PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM BIOANÁLISES
VALORES DE REFERÊNCIA PARA COBRE E ZINCO NO PLASMA E
NO ERITRÓCITO EM ADULTOS UNIVERSITÁRIOS NA CIDADE DE
NATAL-RN
Débora Azevedo do Nascimento
NATAL
DÉBORA AZEVEDO DO NASCIMENTO
VALORES DE REFERÊNCIA PARA COBRE E ZINCO NO PLASMA E
NO ERITRÓCITO EM ADULTOS UNIVERSITÁRIOS NA CIDADE DE
NATAL-RN
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas da UFRN, Área de Concentração em Bioanálises, como requisito para a obtenção do título de Mestre.
Orientadora: Profª Drª Lucia de Fátima Campos Pedrosa Schwarzschild.
DÉBORA AZEVEDO DO NASCIMENTO
VALORES DE REFERÊNCIA PARA COBRE E ZINCO NO PLASMA E
NO ERITRÓCITO EM ADULTOS UNIVERSITÁRIOS NA CIDADE DE
NATAL-RN
BANCA EXAMINADORA
Profª Drª Lucia de Fátima Campos Pedrosa Schwarzschild
Orientadora
Profª Drª Lucia Kiyoko Ozaki Yuyama
1° Avaliador
Profº Drº Kenio Costa Lima
2º Avaliador
AGRADECIMENTOS
A Deus, pelos cuidados com minha saúde e possibilidade de concluir esse trabalho.
Aos meus Pais, Francisco e Maria, pela compreensão, confiança, dedicação e incentivo desde o início da minha vida acadêmica.
Aos meus Padrinhos, Raimundo e Judite, “in memorian”, fundamentais e grandes incentivadores no início da minha vida acadêmica.
À minha orientadora, Profª Lucia, pela orientação, compreensão e paciência extra, porém, mais do que ter me proporcionado esse amadurecimento e avanço acadêmico, agradeço-lhe principalmente pelos “presentes” humanos, preciosíssimos, concedidos durante esse período.
A Anna Cecília (o “presente maior”), pela amizade, companheirismo, carinho, incentivo, empurrões e injeções de glicose nas minhas constantes hipoglicemias. Qualquer coisa dita ou escrita não expressará o meu carinho e admiração por essa pessoa das “nuvens-de-algodão-doce”.
A Aline Nara, por cuja ajuda, profissionalismo e competência, tornou-se essencial e titular absoluta da nossa Equipe, e sem a qual as coletas de material biológico talvez nem acontecessem.
Ao Prof° Kênio, pelo esforço, paciência, dedicação e contribuição ímpar nas análises e interpretação dos dados.
À Profª Graça, por possibilitar e contribuir diretamente com as análises, especialmente as espectrofotométricas.
Ao Prof° Roberto Dimenstein, pelo apoio moral e por abrir as portas do Departamento de Bioquímica para a nossa Equipe.
À Profª Teresa Medeiros, pela paciência nas dúvidas constantes no início do trabalho e por abrir as portas do laboratório de hematologia para a nossa Equipe.
Ao Técnico Tyrone, pela contribuição nas análises espectrofotométricas.
À nutricionista Cristiane (a “pequena CHS”, assim carinhosamente “batizada”), pela amizade e colaboração incondicional.
Às bolsistas Adriana, Gislaine e ainda mais especialmente a Lorena, Diana,
Daniele, Suzylane (Suzy), Aline e Rayane.
A Niethia, pela amizade, incentivo e por compartilhar das mesmas angústias e alegrias.
Às amigas de longa jornada Ana Kalina e Ana Karina, pela amizade e incentivo.
À Doninha, Seu Durval, Mara Regina e Sérgio, pelas incontáveis vezes que abusei de toda a família e, ainda assim, sorriem para mim e continuam me acolhendo.
Aos colegas do laboratório multidisciplinar.
Ao Laboratório Integrado de Análises Clínicas da UFRN.
Aos Departamentos de Nutrição; Bioquímica; e Análises Clínicas e Toxicológicas da UFRN.
Aos meus primos Tácito, Alexandra e Lídia, pela colaboração direta.
À minha Tia Ana Irene (...) por tudo (...).
A Andréa, Elizângela, Jaquelígia e, mais recentemente, Raquel e Celmara, pelas alegrias e conversas de fim de noite.
Aos funcionários Leila Rosa, Aureliana e Erivan.
A todos os estudantes voluntários da pesquisa.
Aos muitos que contribuíram direta ou indiretamente para a realização desse trabalho, e
“Diga o que você pensa, com esperança.
Pense no que você faz, com fé.
Faça o que você deve fazer, com amor!”
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS RESUMO
ABSTRACT
1. INTRODUÇÃO... 12
2. REVISÃO DA LITERATURA... 14
2.1.COBRE... 14
2.1.1. Funções do cobre no organismo... 14
2.1.2. Biodisponibilidade do cobre... 14
2.1.3. Absorção, metabolismo e excreção do cobre... ... 15
2.1.4. Deficiência de cobre no organismo... 17
2.1.5. Recomendações e toxicidade do cobre... 18
2.2. ZINCO... 19
2.2.1. Funções do zinco no organismo... 19
2.2.2. Biodisponibilidade do zinco... 20
2.2.3. Absorção, metabolismo e excreção do zinco... 21
2.2.4. Deficiência de zinco no organismo... 22
2.2.5. Recomendações e toxicidade do zinco... 23
2.3. AVALIAÇÃO DO ESTADO NUTRICIONAL DE COBRE E ZINCO... 24
2.3.1. Parâmetros bioquímicos e teciduais... 24
2.4. VALORES DE REFERÊNCIA... 26
4. OBJETIVOS... 31
4.1. OBJETIVO GERAL... 31
4.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS.... 31
5. CASUÍSTICA E MÉTODOS... 32
5.1. PROTOCOLO EXPERIMENTAL... 32
5.2. PARÂMETROS ANTROPOMÉTRICOS... 36
5.3. ANÁLISE E ADEQUAÇÃO DOS NUTRIENTES DA DIETA... 37
5.4. DETERMINAÇÃO DE COBRE E ZINCO... 38
5.4.1. Material e procedimentos... 38
5.4.1.1. Lavagem de utensílios... 38
5.4.1.3. Controle de qualidade... 39
5.4.1.4. Coleta e separação do material biológico... 39
5.4.1.5. Determinação de cobre no plasma e no eritrócito... 39
5.4.1.6 Determinação de zinco no plasma e no eritrócito... 40
5.5. ANÁLISE ESTATÍSTICA... 41
6. RESULTADOS... 42
6.1. CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA... 42
6.2. ANÁLISE DOS NUTRIENTES DA DIETA... 45
6.3. AVALIAÇÃO DE COBRE NO PLASMA E NO ERITRÓCITO... 47
6.4. AVALIAÇÃO DE ZINCO NO PLASMA E NO ERITRÓCITO... 52
7. DISCUSSÃO... 57
7.1. CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA... 57
7.2. ANÁLISE DA DIETA... 58
7.3. COBRE NO PLASMA E NO ERITRÓCITO... 61
7.4. ZINCO NO PLASMA E NO ERITRÓCITO... 63
8. CONCLUSÕES... 66
9. RECOMENDAÇÕES... 67
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 68
LISTA DE ABREVIATURAS
CB ... Centro de Biociências
CCET ... Centro de Ciências Exatas e da Terra
CCHLA ... Centro de Ciências Humanas, Letras e Artes
CCS ... Centro de Ciências da Saúde
CCSA ... Centro de Ciências Sociais Aplicadas
CRIP’s .... Proteínas Intestinais Ricas em Cisteína
CT ... Centro Tecnológico
DRI …….. Dietary Reference Intake
EAR ……. Estimated Average Requirement; EER ……. Estimated Energy Requirement
ENDEF .... Estudo Nacional de Despesa Familiar
IMC ... Índice de Massa Corporal
NDTiC ... Núcleo do Desenvolvimento do Tirocínio Científico
POF’s ... Pesquisa de Orçamento Familiar
RDA ……. Recommended Dietary Allowance
SPSS... Statistical Package for the Social Sciences TCLE ... Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
RESUMO
O estudo teve como objetivo construir valores de referência para cobre e zinco, de adultos saudáveis na cidade do Natal-RN, e identificar a influência do gênero, idade, índice de massa corporal (IMC) e dieta, sobre esses valores. Foram avaliados 123 estudantes saudáveis da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), de ambos os gêneros, com idade entre 19 e 41 anos. O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UFRN. Foi estimado o indice de massa corporal e realizado um recordatório alimentar de 24h. A dieta foi avaliada quanto a energia, macronutrientes, cobre e zinco, segundo as recomendações da National Academy of Sciences (2001; 2002). As concentrações de cobre e zinco no plasma e no eritrócito foram realizadas por espectrofotometria de absorção atômica de chama. A casuística apresentou-se bastante homogênea quanto à distribuição por gênero e idade, estando o maior número de indivíduos entre os 19 e 24 anos. A maioria dos voluntários apresentou estado nutricional antropométrico dentro dos padrões de normalidade. Antecedentes familiares de doenças crônicas e sedentarismo foram observados. A dieta caracterizou-se com baixo consumo de zinco, adequado de cobre e de lipídeos. As concentrações médias de cobre no plasma (p=0,002), cobre no eritrócito (μg/dL, p=0,036; μg/gHb, p=0,038), e zinco no plasma (p=0,022), foram estatisticamente diferentes entre os gêneros, o que foi demonstrado pelos maiores valores de cobre do gênero feminino e maiores de zinco no masculino. Os valores de cobre no plasma sofreram ainda interferência das variáveis: ingestão de calorias, carboidrato e cobre na dieta, todos categorizados de acordo com a mediana, além da proteína categorizada segundo o percentual de contribuição para o valor calórico total (VCT) da dieta. O estudo permitiu estabelecer valores de referência para zinco no eritrócito, correspondentes a 1.261,6-1.344,0 μg/dL e 51,0-54,3 μg/gHb, e sugerir “indicativos” de valores de referência para cobre no plasma (108,4 – 130,2 μg/dL), no eritrócito (feminino = 85,0 – 91,4 μg/dL; masculino = 80,2 – 86,5 μg/dL) e zinco no plasma (feminino 98,8 – 105,8 = μg/dL; masculino 104,6 – 111,6 = μg/dL).
