects of pigmentation, hematopoiesis, and germ-cell develop-ment. A study using mutant mice at the c-kit gene showed that in the midgestation stage, melanoblasts crit-ically need SCF/KIT interactions as well as later in development, when c-kit plays a vital role in melanoblast proliferation.26Also, the crucial role of the SCF/KIT
path-way for developing murine melanocytes was demonstrat-ed by means of experiments utilizing an c-kit anti-body, ACK2. The results showed that melanocytes in new -born mice are c-kit dependent and undergo apoptosis when c-kit receptors are blocked by ACK2 in the early days after birth. During this c-kit dependent period, melanocytes differentiate from negative to DOPA-positive and migrate from the epidermis to hair folli-cles.27 On the other hand, studies based on human skin
xenografts treated with serial injections of recombinant human SCF or an human c-Kit-inhibitory antibody, K44.2, demonstrated that the SCF/KIT pathway remains critical in adult human skin.28It was suggested that the
SCF/KIT pathway might function as a primary mecha-nism for regulating both proliferation and differentiation of melanocytes.
The SCF gene, or steelgene, has been mapped to the Steel(Sl) locus on chromosome 12.29This gene is
vari-ably spliced, yielding two mRNA products encoding mem-brane-bound proteins of 248 amino acids and 226 amino acids.30 The larger variant contains an extracellular pro
-teolytic cleavage site, which allows release of SCF from the cell surface. The smaller splice-variant is usually not cleaved and normally remains associated with the cell surface.31 Results from studies in mutant mice to steel
gene indicated that soluble SCF is required for melanocyte precursor dispersal on the lateral pathway, or for their initial survival in the migration staging area. By contrast, membrane-bound SCF appears to promote melanocyte precursor survival in the newly formed der -mal mesenchyme.32In human skin, it was suggested that
SCF on the cell surface of epidermal keratinocytes may permit regulation of the proliferative potential of
adja-te nos processos regulatórios para a manuadja-tenção do número e da atividade dos melanócitos na pele humana normal. O gene c-kit, localizado no cromossomo 4, codifica o receptor de
mem-brana do tipo tirosinoquinase, receptor c-kit, para o Fator de
Crescimento de Célula Germinativa (Stem Cell Growth Factor-) - SCF, também conhecido como fator de crescimento
de mastócitos, "KIT ligand" ou "steel factor". Nos seres
huma-nos, as mutações do proto-oncogene c-kit resultam em uma
doença genética autossômica-dominante da pigmentação cha-mada piebaldismo. Trata-se de doença caracterizada por man-chas congênitas da pele e poliose, considerada uma conseqüên-cia de alteração da proliferação ou da migração de melanócitos a partir da crista neural durante o desenvolvimento do embrião. Uma doença semelhante, causada pela ausência ou mutações pontuais desse proto-oncogene c-kit em camundongos,
deno-minada “Manchas dominantes brancas”, caracteriza-se por defeitos na pigmentação, na hematopoiese e no desenvolvimen-to de células germinativas. Um estudo utilizando camundongos "mutantes do c-kit" demonstrou que, no meio da gestação, os
melanoblastos necessitam de interações críticas com o SCF/ c-kit e também mais tarde na evolução, quando o c-kit
desempe-nha papel vital na proliferação de melanoblastos.26O papel
crí-tico da via SCF/KIT para desenvolver melanócitos murinos também foi demonstrado por meio de experiências utilizando o anticorpo antic-kitACK2. Os resultados demonstraram que os
melanócitos em camundongos recém-nascidos são dependentes do c-kite sofrem apoptose quando os receptores c-kitestão
blo-queados pela presença do ACK2 nos primeiros dias após o nas-cimento.
Durante esse período, os melanócitos dependentes do c-kitdiferem de dopanegativo a dopapositivo, e migram
da epiderme para os folículos pilosos.27Por outro lado,
estu-dos baseaestu-dos em xenoenxertos de pele humana tratada com injeções em série de SCF humana recombinante ou do anti-corpo c-kitinibitório humano, K44.2, demonstraram que a
via SCF/KIT permanece crítica na pele humana adulta.28
Foi aventada a possibilidade de que a via SCF/KIT poderia funcionar como um mecanismo primário para regular a pro-liferação e a diferenciação dos melanócitos.