ABSTRACT
This study aimed builds reference values for copper and zinc, of healthy adults in Natal-RN, and to identify the influence of the gender, age, body mass index (BMI) and diet, on those values. They were assessed 123 healthy students of the Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), both genders, with age between 19 and 41 years. The project was approved by the Ethics Committee in Research of UFRN. BMI was determined and the food consume was accomplished through a 24h recordatory. Dietary was evaluated as the energy, macronutrients, copper and zinc, according to the recommendations of National Academy of Sciences (2001; 2002). Analyses of the copper and zinc concentrations in the plasma and erythrocytes were accomplished by flame atomic absorption spectrometry. The casuistic came quite homogeneous as for the distribution for gender and age, being the largest number of individuals between the 19 and 24 years old. Most of the volunteers presented anthropometric nutritional state inside of the normality patterns. Chronic diseases family antecedents and sedentarysm were observed. Diet was characterized with low consumption of zinc, appropriate of copper and of lipids. Average concentrations of plasma copper (p=0,002), erythrocyte copper (μg/dL, p=0,036; μg/gHb, p=0,038), and plasma zinc (p=0,022) were different among the genders, what was demonstrated by the largest values of copper in the female gender and larger of zinc in the masculine. Plasma copper values still suffered interference of the variables: energy, carbohydrate and copper consumption, all classified in agreement with the median, besides the protein classified according to the percentage contribution for the dietary total energy. The study allowed to establish reference values for erythrocyte zinc (1.261,6-1.344,0 μg/dL e 51,0-54,3 μg/gHb) and to suggest "indicative" of reference values for plasma (108,4 – 130,2 μg/dL) and erythrocyte (female = 85,0 – 91,4 μg/dL; masculine = 80,2 – 86,5 μg/dL) copper and plasma zinc (female = 98,8 – 105,8 μg/dL; masculine = 104,6 – 111,6 μg/dL).
1. INTRODUÇÃO
Valores de referência resultam da medida ou observação de um analito em uma amostra biológica de indivíduos integrantes de um grupo amostral de referência. Tais valores, referentes a elementos traço encontrados em tecidos e fluidos corporais humanos, representam um importante indicador para o estado de saúde da população geral, de grupos ocupacionais ou grupos acidentalmente expostos a metais. Contudo, podem sofrer influência de fatores como estilo de vida e hábitos alimentares. A disponibilidade de valores de referência acurados torna possível criar para a população geral limites de exposição a elementos traço para a proteção de indivíduos saudáveis, ou mesmo, prover bases científicas para pesquisas biomédicas envolvendo doenças relacionadas a minerais (CAROLI et al., 1994; KUČERA et al., 1995).
A primeira doença ligada ao metabolismo do cobre foi a de Wilson, um erro inato do metabolismo no qual há acúmulo de cobre no fígado. A Doença de Menkes, um transtorno da absorção do cobre, foi descrita cerca de cinqüenta anos depois. Desde 1950, cada vez mais, determinadas doenças têm sido associadas com concentrações alteradas de cobre, geralmente elevadas, no sangue ou em alguns outros tecidos (TURNLUND, 1999).
O cobre age como um importante cofator catalítico de enzimas que realizam funções biológicas fundamentais durante o crescimento e o desenvolvimento humano (PEÑA et al., 1999). As manifestações bioquímicas e clínicas da deficiência de cobre refletem anormalidades diretamente relacionadas às funções das enzimas dependentes desse mineral (OLIVARES et al., 2000).
Devido às suas inúmeras funções no organismo, o zinco constitui-se o mineral de maior interesse, tanto na prática médica como na pesquisa acadêmica de âmbito multidisciplinar (JACKSON; LOWE, 1992; AGGETT; COMERFORD, 1995). O zinco está envolvido na atividade de mais de 300 enzimas, e é reconhecido como um nutriente essencial para o crescimento, desenvolvimento, atividade imunológica e ação antioxidante (McCALL et al., 2000; SALGUEIRO et al., 2002).
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. COBRE
2.1.1. Funções do cobre no organismo
As funções do cobre no organismo estão diretamente ligadas ao seu papel nas várias metaloenzimas (citocromo oxidase, lisil oxidase, ceruloplasmina, superóxido dismutase, tirosinase, dopamina β-monoxigenase) que agem, em sua maioria, como oxidases na redução do oxigênio molecular. As aminas oxidases, enzimas que dependem de cobre para sua atividade, podem participar de reações com diferentes efeitos, tais como a inativação da histamina liberada durante reações alérgicas, o metabolismo de catecolaminas e o desenvolvimento de tecido conectivo (NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, 2001a).
Ferroxidases são enzimas plasmáticas que utilizam cobre para oxidação do ferro ferroso necessária à ligação do ferro com a transferrina. A ceruloplasmina, uma ferroxidase, responsável pela concentração de cobre no plasma, também exerce função antioxidante (HELLMAN; GITLIN, 2002). As enzimas cobre-zinco superóxido dismutase e citocromo oxidase, que desempenham função antioxidante intracelular, utilizam átomos de cobre nos seus sítios catalíticos (UAUY et al., 1998). Outras enzimas dependentes de cobre estão envolvidas na produção de
neurotransmissores, como a dopamina β-monoxigenase, e na formação de
melanina, como a tirosinase (NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, 2001a).
2.1.2. Biodisponibilidade do cobre
O cobre é amplamente distribuído nos alimentos, sendo considerados fontes os mariscos, fígado, rim, chocolate, nozes e leguminosas secas (PEDROSA; COZZOLINO, 2001; ANDERSON, 2002). A quantidade de cobre na dieta é o fator mais importante para a biodisponibilidade. Contudo, a sua forma química e outros constituintes dos alimentos podem afetar a absorção (ÖZÇELIK et al., 2002).
1998a), principalmente quando a proteína é de origem animal (OLIVARES et al., 2000).
Quantidades elevadas de ferro, molibdênio e principalmente zinco afetam negativamente a biodisponibilidade do cobre (TURNLUND, 1999; ÖZÇELIK et al., 2002). No entanto, ainda não estão claros os reais efeitos do consumo de fibras vegetais, ácido fítico, frutose e ácido ascórbico sobre a disponibilidade do cobre no organismo humano (OLIVARES et al., 2000). Contudo, segundo a Organização Mundial de Saúde (1998a), esses efeitos parecem ocorrer na presença de quantidades elevadas dessas substâncias (fibra > 50g/dia; açúcares > 35% do valor energético total; ácido ascórbico >1.550 mg/dia). Condições associadas com má-absorção de macronutrientes, bem como doenças gastrointestinais, podem prejudicar a captação e contribuir para um estado subótimo de cobre (WAPNIR, 1998).
2.1.3. Absorção, metabolismo e excreção do cobre
O cobre é absorvido principalmente no intestino delgado, e uma pequena parte, no estômago. A eficiência da absorção de cobre é dose dependente, variando inversamente com o consumo (WAPNIR, 1998). Observou-se que, à medida que o cobre aumenta na dieta, a absorção declina de 75% para 12%, sugerindo que a regulação da absorção desse mineral ajuda a manter a sua homeostasia (TURNLUND, 1999).
Sugere-se que, baixas concentrações de cobre na dieta, provavelmente, induzem um mecanismo de transporte ativo saturável, enquanto altas concentrações levam a uma absorção por difusão passiva (TURNLUND, 1998; LINDER et al., 2003). Dentro da célula da mucosa intestinal o cobre captado é retido temporariamente por ligantes de natureza aminoacídica e pela metalotioneína, que parece não ter uma função direta na captação do mineral pela célula, mas na liberação para a corrente sangüínea, regulando o organismo contra a toxicidade (DICHI; BURINI, 1991; PEDROSA; COZZOLINO, 1999; TAPIERO et al., 2003).