O gene de SCF, ou o gene steel, tem sido mapeado no locus de Steel no cromossomo 12.29Esse gene é separado
varia-velmente, resultando em dois mRNA, codificando duas proteí-nas ligadas à membrana, uma de 248 aminoácidos e outra de 226 aminoácidos.30A variante maior contém um local de
cliva-gem proteolítico extracelular, o que permite a liberação de SCF da superfície celular. A variante menor normalmente não é cli-vada e permanece associada com a superfície celular.31Os
resul-tados de estudos nos camundongos mutantes ao gene steel indi-cam que SCF solúvel é necessário para realizar a dispersão do precursor melanócito na via lateral ou para a sobrevivência ini-cial na região em que acontece a migração. Em contrapartida, o SCF ligado à membrana parece promover a sobrevivência de precursor melanócito no mesênquima recém-formado.32 Na
potencial proliferativo dos melanócitos adjacentes via uma inte-ração direta com o receptor KIT dos melanócitos.28
Indicadores da linhagem dos melanócitos: NKI-beteb, HMB-45 e Mel-5
As pesquisas anteriores sobre os melanócitos foram baseadas nos corantes químicos, tal como Fontana-Masson ou Dopa-oxidase, o que exige a presença da melanogênese ativa. Em conseqüência, os melanócitos foram classificados de forma morfológica e funcional em dois tipos diferentes: ativo ou dopa-positivo, e inativo ou dopa-negativo.
Os folículos pilosos anágenos possuem melanócitos ativos na parede do infundíbulo e na parte pigmentada do bulbo, perto da seção superior da papila dérmica. Os mela-nócitos amelanóticos (dopa-negativo) têm sido observados ao longo da camada basal da bainha radicular externa da parte média e inferior do folículo. Sob algumas condições, como após irradiação com raios-X, após dermoabrasão, após exposição aos raios ultravioleta e após fotoquimotera-pia oral, os melanócitos amelanóticos na bainha radicular externa tornam-se produtores de melanina. Com respeito à distribuição dos melanócitos ativos e inativos, Staricco dividiu o folículo piloso em quatro partes. A parte superior do folículo (infundíbulo) e a parte superior do bulbo em contato com a papila dérmica correspondem às porções A e D, que são as porções melanóticas. As seções média e infe-rior do folículo formam a porção B, que possui os melanó-citos amelanóticos. A bainha radicular externa, geralmente amelanótica, do bulbo e a matriz pilosa abaixo do nível crí-tico de Auber correspondem à porção C. Esse nível crícrí-tico refere-se a uma linha transversal na parte mais larga da papila dérmica, que separa o centro germinativo do folícu-lo (matriz) das células diferenciadas (bulbo superior), des-crito por Auber nos folículos de carneiros e por Montagna37
nos folículos pilosos humanos.
Contudo, mais recentemente, com novos anticorpos monoclonais é possível identificar subpopulações de melanó-citos foliculares. Essas inovações são úteis para entender a biologia das inter-relações celulares e têm aplicações clínicas. Os anticorpos HMB-45 e NKI-beteb são descritos como reconhecedores dos produtos de proteínas codificadas por um único gene, gp100-cl, o qual é homólogo ao locusdo
gene humano prata, Pmel17.38 O antígeno reconhecido pelo
anticorpo monoclonal HMB-45 tem peso molecular de 10kDa e é localizado nas vesículas melanossomais. O anticorpo HMB-45 foi descrito como sendo específico e altamente sen-sível para melanoma e nevos juncionais. O anticorpo mono-clonal NKI-beteb reage com as células de melanoma durante toda a evolução do tumor. O anticorpo cora os nevos nevoce-lulares, o melanoma cutâneo primário e uveal, e suas metásta-ses. Os antígenos reconhecidos pelo o anticorpo NKI-beteb são as glucoproteínas de 100kDa (gp 100) e 7kDa (gp 7), que são localizadas no lado interior das vesículas pré-melanosso-mais. Conseqüentemente, o padrão de pigmentação entre NKI-beteb e HMB-45 é diferente. Sendo um anticorpo contra
cent melanocytes via direct interaction with the melanocyte's KITreceptor.28
Melanocyte-lineage markers: NKI-beteb, HMB-45 and Mel-5
Earlier research on melanocytes was based on chemical stains such as Fontana-Masson or DOPA-oxidase stain, requiring the presence of active melanogenesis. Consequently, the melanocytes were classified into two morphologically and functionally different types: active or DOPA-positive, and inactive or DOPA-negative.
Anagen hair follicles have active melanocytes in the wall of the pilary canal (infundibulum), and in the pigmented part of the bulb, close to the upper part of the dermal papilla. Amelanotic melanocytes (DOPA-negative) have been observed along the outer root sheath of the middle and lower part of the follicle. Under certain condi -tions, such as after irradiation with X-rays, after der-mabrasion, after exposure to ultraviolet rays and after oral photochemotherapy, amelanotic melanocytes in the outer root sheath become producers of melanin.33,34,35
Regarding the distribution of these active and inactive melanocytes, Staricco divided the hair follicle into four parts. The upper part of the follicle (infundibulum) and the upper part of the bulb in contact with the upper papilla correspond to portions A and D, which are melanotic por-tions. The middle and lower follicle is portion B, possess-ing amelanotic melanocytes. The generally amelanotic outer root sheath of the bulb and hair matrix below the "critical" level correspond to portion C. The critical level refers to a line drawn through the widest part of the fol -licular dermal papilla, which separates the germinative center of the follicle (matrix) below from the differentiat -ing cells (upper bulb) of the hair and root sheath above, described by Auber36 in follicles of the sheep and
Montagna37in human hair follicles.
More recently, however, monoclonal antibody tech-nology has allowed the development of antibodies that are important tools to identify differences among populations of melanocytes. This approach is useful in understanding the biology of the interrelationships between these cells, as well as in its clinical use.
HMB-45 and NKI-beteb antibodies are described as recognizing protein products encoded by a single cDNA, gp100-c1, that is homologous to the human silver locus gene, Pmel 17.38The antigen recognized by
Figure 1: Immunohistochemistry of human melanocytes in frozen sections of hair follicle from human scalp, using NKI-beteb antibody (Monosan, Uden, The Netherlands). Positive cells were found in the hair bulb, the lower edges of the hair bulb and the outermost layer of the outer root sheath in the lower follicle (arrows). The arrowheads show less diferentiated melanocytes (dopa-negative
melanocytes).60X.
Figura 1: Imuno-histoquímica de melanócitos humanos em seções congeladas do folículo piloso a partir do couro cabeludo, utilizando o anti-corpo NKI-beteb (Monosan, Uden, Holanda). Algumas células positivas foram encontradas no bulbo piloso,
nas bordas inferiores do bulbo piloso e na camada mais distante da bainha externa da raiz no folículo inferior (veja flechas). As pontas das flechas indicam melanócitos menos diferenciados (melanócitos dopa-negativos) 60X.
7 kDa (gp 7), localized at the inner side of premelanoso-mal vesicles. Consequently, the staining pattern between
NKI-beteb and HMB-45 is different. Being an antibody to a melanosome-related cytoplasmic antigen, HMB-45 stains epidermal and hair bulb melanocytes.39 These
melanocytes also stain with tyrosinase, TRP-1 and TRP-2, and DOPA, which means they contain later structural pro -teins (melanosomes) or enzymatic pro-teins (tyrosinase, related-proteins). In contrast, NKI-beteb, which recog-nizes premelanosome- and melanosome-related antigens of different molecular weights,40 stains dopa-positive
melanocytes in the epidermis and in the hair bulb as well as DOPA-negative melanocytes in the outer root sheath (Figure 1). The capacity of this antibody to stain these DOPA-negative melanocytes is especially important to detect dormant melanocytes.