Ligado à ceruloplasmina no fígado, o cobre é transportado para os tecidos e captado por meio de receptores específicos, onde ocorre a dissociação da ceruloplasmina e a liberação para o interior da célula. Nos tecidos o cobre encontra-se ligado à metalotioneína e outros ligantes específicos (TURNLUND, 1998; HARRIS, 2000; SPEISKY et al., 2003).
Normalmente, o cobre é retido em pequenas quantidades teciduais devido a facilidade de absorção e de excreção pela maioria dos mamíferos (LINDER et al., 1998). Estima-se que o corpo humano adulto possui cerca de 80 mg de cobre, sob a forma de complexos orgânicos, podendo variar de 50 a 120mg (ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DE SAÚDE, 1998a).
A principal via de excreção do cobre é a biliar, forma pouco reabsorvível, em proporções maiores que as outras secreções gastrointestinais (LINDER et al., 1998). Essa fração de cobre combina-se com uma pequena quantidade do cobre oriundo da descamação das células intestinais, dos líquidos pancreático e intestinal e do cobre dietético não absorvido, sendo então eliminado nas fezes. Outras vias de excreção de cobre, como perdas urinárias, no suor e as tegumentares, são pouco expressivas, considerando-se as perdas totais de cobre (TURNLUND, 1998).
A regulação homeostática da absorção e excreção de cobre age contra sua deficiência e intoxicação, mesmo quando há ampla variação na quantidade de cobre ingerido. Dentro da célula, o cobre é mantido por um sistema integrado de uma série de proteínas de membrana e pequenos peptídeos solúveis, dos quais depende o transporte e o metabolismo do mineral (HARRIS, 2000).
Nos tecidos, a conservação do cobre é órgão dependente e se dá em resposta à sua restrição dietética. Isto é, em situações de ingestão de cobre diminuída, o fígado restringe a sua liberação para o plasma, no momento em que a
quantidade remanescente corresponda a 2,5 - 3,0 μg Cu/g de tecido,
aproximadamente 55 – 65% da sua concentração inicial, resultando em menor concentração plasmática de cobre. Contudo, quase não se observa mecanismos de conservação do cobre no plasma, diminuindo sua concentração em 99% durante um período de oito semanas de restrição, em contraste com uma redução de 3% no coração e de 1% no cérebro (LEVENSON; JANGHORBANI, 1994; LEVENSON, 1998).
LAGERWERF, 1986). O músculo esquelético parece conservar cobre em menor grau, podendo comportar-se como doador endógeno do mineral para outros órgãos, durante restrições prolongadas (LEVENSON; JANGHORBANI, 1994).
Dessa forma, não está claro se todos os órgãos usam o mesmo mecanismo de conservação em diferentes estágios de deficiência. Alguns mecanismos de conservação e/ou controle do cobre no organismo têm sido sugeridos, incluindo alterações na síntese e na taxa de degradação de cuproproteínas, na captação e trocas do cobre em células específicas e na utilização dos estoques que conduzem a mudanças na expressão gênica (LEVENSON, 1998).
A eliminação fecal é um indicador da homeostasia do cobre, pois alterações na circulação enterohepática e na secreção biliar podem influenciar a captação do mineral pela mucosa intestinal, na tentativa de manter suas concentrações no organismo (WAPNIR, 1998).
2.1.4. Deficiência de cobre no organismo
Evidências clínicas da deficiência de cobre em humanos não são encontradas com freqüência. Contudo, os recém-nascidos pré-termo, especialmente aqueles com muito baixo peso ao nascer, são os mais afetados devido ao seu reduzido estoque de cobre hepático e, ainda, ao aumento das necessidades, determinado pela alta taxa de crescimento em relação aos recém-nascidos a termo (UAUY et al., 1998; OLIVARES et al., 2000).
Indivíduos com síndromes de má-absorção também possuem risco de deficiência de cobre, que pode ser explicado pela maior perda de cobre no trato gastrointestinal (BESHGETOOR; HAMBIDGE, 1998; WAPNIR, 1998). Em adultos, a deficiência de cobre tem ocorrido mais freqüentemente em pacientes sob nutrição parenteral total a longo prazo, com manifestações que incluem anemia, granulocitopenia, anormalidades ósseas e na medula, elevadas concentrações séricas de zinco, baixas concentrações séricas de cobre e de ceruloplasmina (BESHGETOOR; HAMBIDGE, 1998).
cardiovasculares e alterações no metabolismo de glicose e de colesterol (ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DE SAÚDE, 1998a; BONHAM, M. et al., 2002).
As alterações hematológicas são caracterizadas pela existência de anemia hipocrômica, normocítica ou macrocítica, acompanhada por uma redução da contagem de reticulócitos, hipoferremia, neutropenia e trombocitopenia. Numa pequena proporção dos casos, há anemia microcítica. As alterações hematopoiéticas na deficiência de cobre não respondem à terapia com ferro, mas são rapidamente corrigidas pela suplementação de cobre, fomentando a opinião de que a anemia na deficiência de cobre é devida a um defeito na mobilização do ferro, resultante da atividade reduzida da ceruloplasmina (UAUY et al., 1998).
Tem sido demonstrado que a deficiência de cobre resulta em uma diminuição da ceruloplasmina circulante, com concomitante acumulação de ferro no fígado e em outros tecidos, sugerindo a participação da mesma na homeostasia do ferro (HELLMAN; GITLIN, 2002). Outras enzimas que dependem de cobre para exercerem suas funções, apresentam atividade diminuída quando há deficiência nas concentrações orgânicas do mineral (NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, 2001a).
Sugere-se que a deficiência de cobre possa causar danos ao sistema nervoso central durante a fase pré-natal. O déficit de cobre na alteração do neurodesenvolvimento tem sido postulado com base no alto conteúdo de cobre no cérebro, especialmente no gânglio basal, e na observação de deficiência mental grave, associada com o déficit tecidual de cobre no período pré-natal de portadores da síndrome de Menkes (UAUY et al., 1998).
2.1.5. Recomendações e toxicidade do cobre
avaliação de grupos, igual a 700 μg/dia (NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, 2001a).
Apesar dos efeitos tóxicos associados com exposição crônica a quantidades exacerbadas de cobre serem raros, acredita-se que a ingestão excessiva de cobre pode estar associada com a expressão de doenças que ocasionam dano hepático, como cirrose e toxicose idiopática, além da própria doença de Wilson. Contudo, o consumo de grandes quantidades de cobre pode provocar náusea, vômito, diarréia, dor abdominal, cólicas e dano celular oxidativo (OLIVARES et al., 2000). Dessa forma, o nível de ingestão máxima tolerável foi fixado em 10.000 μg/dia, baseado na proteção contra danos hepáticos (NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, 2001a).
2.2. ZINCO
2.2.1. Funções do zinco no organismo
As funções bioquímicas desse elemento traço podem ser evidenciadas pelo seu envolvimento na atividade de mais de 300 enzimas, como estabilizador da estrutura molecular dos constituintes subcelulares e de membrana, participando ainda, da síntese e degradação dos carboidratos, lipídios e proteínas. Além disso, desempenha papel essencial na transcrição e translação de polinucleotídeos, e conseqüentemente no processo de expressão genética (ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DE SAÚDE, 1998b; McCALL et al., 2000).
O zinco participa da regulação da diferenciação celular através da sua participação no sistema enzimático que influencia na diferenciação e divisão celular. A redução de zinco no meio extracelular resulta na diminuição da atividade da deoxitimidina quinase e dos níveis de adenosina-5-adenosina, sistemas que regulam diretamente síntese de DNA. O zinco também pode influenciar a regulação hormonal de divisão celular, especialmente o hormônio do crescimento (GH) e o fator I do crescimento dependente de insulina (IGF-I) (MAcDONALD, 2000).
função da imunidade celular e humoral (PRASAD, 1998; SHANKAR; PRASAD, 1998).
Foi evidenciada fundamentalmente a ação antioxidante do zinco por dois mecanismos: proteção de grupos sulfidrilas contra oxidação, e inibição da produção de espécies reativas de oxigênio por metais fisiológico do zinco como antioxidante de transição. Estes aspectos reforçam o papel do zinco como estabilizador de membrana plasmática, e de outras membranas de organelas encapsuladas (BRAY; BETTGER, 1990; POWELL, 2000). O zinco é um cofator necessário para algumas enzimas antioxidantes, em particular a superóxido dismutase, e portanto, alterações no metabolismo deste mineral podem contribuir para o dano tecidual oxidativo (POWELL, 2000).
2.2.2. Biodisponibilidade do zinco
Alguns fatores dietéticos intraluminais e sistêmicos influenciam na captação e no transporte celular de zinco, tais como: forma química do elemento na dieta, interação ferro-zinco, taninos, oxalatos, fitatos, drogas, catabolismo, hormônios, infecções e estresse (PEDROSA; COZZOLINO, 1993; AGGETT; COMERFORD, 1995).
No lúmen intestinal, pode haver ligação do zinco livre com peptídeos, aminoácidos, ácidos orgânicos, fosfatos, prostaglandinas E2 e F2, ácido cítrico e ácido picolínico, que facilitam a absorção do mineral (YUYAMA et al., 2005). A quantidade e a origem da proteína presente na dieta podem atuar positivamente na absorção do zinco, porém, a caseína pode exercer um efeito inibitório (MAFRA; COZZOLINO, 2004).