Mel-5 is a mouse monoclonal antibody developed in 1985 by Thompson et al.41against a
pigmentation-associa-ted glycoprotein of human melanoma and melanocytes. This glycoprotein has a molecular weight of 75kDa and is iden-tical to the previously recognized gp75 pigment-associated glycoprotein.42Mel-5 has been described as a precious tool
for evaluation of normal and abnormal epidermal melanocytes, and some cases of dermal melanocytic lesions.43
A recent study proposed the existence of three differ -ent populations of melanocytes in the hair follicle and epi-dermis based on the expression of different proteins.44 The
first population corresponds to the classic follicular melanocyte in the hair bulb, above the dermal papilla cells, which are shown actively producing melanin and exhibiting melanocyte-lineage markers, such as NKI-beteb, HMB-45
o antígeno citoplásmico relacionado ao melanossoma, HMB-45 cora os melanócitos da epiderme e do bulbo piloso. Esses melanócitos coram-se também com tirosinase, 1 e TRP-2, e Dopa, o que significa que eles contêm as proteínas estru-turais de melanossomas e as proteínas enzimáticas (tirosinase e proteínas relacionadas). Em contraste, o NKI-beteb, que reconhece antígenos relacionados com pré-melanossoma e melanossoma de peso molecular diferente, cora tanto os mela-nócitos dopa-positivos na epiderme e no bulbo piloso quanto os melanócitos dopa-negativos na bainha radicular externa (Figura 1). A capacidade desse anticorpo para corar os mela-nócitos dopa-negativos é particularmente importante para detectar os melanócitos dormentes.
Mel-5 é um anticorpo monoclonal de camundongo desenvolvido em 1985 por Thompson et al.41 contra uma
glicoproteína associada à pigmentação de melanoma huma-no e melanócitos. A glicoproteína tem o peso molecular de 75kDa e é igual à glicoproteína gp75 anteriormente reco-nhecida associada à pigmentação.42Mel-5 tem sido descrito
como uma ferramenta preciosa para avaliar os melanócitos epidérmicos normais e anormais, e alguns casos de lesões melanocíticas dérmicas.43
Um estudo recente, com base na expressão de pro-teínas diferentes,44propõe a existência de três
subpopula-ções distintas de melanócitos no folículo piloso e na epi-derme. A primeira corresponde ao melanócito folicular clássico no bulbo piloso, acima das células da papila dér-mica. Essa subpopulação é responsável pela produção ativa de melanina e apresenta os indicadores da linhagem de melanócitos, tais como NKI-beteb, HMB-45 (Figura 2) e Mel-5, além do receptor c-kite a proteína Bcl-2. A
Figura 2: Imuno-histoquímica de melanócitos humanos em seções congeladas do folículo piloso a partir do couro cabeludo,
utilizan-do o anticorpo HMB-45 (Dako, Dinamarca). Algumas células positivas foram encontradas apenas no bulbo piloso 60X.
principalmente no infundíbulo e na epiderme, e também poucos mela-nócitos achados nas bordas infe-riores do bulbo piloso e na camada exterior da bainha radicular exter-na no folículo inferior. Essas célu-las não apresentam melanina evi-dente e mostram todos os três indi-cadores da linhagem de
melanóci-tos, bem como o c-kite Bcl-2. Finalmente, a terceira
sub-população distribui-se especialmente na camada exterior da bainha radicular externa, abaixo das glândulas sebá-ceas, mas é encontrada também em todas as regiões acima mencionadas. Esses melanócitos não apresentam melani-na evidente e só são corados com o anticorpo NKI-beteb (Figura 1).
Melanócitos de célula germinativa do folículo piloso A homeostase da epiderme e do folículo piloso, como em todos os tecidos auto-regenerativos, é considerada dependente das células germinativas. As células germinati-vas são relativamente indiferenciadas, tanto na forma ultra-estrutural quanto na forma bioquímica. Elas possuem um grande potencial proliferativo e são responsáveis pela manu-tenção e a regeneração de longa duração do tecido. Apresentam normalmente ciclo lento, presumidamente para conservar seu potencial proliferativo e para minimizar os erros de DNA que possam ocorrer durante a replicação. Podem ser estimuladas para proliferar em resposta à cicatri-zação e a certos estímulos de crescimento. Muitas vezes são localizadas próximo à população de células em rápida proli-feração, ou seja, as células transientes amplificadoras (TA), tal como neste esquema: célula germinativa àcélula TA à célula diferenciada terminalmente. E, finalmente, as células germinativas são em geral encontradas numa região bem protegida, altamente vascularizada e inervada.45
O grande potencial de proliferação das células germina-tivas é importante no momento da expansão tecidual, tal como no desenvolvimento fetal e na cicatrização. Outrossim, elas também são importantes em situações de formação de tumores.