O conteúdo de fitato presente nos alimentos reduz a biodisponibilidade de zinco e esse efeito é acentuado com a presença de fontes de cálcio na mesma refeição. A suplementação de ferro pode interferir negativamente na biodisponibilidade do zinco dietético, competindo pelo mesmo sítio de absorção na mucosa intestinal (YUYAMA et al., 2005).
2.2.3. Absorção, metabolismo e excreção do zinco
O zinco é absorvido no jejuno e no íleo, principalmente por mecanismos de transporte ativo. No interior do enterócito, a absorção do zinco é regulada por proteínas que ligam metais, como as metalotioneínas e as proteínas intestinais ricas em cisteína (CRIP’s) (HENRIQUES et al., 2003).
A metalotioneína, uma proteína ligante de metal intracelular, tem sua síntese intestinal estimulada, entre outros fatores, pela suplementação dietética de zinco (KREBS, 2000). As CRIP’s, ao contrário, são sintetizadas no enterócito independente de ingestão ou estado corporal de zinco (LEVENSON; JANGHORBANI, 1994). Assim, as CRIP’s atuariam como carreadores intracelulares do zinco, e a metalotioneína, como reguladora da ligação do metal com as CRIP’s (HEMPE; COUSINS, 1992; HENRIQUES et al., 2003).
Após a absorção, o zinco é transportado para o fígado e em seguida distribuído para outros tecidos. A albumina é a principal proteína carreadora plasmática (57%), embora quantidades de zinco possam ser transportadas pela α-2 macroglobulina (40%) e aminoácidos (2%). No sangue, as maiores concentrações de zinco encontram-se nos eritrócitos e leucócitos (VALLE; FALCHUK, 1993; KREBS; HAMBIDGE, 2001).
Dentro das células alvo, a manutenção das concentrações de zinco é atribuída a proteínas transportadoras de zinco, destacando-se as estudadas até o momento ZnT-1, ZnT-2, ZnT-3 e ZnT-4, além de um polipeptídeo transmembrana transportador de íons, o DCT1 (divalent cátion transport-1) (HENRIQUES et al., 2003).
A proteína ZnT-1 é regulada diretamente pela quantidade de zinco ingerido e está associada ao efluxo do metal, localizando-se principalmente no intestino, rins e fígado. A ZnT-2 está também envolvida na exportação ou captação do zinco principalmente no intestino, nos rins e nos testículos. A ZnT-3 regula a captação de zinco em vesículas neuronais e possivelmente nos testículos. A ZnT-4 é provavelmente a mais abundante no cérebro e glândulas mamárias, estando possivelmente associada à secreção de zinco no leite (COUSINS; McMAHON, 2000).
possam ser reutilizadas. O zinco está presente em todos os tecidos e fluidos do organismo, formando complexos com aminoácidos, peptídeos, proteínas e nucleotídeos, apresentando-se como um íon intracelular - aproximadamente 95% do zinco corporal total - associado principalmente às organelas (KING; KEEN, 1999). O conteúdo corpóreo total é de aproximadamente 2g, distribuídos entre músculo esquelético (60%), osso (30%) e plasma (0,1%). Altas concentrações podem ser encontradas na coróide do olho e nos líquidos plasmáticos (ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DE SAÚDE, 1998b).
A excreção do zinco é feita principalmente pelo trato gastrointestinal, sendo cerca de 2-5 mg provenientes de secreções pancreáticas exócrinas, 500-800 mg/dia pelo suor e 500-600 mg/dia por meio da descamação da pele, mucosa intestinal e urinária (VALLE; FALCHUK, 1993; KREBS; HAMBIDGE, 2001). As perdas urinárias variam de 300-600µg/dia, influenciadas por mecanismos de secreção do túbulo proximal do néfron (ABU-HAMDAN et al., 1981).
O trato gastrointestinal possui função central no controle homeostático do zinco. Apesar da absorção do zinco depender em parte da sua quantidade na dieta, além da presença de fatores inibidores ou promotores de sua absorção, o mecanismo de excreção de zinco a partir do intestino parece ser mais decisivo no controle homeostático do mineral. Isso se deve, possivelmente, ao fato da quantidade de zinco excretada pela via intestinal estar relacionada não só à quantidade de zinco absorvida, mas também ao estado nutricional do indivíduo, relativo ao zinco (KREBS; HAMBIDGE, 2001). Assim, quando a ingestão dietética de zinco encontra-se diminuída, o mecanismo de excreção do mesmo a partir da mucosa para o lúmen intestinal também diminui, enquanto a absorção através da mucosa para o compartimento vascular aumenta, contribuindo para o incremento da absorção de zinco. Ajustes na excreção renal também podem ocorrer com ingestões extremamente altas ou baixas de zinco. Contudo, a redistribuição tecidual e celular desse mineral pode contribuir de certa forma, para a manutenção da sua homeostasia (KING et al., 2000).
2.2.4. Deficiência de zinco no organismo
condições ambientais e da presença ou ausência de fatores iatrogênicos (HAMBIDGE, 2000).
A deficiência de zinco envolve inúmeras anormalidades no metabolismo e pode acontecer devido à ingestão dietética inadequada, aumento das necessidades ou excreção, presença de agentes na dieta que comprometem sua absorção, síndromes de má absorção, nutrição parenteral total sem adição de zinco, e ainda por problemas genéticos (VALLE; FALCHUK, 1993).
Durante o período inicial da deficiência, ocorre mobilização das reservas funcionais de zinco que evolui para sinais e sintomas como anorexia, com possível alteração do paladar e do olfato; retardo do crescimento; cicatrização lenta; hipogonadismo; alteração na função imune com infecções recorrentes; desordens de comportamento, aprendizado e memória; prejuízo na síntese de insulina, levando a intolerância à glicose; alopecia; além de diarréia e teratogênese (ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DE SAÚDE, 1998b; SHANKAR; PRASAD, 1998; HAMBIDGE, 2000).
2.2.5. Recomendações e toxicidade do zinco
As necessidades diárias de zinco variam em função da idade, estágio de crescimento e extensão das perdas do mineral pelo intestino, vesícula biliar, pâncreas, rins e pele. Diante da impossibilidade de se realizar medidas diretas da excreção de zinco, foram feitas análises fatoriais para determinar a necessidade média estimada para adultos (EAR) em 6,8 mg/dia para o sexo feminino e 9,4 mg/dia para o sexo masculino, possibilitando os cálculos para quota diária recomendada (RDA), com valores iguais a 8 mg/dia e 11 mg/dia, respectivamente. O nível de ingestão máxima tolerável para adultos, 40 mg/dia, foi baseado na redução da atividade da enzima cobre/zinco superóxido dismutase no eritrócito (NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, 2001b).
lipoproteína de alta densidade (High Density Lipoprotein – HDL), erosão gástrica e depressão da função do sistema imune (KING; KEEN, 1999).
2.3. AVALIAÇÃO DO ESTADO NUTRICIONAL DE COBRE E ZINCO
2.3.1. Parâmetros bioquímicos e teciduais
Relativamente, pouco cobre é estocado no corpo, quando compara-se com a retenção de outros elementos traço como zinco e ferro, possuindo, um adulto, menos que 100 mg de cobre corporal. Além disso, várias condições e doenças são capazes de influenciar o metabolismo desse mineral, alterando sua distribuição (TURNLUND, 1998).
Mesmo com o incremento dos conhecimentos acerca das funções fisiológicas do cobre, os biomarcadores para diagnóstico de deficiência marginal desse mineral não estão bem estabelecidos. Vários fatores interferem na identificação de um biomarcador sensível ao estado nutricional de cobre em humanos, como, por exemplo, procedimentos laboratoriais não padronizados e o complexo mecanismo de controle homeostático do cobre no organismo (MILNE, 1998).
No entanto, não há um indicador específico da deficiência de cobre. Níveis séricos de cobre, ceruloplasmina, cobre urinário e cobre do cabelo, apesar de correntemente utilizados como parâmetros para avaliar o estado de cobre, constituem medidas pouco sensíveis para a verificação de deficiência marginal de cobre (ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DE SAÚDE, 1998a).
Com um consumo inadequado de cobre há maior conservação endógena desse mineral, seguida possivelmente por um aumento na absorção gastrointestinal. Somente após essa alteração adaptativa ser insuficiente para manter as concentrações do mineral, é que se espera outro defeito funcional, como, por exemplo, redução na atividade de enzimas dependentes de cobre (AGGETT; FAIRWEATHER-TAIT, 1998).
As concentrações de zinco no plasma são aceitas atualmente como indicadores do estado de zinco. Apesar da pouca especificidade, esses valores são úteis pela facilidade, reprodutibilidade e por existirem controles ou valores de referência para a comparação entre laboratórios (ARNAUD et al., 1993; HAMBIDGE, 2003).