Com respeito à epiderme, as células germinativas são descritas localizadas na camada basal, expressando níveis mais altos de integrina b1.46
(Figure 2), and Mel-5, in addition to c-kit receptor and Bcl-2 protein. The second population includes melanocytes located mainly in the infundibulum and epidermis, but also a very few melanocytes found in the lower edges of the hair bulb and the outermost layer of the outer root sheath in the lower follicle. These cells show no obvious melanin and exhibit all the three melanocyte-lineage markers, as well as c-kit and Bcl-2. Finally, the third population is distributed particularly in the outer layer of the outer root sheath below the level of sebaceous glands, but it is also seen in all the
aforemen-tioned regions. These melanocytes show no obvious melanin and are stained only with NKI-beteb antibody (Figure 1).
Hair follicle stem cell melanocytes
The homeostasis of epidermis and hair follicle, like all self-renewing tissues, is thought to be depend-ent on stem cells. Stem cells are relatively undifferdepend-enti- undifferenti-ated, both ultrastructurally and biochemically. They have a large proliferative potential and are responsible for the long-term maintenance and regeneration of the tissue. They are normally slow-cycling, presumably to conserve their proliferative potential and minimize DNA errors that could occur during replication. They can be stimulated to proliferate in response to wound-ing and to certain growth stimuli. They are often locat-ed in close proximity to a population of rapidly prolif-erating cells, the transient amplifying (TA) cells, as in the following scheme: stem cellàTA cellàterminally differentiated cell. And finally, they are usually found in a well-protected, highly vascularized and innervat-ed area.45
The high potential of proliferation of stem cells is important at times of tissue expansion, such as fetal devel-opment and wound healing. Likewise, it is also important in situations of tumor formation.
In respect to epidermis, stem cells are described as located in the basal layer expressing higher levels of b1
integrin.46
There are two theories about the localization of
stem cells in hair follicles. Initially, stem cells were thought to reside in the matrix cells of the bulb area because these cells showa high proliferating rate, which is very important in the growing phase of the hair folli-cle. And they are located near the dermal papilla cells, which are involved in activation of the hair growth. However, the lower follicle epithelial cells undergo extensive programmed cell death at the end of the growth phase. Therefore, the present theory asserts that a long-lived epithelial cell in the follicle is of secondary importance to a wellpreserved mesenchymal signal from der -mal papilla, which can also induce follicle growth from epithelium that is not usually associated with hair for-mation.47
Another theory asserts that there is a long-lived population of cells in the bulge area of the follicle, which are able to trigger the new inferior cycling portion of the follicle when receiving a proper stimulus.48,49,50 In
agree-ment with this theory, human hair follicle stem cells have been identified by using the antibody C8/144B, that rec -ognizes cytokeratin 15 in keratinocytes located in the bulge area of the hair follicle.51 There has been special
reference made to the bulge area as a possible reservoir of melanocytes.8
In spite of these studies, the reservoir of less dif-ferentiated melanocytes in the hair follicle still remains unclear.
Melanocytes and androgens
Androgens are the dominant hormonal influence on human hair growth.52 The effect of these hormones on
human hair follicles is generally gradual and very site-specific. The pattern of secondary sexual hair growth on beard, trunk and limbs is established after puberty by a dramatic, androgen-dependent increase in hair follicle size. Conversely, on the frontal region of the scalp in most men and on the vertex of some genetically predisposed men and women, androgens produce characteristic bald-ness patterns (Androgenetic Alopecia). Furthermore, they are implicated in the etiology of hirsutism. On the other hand, the most dramatic evidence of the effect of andro -gens is the total absence of any sexual hair growth, including axillary and pubic hair in XY adults with com-plete androgen-insensitivity syndrome (testicular femi-nization), which means lacking functional androgen receptors. Also, in this condition, individuals do not exhib-it male-pattern baldness.
In addition to participate in the control of hair growth, androgens are believed to have a role in the pig-mentation process. Physiologically, gonadal androgens are considered to be responsible for skin pigmentation in the genital areas and nipple. A decrease of skin pigmen-tation is observed after castration and administration of androgen causes skin darkening of these regions.53
Although many humoral factors are believed to be
Há duas teorias sobre a localização das células germi-nativas no folículo piloso. Inicialmente, pensou-se que elas ficavam entre as células da matriz da região do bulbo devido ao fato dessas células apresentarem alta taxa de proliferação, o que é muito importante na fase de crescimento do folículo piloso. Além disso, as células da matriz estão localizadas pró-ximo às células da papila dérmica, as quais, por sua vez, são envolvidas na ativação do crescimento do cabelo. Contudo, as células epiteliais do folículo inferior sofrem extensa morte celular programada no fim da fase de crescimento. Assim, a teoria presente afirma que a célula epitelial de vida longa no folículo é de importância secundária a um sinal mesenquimal bem preservado a partir da papila dérmica, estrutura essa que pode também induzir o crescimento folicular a partir do epi-télio, o qual não está normalmente associado com a formação do cabelo.47
Outra teoria afirma que há uma população celular de vida longa na região "bulge", que tem a capacidade de interagir com células da porção inferior do folículo e diante de um esti-mulo correto iniciar nova fase anágena.48,49,50De acordo com
essa teoria, as células germinativas do folículo piloso humano têm sido identificadas pela utilização do anticorpo C8/144B, que reconhece a citoceratina 15 nos ceratinócitos localizados na região "bulge".51Uma referência especial à região infundibular
como possível reservatório de melanócitos tem sido aventada.8
Apesar desses estudos, o reservatório de melanócitos menos diferenciados no folículo piloso ainda permanece incerto.
Melanócitos e andrógenos
Os andrógenos constituem a influência hormonal dominante no crescimento de cabelo humano.52O efeito
des-ses hormônios nos folículos pilosos é geralmente gradual e muito específico do local. O padrão do crescimento de cabe-lo sexual secundário na barba, no tronco e nos membros se estabelece após a puberdade, evidenciado pelo aumento do tamanho do folículo piloso. Ao contrário, na região frontal do couro cabeludo na maioria dos homens e no vértice da cabeça de alguns homens e mulheres geneticamente predis-postos, os andrógenos produzem os padrões característicos de calvície (alopecia androgenética). Além disso, nas mulhe-res eles são implicados na etiologia do hirsutismo. Por outro lado, a evidência mais dramática do efeito dos andrógenos é a ausência total do crescimento de pêlos sexuais, até mesmo axilar e púbico nos adultos XY, com síndrome completa de insensibilidade ao andrógeno (feminização testicular), o que significa uma falha dos receptores androgênicos funcionais. Nessa condição, também, os pacientes não apresentam cal-vície de padrão masculino.
fato-res humorais estejam envolvidos no processo de pigmentação da pele, os mecanismos específicos não são completamente compreendidos. O processo de pigmentação do cabelo, tam-pouco é bem esclarecido atualmente.
O modelo atual relativo à ação dos andrógenos sobre o folículo piloso sugere que esses esteróides atuem por meio das células da papila dérmica. Conseqüentemente, as células da papila dérmica modificariam sua produção de mensagei-ros locais, provavelmente de fatores de crescimento e/ou de fatores indutores de matriz extracelular, os quais por sua vez atuariam na divisão celular na atividade de outras células foliculares, particularmente os ceratinócitos e os melanóci-tos. Essa hipótese é defendida em muitos estudos. A presen-ça dos receptores de andrógenos nas células da papila dérmi-ca foi detectada por imuno-histoquímidérmi-ca.55 Foi verificado
que os andrógenos e os antiandrógenos exercem influência no crescimento in vitrodessas células.56,57Além disso, essa
hipótese se baseia nas interações mesenquimais e epiteliais, que são bem conhecidas como implicadas no desenvolvi-mento embriônico de muitos outros tecidos, incluindo aque-les dependentes de esteróides, como a próstata.58
Em relação às células melanocíticas, alguns estudos têm demonstrado que os melanócitos genitais humanos são alvo para a ação dos andrógenos. Contudo, nenhuma demonstração da presença de receptores de andrógenos tem sido observada nos melanócitos do folículo piloso.59
CONCLUSÕES
O papel dos melanócitos foliculares no crescimen-to do cabelo e no processo de pigmentação é assuncrescimen-to de grande interesse na pesquisa sobre o cabelo. Muitas per-guntas sobre o destino e a atividade dos melanócitos durante o ciclo do cabelo, demandam respostas que facili-tarão a compreensão sobre o envolvimento dos melanóci-tos foliculares no controle das mudanças dependentes desse ciclo. Ainda não se conhece o que acontece com es-sas células no final da fase de crescimento e qual a fonte dos melanócitos que repovoará o novo folículo no final da fase telógena. É necessário identificar o local do reserva-tório para os melanócitos foliculares, e se essas células são responsáveis por alguns sinais de comunicação molecular subjacentes às mudanças dependentes do ciclo. Além disso, é importante considerar que a melanogênese depen-dente do ciclo piloso e as atividades combinadas dos cera-tinócitos, das células da papila dérmica e dos melanócitos no folículo piloso constituem um modelo fascinante para o estudo das interações epiteliais, mesenquimais e neu-roectodérmicas.