Significativamente, mais informações sobre o estado nutricional de elementos traço podem ser obtidas pela investigação das suas concentrações nas células sangüíneas e não somente na avaliação das suas concentrações plasmáticas, pois esses elementos, entre eles o cobre e o zinco, fazem parte de vários processos enzimáticos dentro da célula (KRUSE-JARRES; RUKGAUER, 2000).
A concentração de zinco no eritrócito apresenta-se diminuída na restrição dietética de zinco, mas os possíveis valores indicativos do estado nutricional não estão bem definidos. Análises da concentração de zinco no cabelo têm mostrado associação com deficiência no crescimento de crianças, porém, pesquisas relativas aos grupos etários, bem como a separação por sexo, são ainda necessárias. Os processos homeostáticos complexos e a falta de consistência nos resultados das pesquisas inviabilizam a utilização da atividade de enzimas dependentes de zinco e da concentração de zinco em células imunológicas, como parâmetro para avaliação do estado nutricional relativo a esse mineral (NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, 2001b).
2.4. VALORES DE REFERÊNCIA
A determinação de valores de referência de elementos traço tem sido desenvolvida com base na importância de tais nutrientes para a manutenção do bom funcionamento do corpo humano, em todas as etapas da vida, e principalmente para ajudar na interpretação de valores alterados, encontrados em algumas doenças crônicas, possibilitando diagnósticos mais precisos e precoces (ANDERSEN et al., 1997; GARCIA et al., 2000).
QUADRO 1 - Valores de referência para cobre e zinco, no plasma e no eritrócito, descritos em estudos de regiões diferentes.
COBRE ZINCO LOCAL CASUÍSTICA
PLASMA/SORO ERITRÓCITO PLASMA/SORO ERITRÓCITO
AUTORES OBSERVAÇÃO
França Adultos 80,7 – 141,0μg/dL
(12,7–22,2 μmol/L)
30,5-132,2μg/dL
(4,8– 20,8μmol/L)
80,4-110,5μg/dL
(12,3-16,9μmol/L)
784,6-1645,0μg/dL
(120-250μmol/L)
Arnaud et al
(1993)
Artigo de revisão
Itália Adultos 60-140μg/dL
(9,4 -22,0μmol/L)
- 60-120μg/dL
(9,1–18,2 μmol/L)
1.000-1.600μg/dL
(152,0-243,2μmol/L)
Caroli et al
(1994)
Artigo de revisão
Espanha
- Valência
N = 55
19 (M)
36 (F)
Idade:
20-45anos
67-136μg/dL
(10,6-21,4μmol/L)
69-117μg/dL
(10,5-20,7μmol/L)
Garcia et al
(2000)
Estudo
observacional
transversal
QUADRO 1 - Valores de referência para cobre e zinco, no plasma e no eritrócito, descritos em estudos de regiões diferentes (continuação 1).
COBRE ZINCO LOCAL CASUÍSTICA
PLASMA/SORO ERITRÓCITO PLASMA/SORO ERITRÓCITO
AUTORES OBSERVAÇÃO
Estados
Unidos
-Alabama
N = 600
(Afroamericanos)
233 (M)
367 (F)
Idade:
25-65anos
Homens:
128,9+33,0μg/dL
(20,3+5,2μmol/L)
Mulheres:
143,5+41,9μg/dL
(22,6+6,6μmol/L)
Homens:
104,6+31,6μg/dL
(15,9+4,8μmol/L)
Mulheres:
97,4+23,7μg/dL
(14,8+3,6μmol/L)
Neggers et al
(2001)
Incluiu sobrepeso
e obesidade.
Tunísia N = 41
(controles)
Idade:
48,1+8,7anos
128,3+49,5μg/dL
20,2+7,8μmol/L
107,9+25,4μg/dL
16,5+3,9μmol/L
Kassab et al
(2003)
Estudo
observacional
transversal
QUADRO 1 - Valores de referência para cobre e zinco, no plasma e no eritrócito, descritos em estudos de regiões diferentes (continuação 2).
COBRE ZINCO LOCAL CASUÍSTICA
PLASMA/SORO ERITRÓCITO PLASMA/SORO ERITRÓCITO
AUTORES OBSERVAÇÃO
Kuwait N=560
238 (M)
322 (F)
Idade:
15-80anos
Homens:
133,4+36,8μg/dL
21,0+5,8μmol/L
Mulheres:
158,1+45,7μg/dL
24,9+7,2μmol/L
Homens:
111,86+23,0μg/dL
17,0+3,5μmol/L
Mulheres:
102,0+22,4μg/dL
15,5+3,4μmol/L
Abiaka et al
(2003)
Estudo
observacional
transversal
QUADRO 1 - Valores de referência para cobre e zinco, no plasma e no eritrócito, descritos em estudos de regiões diferentes (continuação 3).
COBRE ZINCO LOCAL CASUÍSTICA
PLASMA/SORO ERITRÓCITO PLASMA/SORO ERITRÓCITO
AUTORES OBSERVAÇÃO
Portugal
-Lisboa
47 (M)
136 (F)
20 a 70anos
Homens:
103+38μg/dL
16,22+6,0μmol/L
Mulheres:
132+50μg/dL
20,8+7,9μmol/L
Homens:
105+18μg/dL
15,9+2,7μmol/L
Mulheres:
99+17μg/dL
15,0+2,6μmol/L
Lopes et al
(2004)
Foram incluídos
tabagistas,
usuárias de
contraceptivos e
reposição
hormonal
pós-menopausa;
gestantes
4. OBJETIVOS
4.1. OBJETIVO GERAL
Construir valores de referência para cobre e zinco, no plasma e no eritrócito, em adultos universitários na cidade de Natal-RN.
4.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Determinar as concentrações de cobre e de zinco, no plasma e no
eritrócito, de adultos saudáveis;
Identificar fatores comportamentais da população estudada, quanto à dieta e à prática de atividade física, para caracterização da amostra;
5. CASUÍSTICA E MÉTODOS
5.1. PROTOCOLO EXPERIMENTAL
Foi realizado um estudo de corte transversal, no período de 2004.1 a 2005.2, com uma amostra de conveniência constituída por 123 indivíduos adultos saudáveis, estudantes da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), de ambos os gêneros, com idade entre 19 e 41 anos. O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UFRN (ANEXO A). Os voluntários foram previamente informados dos objetivos da pesquisa, e formalizaram a participação por meio de Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) (ANEXO B).
Os alunos foram arrolados nos Centros de Ensino, sob prévio conhecimento e apoio dos Diretores de Centro. Após explanação dos objetivos e relevância da pesquisa, aqueles que tiveram interesse despertado foram submetidos a análise quanto aos critérios de inclusão e exclusão. Preenchidos os requisitos, o TCLE foi assinado e as coletas de dados e de material biológico foram agendadas em um local próximo aos Centros de origem dos alunos. Um dia antes da coleta, os voluntários eram contactados por telefone para que pudessem confirmar a presença.
Os critérios de inclusão compreenderam idade igual ou superior a 19 anos e máxima de 50, estar matriculado e freqüentar curso de graduação na UFRN. Quanto aos fatores de exclusão, foram: história atual de tabagismo, alcoolismo, doença crônica ou aguda, com ou sem uso de medicamentos, assim como gravidez, lactação, terapia de reposição hormonal ou uso de anticoncepcionais, e ainda uso de suplemento vitamínico-mineral, desnutrição ou obesidade.
QUADRO 2 – Variáveis dependentes para efeito da análise estatística.
VARIÁVEIS DEPENDENTES
COBRE NO PLASMA (μg/dL)
COBRE NO ERITRÓCITO (μg/dL)
COBRE NO ERITRÓCITO (μg/g Hb)
QUADRO 3 – Variáveis independentes, de caracterização, com respectivas categorias para efeito da análise descritiva e estatística.
VARIÁVEIS INDEPENDENTES (DE CARACTERIZAÇÃO)
GÊNERO* Feminino Masculino
IDADE (anos)* 19 – 24
25 – 41
IMC (kg/m2)* 18,5 – 24,9 25,0 – 29,9
PRÁTICA DE ATIVIDADE FÍSICA Sim
Não
ANTECEDENTES FAMILIARES DE DOENÇA CRÔNICA Sim
Não
NATURALIDADE Natal
Outras cidades do RN Outros Estados
CENTRO DE ENSINO DA UFRN Centro de Ciências da Saúde (CCS) Centro Tecnológico (CT)
Centro de Biociências (CB)
Centro de Ciências Exatas e da Terra (CCET)
Centro de Ciências Humanas, Letras e Artes (CCHLA) Centro de Ciências Sociais Aplicadas (CCSA).
QUADRO 4 – Variáveis independentes dietéticas com respectivas categorias para efeito da análise estatística.