Outro ponto a ser investigado na promissora pesqui-sa despesqui-sa área está focalizado na capacidade dos melanócitos foliculares de repigmentar a epiderme no vitiligo. E, ainda, a perspectiva da manipulação farmacológica seletiva dos melanócitos foliculares, pode tornar-se uma estratégia nova para o tratamento de doenças relacionadas, tal como a perda de cabelo, no caso dessas células realmente desempenharem
involved in the skin pigmentation process, the precise mechanisms are not completely understood. Likewise, the process of hair pigmentation is not well established at the moment.
The current model for the action of androgens on the hair follicle suggests that these steroids act via the cells of the dermal papilla.54Consequently, dermal
papil-la cells have altered their production of local messen-gers, probably growth factors and/or extracellular matrix factors, which modify the cell division and activ-ity of the other follicular cells, particularly keratinocytes and melanocytes. This hypothesis is supported by many different studies. The presence of androgen receptors in dermal papilla cells was detected by immunohistochem-istry.55Androgens and anti-androgens were
demonstrat-ed to have influence in the in vitro growth of dermal papilla cells.56,57 Furthermore, this hypothesis is based on
mesenchymal and epithelial interactions, which are well known to be involved in the embryonic development of many other tissues, including steroid dependent tissues such as the prostate.58
In relation to melanocyte cells, some studies have shown that human genital melanocytes are targets for the action of androgens.59However, there has been no
demon-stration of androgen receptor presence in hair follicle melanocytes.
CONCLUSIONS
The role of the follicular melanocytes in the hair growing and hair pigmentation process is a topic of remarkable interest in hair research. There are many questions about the fate and activity of these melanocytes during the hair cycle that invite a reply and will make it easier to understand whether follicular melanocytes are involved in the control of the cycle-dependent changes observed in the hair follicle. It is not as yet clear what happens to these cells at the end of the growing phase, or which is the source of melanocytes that repopulates the new lower follicle at the end of the telogen phase. It is necessary to identify where the reservoir for follicular melanocytes is found, and whether these cells are respon -sible for any molecular communication signals underly-ing the cycle-dependent changes. Furthermore, it is important to consider that haircycledependent melano -genesis and combined keratinocytes-dermal papilla cell-melanocyte activities in the hair follicle constitute a fas-cinating model for the study of epithelial-mesenchymal-neuroectodermal interactions.
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Os autores agradecem à Dra. Valerie A. Randall do Departamento das Ciências Biomédicas, University of Bradford, no Reino Unido, pela orientação valiosa e pelo apoio.
ACKNOWLEDGMENTS
The authors would like to thank Dr Valerie A Randall from the Department of Biomedical Sciences, University of Bradford-UK, for valuable discussion and encouragement.
um papel ativo na regulação do crescimento do cabelo. Finalmente, considerando que a cor do cabelo é um sinal de comunicação social e psicologicamente significan-te, a capacidade de mudar o tipo predominante de melani-na produzida pelos melanócitos foliculares, para mudar a cor do cabelo definitivamente ou induzir a repigmentação do cabelo branco senil, seria claramente uma questão de grande repercussão para a indústria cosmética. q
active role in hair growth regulation.
And finally, since hair color is a socially and psy-chologically significant communication signal, knowing how to switch the predominant type of melanin generated by follicular melanocytes so as to change hair color per-manently, or knowing how to induce re-pigmentation in senile white hair clearly has great repercussions for the
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