VARIÁVEIS INDEPENDENTES (DIETÉTICAS)
ENERGIA E MACRONUTRIENTES MICRONUTRIENTES
ENERGIA
MEDIANA < 2311,2 (Cal) > 2311,2 (Cal) INGESTÃO* Insuficiente Adequada Excessiva COBRE MEDIANA < 1070,0 (μg) >1070,0 (μg) DRI
< RDA > RDA < UL > UL
PROTEÍNA
MEDIANA < 88,9 (g) > 88,9 (g)
CONTRIBUIÇÃO PARA O VCT Inadequada (< 10%)
Adequada (10 – 35%) Excessiva (> 35%)
ZINCO
MEDIANA < 8,23 (mg) > 8,23 (mg) DRI < RDA > RDA < UL > UL
LIPÍDEO MEDIANA < 72,8 (g) > 72,8 (g)
CONTRIBUIÇÃO PARA O VCT Inadequada (< 20%)
Adequada (20% – 35%) Excessiva (> 35%)
-
CARBOIDRATO
MEDIANA < 304,6 (g) > 304,6 (g)
CONTRIBUIÇÃO PARA O VCT Inadequada (< 45%)
Adequada (45 – 65%) Excessiva (> 65%)
-
*Baseada na necessidade estimada de energia (Estimated Energy Requirement = EER);
DRI = Dietary Reference Intake; RDA = Recommended Dietary Allowance; UL = Tolerable Upper Intake Level;VCT = Valor Calórico Total.
5.2. PARÂMETROS ANTROPOMÉTRICOS
O estado nutricional antropométrico foi medido pelo Ïndice de Massa Corporal (IMC) (Peso/Altura²), recomendado pela Organização Mundial de Saúde (1995), obtido a partir das medidas de peso e altura atuais. Para a medida do peso, foi utilizada balança digital Plenna®, modelo MEA-03140, com capacidade para 150 kg e precisão de gramas, estando os indivíduos descalços e com o mínimo possível de roupa e adereços. A altura foi obtida utilizando-se compasso e fita métrica inextensível, com precisão de mm, afixada a uma parede com recantos de 90° a um metro do piso, estando os indivíduos descalços e com postura firme. O estado nutricional antropométrico foi diagnosticado conforme QUADRO 5:
QUADRO 5 – Diagnóstico do estado nutricional antropométrico, segundo o Índice de Massa Corporal (IMC).
IMC (kg/m²)
DIAGNÓSTICO
≥ 40,0 Obesidade grau III
35,0 – 39,9 Obesidade grau II
30,0 – 34,9 Obesidade grau I
25,0 – 29,9 Pré-obeso ou sobrepeso
18,5 – 24,9 Eutrofia
17,0 – 18,4 Magreza grau I
16,0 – 16,9 Magreza grau II
< 16,0 Magreza grau III
5.3. ANÁLISE E ADEQUAÇÃO DOS NUTRIENTES DA DIETA
A dieta atual foi conhecida por meio de Recordatório Alimentar de 24h (ANEXO D), consistindo em anotar todos os alimentos consumidos em cada refeição realizada no dia anterior, com as respectivas quantidades em medidas caseiras.
A dieta foi avaliada quanto a energia, macronutrientes, cobre e zinco, utilizando-se o programa Virtual-Nutri (PHILIPPI et al., 1996), disponível no Departamento de Nutrição da Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Os alimentos não encontrados no programa, com respectivas medidas caseiras, foram incluídos tomando-se por base tabelas de composição de alimentos nacionais.
Para a classificação do consumo de cobre e zinco, foi considerado o Estimated Average Requirements (EAR), indicado para a avaliação de grupos (NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, 2001a;b). A avaliação da ingestão de energia, assim como dos macronutrientes, foi realizada com base nas recomendações da National Academy of Science (2002) utilizando-se os parâmetros dos QUADROS 6 e 7.
QUADRO 6 – Recomendação de energia e macronutrientes.
PARÂMETRO ENERGIA* (Cal)
Feminino
{354 – 6,91 x idade (anos) + NAF1 x [9,36 x peso (kg) + 727 x altura (m)]} + 162 Masculino
{662 – 9,53 x idade (anos) + NAF1 x [15,91 x peso (kg) + 539,6 x altura (m)]} + 199
MACRONUTRIENTES** PROTEÍNA
10 – 35%
LIPÍDEOS 20– 35%
CARBOIDRATOS 45 – 65%
1NAF = Nível de Atividade Física
*Baseada na necessidade estimada de energia (Estimated Energy Requirement = EER); ** Contribuição para o Valor Calórico Total (VCT) da dieta.
QUADRO 7 – Recomendações de cobre e zinco.
COBRE (μg/dia) ZINCO (mg/dia)
GÊNERO
EAR RDA UL EAR RDA UL
Feminino 19-30 (anos) 31-50 (anos)
700 700
900 900
10.000 10.000
6,8 6,8
8 8
40 40 Masculino
19-30 (anos) 31-50 (anos)
700 700
900 900
10.000 10.000
9,4 9,4
11 11
40 40
EAR = Estimated Average Requirement; RDA = Recommended Dietary Allowance; UL = Tolerable Upper Intake Level;
Fonte: National Academy of Sciences (2001a;b)
5.4. DETERMINAÇÃO DE COBRE E ZINCO
5.4.1. Material e procedimentos
5.4.1.1. Lavagem de utensílios
Toda a vidraria e recipientes plásticos utilizados durante a coleta do material biológico e análises posteriores foram cuidadosamente desmineralizados em banho de ácido nítrico a 20%, por no mínimo 12 horas, e enxaguados 6 vezes em água deionizada para minimizar a contaminação por minerais.
5.4.1.2. Reagentes
5.4.1.3. Controle de qualidade
Os controles metodológicos quanto à reprodutibilidade e exatidão foram realizados com leitura de um dos pontos da curva padrão, como amostra, previamente à leitura do material biológico e repetições ao longo do período de análises.
5.4.1.4. Coleta e separação do material biológico
Foram coletados 12 mL de sangue de cada indivíduo, após jejum de 10 a 12 horas, divididos em dois tubos previamente desmineralizados com 6mL cada, contendo anticoagulante citrato de sódio a 30% (10 μg/mL de sangue), utilizando-se seringas e agulhas descartáveis, no período da manhã.
O plasma foi separado do sangue total em centrífuga refrigerada a 3000 rpm, durante 15 minutos a 4ºC, retirado com pipeta automática, acondicionado em tubos
eppendorfs de polipropileno desmineralizados e estocados a -20ºC para análises posteriores.
Após retirada do plasma, foi realizada a lavagem dos eritrócitos, com solução salina a 0,9%, sob centrifugação a 4000 rpm, por 10 minutos, a 4°C. Este procedimento foi repetido por três vezes. Os eritrócitos foram acondicionados em tubos eppendorfs de polipropileno desmineralizados e estocados a -20ºC. As análises de cobre e zinco, bem como as de hemoglobina, foram realizadas no Laboratório Multidisciplinar do Centro de Ciências da Saúde – UFRN.
5.4.1.5. Determinação de cobre no plasma e no eritrócito
Foi preparada uma curva padrão usando uma solução de cobre Tritisol Merck ®, diluída em água desionizada com glicerol a 10%, nas concentrações de 0,1; 0,2; 0,5; 1,0 e 2,0 μg/mL.
A determinação de cobre no eritrócito foi feita por espectrofotometria de absorção atômica, seguindo padronização realizada durante este estudo, na qual se constatou um nível de precisão desejável nas análises, e não interferência de matriz nesse tipo de material biológico. Uma alíquota de 500 μL de eritrócito foi diluída com água desionizada, na proporção de 1:1, e em seguida foram pipetados 400 μL desse lisado, em duplicata, para uma diluição subseqüente de 5 vezes, na proporção de 1:4, permitindo leitura direta em chama. A diluição final, de 10 vezes, é a mínima recomendada para leitura direta de eritrócitos em chama, sob risco de dano ao aparelho (VITOUX et al., 1999).
Os resultados das concentrações de cobre no eritrócito foram expressos em μg/dL e μg/g Hb. Para tanto, foi determinada paralelamente a concentração de hemoglobina no eritrócito, em aparelho RA-50, pelo método da cianometahemoglobina (VAN ASSENDELFT, 1972). Todas as análises foram feitas em duplicata, obedecendo a um coeficiente de variação menor que 10%.
5.4.1.6. Determinação de zinco no plasma e no eritrócito
Para a determinação de zinco, foi preparada uma curva padrão usando uma solução de zinco Tritisol Merck ®, diluída em água desionizada com glicerol a 10%, nas concentrações de 0,1; 0,2; 0,5; 1,0 e 2,0 μg/mL.
A determinação da concentração de zinco no plasma foi realizada por espectrofotometria de absorção atômica, segundo o método proposto por Rodriguez et al. (1989). Alíquotas de 400 μL de cada amostra de plasma foram diluídas em água desionizada, na proporção de 1:4 e, após leitura, os resultados foram expressos em μg/dL.
Os resultados das concentrações de zinco no eritrócito foram expressos em μg/dL e μg/g Hb. Para tanto, foi determinada paralelamente a concentração de hemoglobina no eritrócito, em aparelho RA-50, pelo método da cianometahemoglobina (VAN ASSENDELFT, 1972). Todas as análises foram feitas em duplicata, obedecendo a um coeficiente de variação menor que 10%.
5.5. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados, inicialmente apresentados de forma descritiva, foram submetidos à análise estatística, realizada pelo Núcleo do Desenvolvimento do Tirocínio Científico (NDTiC) do Programa de Pós-graduação em Odontologia da UFRN, utilizando-se o
software SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) versão 13.0 (APACHE SOFTWARE FOUNDATION, 2004).
6. RESULTADOS
6.1. CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA
Os dados de caracterização mostrados na TABELA 1 evidenciam que do total de 123 voluntários, o gênero masculino representou 52,8%. A idade variou de 19 a 41 anos, com média de 22,9 + 3,8 anos. No entanto, 81,3% dos voluntários tinha até 24 anos. Assim, para efeito das análises estatísticas, essa variável foi dividida em duas categorias, originando as faixas apresentadas.
A avaliação do estado nutricional antropométrico revelou que o IMC médio para o gênero feminino foi de 21,6 + 2,3 kg/m² e para o gênero masculino, 23,4 + 2,6 kg/m². A maioria dos voluntários (82,9%) apresentou estado nutricional antropométrico dentro dos padrões de normalidade, contudo, pôde-se observar uma prevalência de sobrepeso igual a 17,1% (21), com predominância no gênero masculino (GRÁFICO 1).
Quanto à prática de atividade física, constatou-se que a maioria dos participantes (69,1%) não realizava atividade física, sendo que entre as mulheres esse percentual foi maior, 77,6%, contra 61,5% entre os homens. A maioria dos participantes (81,3%) relatou antecedentes familiares de doenças crônicas, entre as quais se destacaram as doenças cardiovasculares e o diabetes, como mostra o GRÁFICO 2. Estas informações ajudam a construir o perfil da população estudada, embora não possam ser avaliadas com segurança na interpretação da sua possível interferência sobre os valores de referência para cobre e zinco, objetivo principal deste estudo, por se tratarem de relatos.
TABELA 1 – Dados de caracterização da amostra formada por estudantes da UFRN, de ambos os gêneros. Natal, 2006.
FREQÜÊNCIA CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA
N % GÊNERO Feminino Masculino 58 65 47,2 52,8
TOTAL 123 100,0
IDADE (anos)
19 – 24 25 – 41
100 23
81,3 18,7
TOTAL 123 100,0
IMC (kg/m2)
18,5 – 24,9 25,0 – 29,9
102 21
82,9 17,1
TOTAL 123 100,0
PRÁTICA DE ATIVIDADE FÍSICA
Sim Não 38 85 30,9 69,1
TOTAL 123 100,0
ANTECEDENTES FAMILIARES DE DOENÇA CRÔNICA
Sim Não 100 23 81,3 18,7
TOTAL 123 100,0
NATURALIDADE
Natal
Outras cidades do RN Outros Estados 60 38 25 48,8 30,9 20,3
TOTAL 123 100,0
CENTRO DE ENSINO DA UFRN
Centro de Ciências da Saúde (CCS) Centro Tecnológico (CT)
Centro de Biociências (CB)
Centro de Ciências Exatas e da Terra (CCET)
Centro de Ciências Humanas, Letras e Artes (CCHLA) Centro de Ciências Sociais Aplicadas (CCSA).
55 29 13 10 9 7 44,7 23,6 10,6 8,1 7,3 5,7
0,0% 20,0% 40,0% 60,0% 80,0% 100,0%
Eutrófico Sobrepeso
% FemininoMasculino
GRÁFICO 1 – Estado nutricional antropométrico, segundo o IMC, de estudantes da UFRN, de ambos os gêneros. Natal, 2006.
0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80%
Cardiovasculares Diabetes Câncer Outras
6.2. ANÁLISE DOS NUTRIENTES DA DIETA
A análise das dietas demonstrou ampla variação na ingestão energética e de nutrientes. Os macronutrientes apresentaram percentuais de contribuição para o VCT da dieta considerados adequados. Na TABELA 2 são apresentados os valores médios de energia, macronutrientes, cobre e zinco ingeridos nas últimas 24h que antecederam a coleta do material biológico.
Quanto ao cobre, espera-se que 50% dos indivíduos avaliados tenham suas necessidades atendidas quando a ingestão média do nutriente for igual a 700μg Cu/dia. Conforme a análise das dietas, de acordo com a ingestão dietética de referência (DRI) estima-se que 17,1% (21) dos participantes apresentaram consumo inferior a EAR nesse período (TABELA 3).
Em relação ao zinco, as necessidades diferem entre o gênero masculino e o feminino. O valor médio, segundo o estágio de vida, estimado para atender as necessidades de 50% dos indivíduos do gênero masculino, corresponde a 9,4 mg/dia e, quanto ao feminino, 6,8 mg/dia. Desse modo, estima-se que 49,6% (61) do total de estudantes não atingiram o consumo mínimo de zinco na dieta proposto pela EAR (TABELA 4).
TABELA 2 – Valores de ingestão diária de energia e nutrientes dos estudantes da UFRN, participantes da pesquisa.
INGESTÃO
Média + DP IC = 95%
Energia (kcal) 2306,4 + 762,0 2171,7 – 2441,0
Proteína (%) 16,0 + 4,2 15,2 – 16,7
Lipídeos (%) 30,0 + 7,2 28,7 – 31,3
Carboidratos (%) 54,0 + 8,3 52,6 – 55,5
Cobre (μg) 1.070,0 (MEDIANA) 1.223,0 – 2.818,0
TABELA 3 – Distribuição percentual de estudantes da UFRN, participantes da pesquisa, segundo o consumo de cobre, de acordo com a ingestão dietética de referência (DRI).
COBRE
< EAR ≥ EAR - < RDA ≥ RDA - < UL ≥ UL GÊNERO
Fi % Fi % Fi % Fi %
Feminino
(n=58) 15 25,9 15 25,9 28 48,2 - -
Masculino
(n=65) 6 9,2 8 12,3 48 73,9 3 4,6
TOTAL
(n=123) 21 17,1 23 18,7 76 61,8 3 2,4
TABELA 4 – Distribuição percentual de estudantes da UFRN, participantes da pesquisa, segundo o consumo de zinco, de acordo com a ingestão dietética de referência (DRI).
ZINCO
< EAR ≥ EAR - < RDA ≥ RDA - < UL ≥ UL GÊNERO
Fi % Fi % Fi % Fi %
Feminino
(n=58) 33 56,9 5 8,6 20 34,5 - -
Masculino
(n=65) 28 43,1 3 4,6 34 52,3 - -
TOTAL
6.3. AVALIAÇÃO DE COBRE NO PLASMA E NO ERITRÓCITO
Os dados de cobre no plasma, no eritrócito e por grama de hemoglobina eritrocitária, são apresentados nas TABELAS 5, 6, 7 e 8.
As concentrações médias de cobre plasmático foram estatisticamente diferentes (p=0,002) entre os gêneros. Do ponto de vista analítico, as concentrações plasmáticas de cobre variaram de 56,0 a 193,3 μg/dL (112,4 + 20,5) ou 8,8 a 30,4 μmol/L (17,7+3,2 μmol/L), no entanto o Intervalo de Confiança (IC = 95%) estabelecido de acordo com o gênero está demonstrado na TABELA 5.
Quanto aos valores de cobre no eritrócito, observou-se uma média de 85,6 + 12,6 μg/dL (13,5+2,0 μmol/L), variando de 56,5 a 125,5 μg/dL (8,9 a 19,8 μmol/L). As concentrações observadas em função do gênero revelaram, neste estudo, médias equivalentes a 83,4 + 12,7 μg/dL (13,1 + 2,0 μmol/L), para homens e 88,2 + 12,1 μg/dL (13,9 + 1,9 μmol/L), para mulheres. Quando as concentrações foram expressas em média de cobre por grama de hemoglobina também pôde ser observada diferença estatisticamente significativa entre os gêneros (p = 0,038). Quando analisada a possibilidade de outras variáveis independentes, além do gênero, interferirem nas concentrações de cobre, observou-se que as concentrações plasmáticas sofreram influência relacionada com a ingestão de calorias (p=0,010), de carboidrato (p=0,021) e de cobre na dieta (p=0,020), todos categorizados de acordo com a mediana (TABELA 6), além da proteína categorizada segundo o percentual de contribuição para o VCT da dieta (p=0,035) (TABELA 7). As demais variáveis independentes não exerceram influência sobre quaisquer concentrações de cobre avaliadas.
Tabela 5 - Valores de cobre no plasma e no eritrócito de estudantes da UFRN, de acordo com variáveis de identificação categorizadas. Natal, 2006.
COBRE
PLASMA ERITRÓCITO
μg/dL μg/dL μg/gHb
VARIÁVEIS DE
IDENTIFICAÇÃO
MÉDIA + DP IC (95%) p MÉDIA + DP IC (95%) p MÉDIA + DP IC (95%) p
GÊNERO
Feminino (58)1
Masculino (65)
118,47 + 19,68 107,03 + 19,77
113,29-123,64 102,13-111,92
0,002A
88,16 + 12,15 83,39 + 12,71
84,96-91,35 80,24-86,54
0,036A
3,65 + 0,80 3,38 + 0,61
3,44 – 3,86 3,23 – 3,53
0,038A
IDADE (anos)
19 – 24 (100) 25 – 41 (23)
112,86+21,46 110,52+15,67 108,59-117,12 103,75-117,30 0,624A 86,08+13,38 83,72+8,52 83,42-88,74 80,03-87,40 0,420A 3,53+0,76 3,41+0,48 3,38-3,68 3,20-3,61 0,336A
IMC (kg/m2) 18,5 – 24,9 (102) 25,0 – 29,9 (21)
112,47 + 20,27 112,17 + 21,89
108,49-116,45 102,20-122,13
0,950A
85,06 + 12,92 88,45 + 10,87
82,52-87,60 83,50-93,40
0,264A
3,51 + 0,76 3,49 + 0,48
3,36-3,66 3,27-3,71
0,898A
A= Teste t de
Student, significativo em negrito;
1 – ( ) número de indivíduos;
Tabela 6 - Valores de cobre no plasma e no eritrócito de estudantes da UFRN, de acordo com o consumo de energia, macronutrientes, cobre e zinco na dieta, categorizado segundo a mediana. Natal, 2006.
COBRE
PLASMA ERITRÓCITO μg/dL μg/dL μg/gHb VARIÁVEIS
INDEPENDENTES
MÉDIA + DP IC (95%) p MÉDIA + DP IC (95%) p MÉDIA + DP IC (95%) p
ENERGIA (Cal)
< 2311,2 (62)1
> 2311,2 (61)
117,10 + 22,43 107,66 + 17,16
111,41-122,80 103,27-112,05
0,010A
85,98 + 13,17 85,29 + 12,14
82,64-89,33 82,18-88,40
0,761A
3,46 + 0,66 3,55 + 0,77
3,29-3,63 3,35-3,75
0,498A
PROTEÍNA (g)
< 88,9 (62) > 88,9 (61)
114,63 + 21,07 110,18 + 19,75
109,28-119,98 105,12-115,23
0,229A
87,52 + 12,63 83,73 + 12,42
84,31-90,72 80,55-86,91
0,096A
3,59 + 0,79 3,42 + 0,63
3,39-3,79 3,26-3,58
0,178A
LIPÍDEO (g)
< 72,8 (62) > 72,8 (61)
113,37 + 21,61 111,46 + 19,36
107,88-118,85 106,50-116,42
0,607A
85,49 + 12,85 85,79 + 12,49
82,23-88,76 82,59-88,98
0,898A
3,46 + 0,66 3,56 + 0,78
3,29-3,62 3,36-3,75
0,459A
CARBOIDRATO (g)
< 304,6 (62) > 304,6 (61)
116,63 + 20,44 108,14 + 19,74
111,44-121,82 103,08-113,20
0,021A
85,41 + 12,95 85,87 + 12,38
82,12-88,70 82,70-89,04
0,842A
3,54 + 0,67 3,48 + 0,77
3,37-3,71 3,28-3,67
0,639A
COBRE (μg)
< 1070,0 (63) >1070,0 (60)
116,59 + 22,16 108,05 + 17,66
111,01-122,17 103,48-112,61
0,020A
84,80 + 11,64 86,52 + 13,62
81,87-87,73 83,00-90,03
0,454A
3,42 + 0,65 3,60 + 0,77
3,26-3,58 3,40-3,80
0,174A
ZINCO (mg)
< 8,23 (62) > 8,23 (61)
113,43 + 20,73 111,39 + 20,31
108,17-117,70 106,19-116,59
0,583A
86,13 + 13,12 85,14 + 12,18
82,80-89,46 82,02-88,26
0,666A
3,56 + 0,78 3,45 + 0,64
3,36-3,76 3,28-3,61
0,374A
A= Teste t de Student, significativo em negrito; 1 – ( ) número de indivíduos;
Tabela 7 - Valores de “p”, relativos ao cobre no plasma e no eritrócito de estudantes da UFRN, de acordo com o consumo de energia e macronutrientes na dieta, categorizado segundo as DRI’s. Natal, 2006.
COBRE
PLASMA ERITRÓCITO
μg/dL μg/dL μg/gHb
VARIÁVEIS INDEPENDENTES
MÉDIA + DP IC (95%) p MÉDIA + DP IC (95%) p MÉDIA + DP IC (95%) p
ENERGIA (Cal)
Insuficiente (0)1
Adequada (102) Excessiva (21)
– 112,47 + 20,27 112,17 + 21,89
– 108,49-116,45 102,20-122,13
0,950A
– 85,06 + 12,92 88,45 + 10,87
– 82,52-87,60 83,50-93,40
0,264A
– 3,51 + 0,76 3,49 + 0,48
– 3,36-3,66 3,27-3,71 0,898A PROTEÍNA (%) Inadequada (8) Adequada (115) Excessiva (0)
127,09 + 18,20 111,40 + 20,29
–
111,88-142,30 107,65-115,15
–
0,035A
94,00 + 11,61 85,06 + 12,53
–
84,30-103,70 82,74-87,37
–
0,052A
3,80 + 1,32 3,49 + 0,66
– 2,69-4,90 3,36-3,61 – 0,529A LIPÍDEO (%) Inadequada (8) Adequada (55) Excessiva (60)
107,19 + 26,64 112,40 + 23,07 113,14 + 17,04
84,91-129,46 106,16-118,63 108,74-117,54
0,745B
81,00 + 10,63 87,15 + 11,86 84,88 + 13,48
72,11-89,89 83,94-90,35 81,39-88,36
0,356B
3,31 + 0,66 3,46 + 0,63 3,58 + 0,79
2,76-3,86 3,29-3,63 3,37-3,78 0,482B CARBOIDRATO (%) Inadequada (64) Adequada (57) Excessiva (2)
114,55 + 16,89 110,61 + 23,22 95,88 + 43,66
110,33-118,77 104,45-116,77 -296,43-488,18
0,297B
86,27 + 12,95 85,32 + 12,39 74,50 + 1,41
83,03-89,50 82,04-88,61 61,79-87,21
0,420B
3,61 + 0,77 3,40 + 0,65 3,23 + 0,23
3,42-3,80 3,23-3,57 1,13-5,33
0,238B
A= Teste t de Student, significativo em negrito;B= ANOVA; 1 – ( ) número de indivíduos;
Tabela 8 - Valores de cobre no plasma e no eritrócito de estudantes da UFRN, de acordo com o consumo de cobre e zinco na dieta, categorizado segundo as DRI’s. Natal, 2006.
COBRE
PLASMA ERITRÓCITO
μg/dL μg/dL μg/gHb
VARIÁVEIS INDEPENDENTES*
MÉDIA + DP IC (95%) p MÉDIA + DP IC (95%) p MÉDIA + DP IC (95%) p
COBRE (μg)
Insuficiente (44)1
Adequada (76) Excessiva**
117,15 + 24,97 109,58 + 17,19
–
109,56-124,74 105,65-113,51
–
0,080A
86,15 + 11,42 84,96 + 13,41
–
82,68-89,62 81,90-88,02
–
0,623A
3,38 + 0,63 3,56 + 0,77
– 3,19-3,57 3,39-3,74 – 0,185A ZINCO (mg) Insuficiente (69) Adequada (54) Excessiva ***
113,80 + 20,38 110,66 + 20,63
–
108,91-118,70 105,03-116,29
–
0,400A
86,19 + 12,77 84,94 + 12,51
–
83,12-89,26 81,52-88,35
–
0,587A
53,31 + 9,15 51,78 + 9,57
–
3,39-3,76 3,25-3,60
–
0,255A
A= Teste t de Student 1 – ( ) número de indivíduos
6.4. AVALIAÇÃO DE ZINCO NO PLASMA E NO ERITRÓCITO
Os dados de zinco no plasma, no eritrócito e por grama de hemoglobina eritrocitária, são apresentados nas TABELAS 9, 10, 11 e 12.
O zinco apresentou concentrações médias plasmáticas estatisticamente diferentes (p=0,022) entre os gêneros (TABELA 9). Observou-se que as concentrações médias no gênero feminino foram menores do que no masculino. As concentrações plasmáticas de zinco, do ponto de vista analítico, variaram de 64,1 a 139,1 μg/dL (105,4 + 14,0 μg/dL) ou 9,7 a 21,1 μmol/L (16,0 + 2,1 μmol/L), e foi estabelecido o IC (95%) para expressar os limites, de acordo com o gênero. Não foram identificadas interferências das demais variáveis independentes apresentadas neste estudo.
Quanto aos valores de zinco no eritrócito, não houve diferença estatisticamente significativa entre os gêneros. Assim, observou-se uma média geral de 1.302,8 + 230,9 μg/dL (198,0 + 35,1 μmol/L), com IC (95%) entre 1.261,6 e 1.344,0 μg/dL. No entanto, as leituras desse mineral no eritrócito variaram de 723,2 a 1.868,6 μg/dL (109,9 a 284,0 μmol/L). As concentrações expressas de zinco por grama de hemoglobina eritrocitária revelaram concentração média geral igual a 52,6 + 9,3 μg/g Hb, com IC (95%) entre 51,0 e 54,3 μg/gHb. Também não foi evidenciada diferença estatisticamente significativa entre os gêneros.
