0 Rovena Clara Galvão Januário Engelberth
NATAL-RN 2010
CARACTERIZAÇÃO CITOARQUITETÔNICA, NEUROQUÍMICA E DE AFERÊNCIA ÓPTICA DO COMPLEXO PARABRAQUIAL DO SAGUI
(Callithrix jacchus).
1 Rovena Clara Galvão Januário Engelberth
Natal-RN 2010
CARACTERIZAÇÃO CITOARQUITETÔNICA, NEUROQUÍMICA E DE AFERÊNCIA ÓPTICA DO COMPLEXO PARABRAQUIAL DO SAGUI
(Callithrix jacchus).
Dissertação apresentada a Universidade Federal do Rio Grande do Norte, para obtenção do título de Mestre em Psicobiologia.
2 TÍTULO: Caracterização citoarquitetônica, neuroquímica e de aferência óptica do
Complexo Parabraquial do sagui (Callithrix jacchus).
AUTOR (a): Rovena Clara Galvão Januário Engelberth
DATA DA DEFESA: 23/04/2010
BANCA EXAMINADORA
Prof. Drª Raquel Simoni Pires Universidade da Cidade de São Paulo
Prof. Dr. Judney Cley Cavalcante
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
3 AGRADECIMENTOS
- Ao meu Pai do céu por toda a motivação...
- Á minha família, em especial a minha mãe Maria da Conceição Galvão. Meu exemplo de luta, força de vontade e conquista.
- Ao meu amigo-orientador o Professor Jeferson de Souza Cavalcante pelo apoio em todos os momentos, pelas conversas sinceras, pela companhia sempre presente, pela confiança, pelo carinho. Uma pessoa cada dia mais admirável e especial pra mim.
Muito obrigado por tudo meu excelentíssimo e querido professor.
- A professora Miriam Stela Maris de O. Costa pelos conselhos, ensinamentos e atenção dedicados durante as muitas horas de dúvidas.
- A todo o pessoal do LabNeuro: Regina, pelas conversas, atenção, carinho e claro substâncias; a Leandro, Raysa, Nayra, Rayane, Ruthnaldo e Gilberto por toda a ajuda; a Joacil, Twyla, Rodolfo pelas risadas, conversas e companhia nos lanches da tarde; a Expedito e Judney pelos momentos “tira-dúvidas” e apoio. A meus queridos “manos” André e Janaina por me aturar, me alegrar, me ajudar e me acompanhar em muitos bons momentos da minha vida.
4 - A toda turma de Pós-graduação em Psicobiologia de 2008, em especial à Aline, Jane, Ronaldo, Rafaella, Patrícia e Breno.
- A todos os professores do programa de Pós-Graduação em Psicobiologia, pelos
ensinamentos partilhados.
- A todos os funcionários do Departamento de Morfologia, Fisiologia e Núcleo de
Primatologia da UFRN.
5 “O valor das coisas não está
no tempo que elas duram, mas na intensidade com que acontecem. Por isso, existem
momentos inesquecíveis, coisas inexplicáveis e pessoas
incomparáveis.”
Fernando Pessoa
6 LISTA DE TABELAS E FIGURAS
TABELA 1 – Especificações técnicas das substâncias que foram utilizadas nas imunoistoquímicas.
FIG. 1 – Secção coronal do encéfalo do sagui, mostrando o Complexo Parabraquial na região pontina. Fonte: Stephan et al., 1980.
FIG. 2 – Fotomicrografias de secções coronais do cérebro do rato, mostrando as
divisões citoarquitetônicas do Complexo Parabraquial através dos três níveis, rostral, médio e caudal (à esquerda). Fonte: Li, L. et al., 2006.
FIG. 3 – Sagui (Callithrix jacchus).
FIG. 4 – Fotomicrografias de secções coronais do encéfalo do sagui, coradas com a técnica de Nissl, mostrando o aparecimento do PB em uma sequência rostro-caudal.
FIG. 5 – Citoarquitetura do Complexo Parabraquial (técnica de Nissl).
FIG. 6 - Projeções retinianas ao Complexo Parabraquial (subunidade B da toxina colérica).
FIG. 7 - Imunorreatividade contra a proteína nuclear neuronal no Complexo Parabraquial.
FIG. 8- Imunorreatividade contra parvalbumina no Complexo Parabraquial. FIG. 9– Imunorreatividade contra calretinina no Complexo Parabraquial. FIG. 10- Imunorreatividade contra calbindina no Complexo Parabraquial.
FIG. 11– Imunorreatividade contra serotonina no Complexo Parabraquial. FIG. 12 - Imunorreatividade contra encefalina no Complexo Parabraquial.
FIG. 13 – Imunorreatividade contra substância P no complexo Parabraquial.
FIG. 14- Imunorreatividade contra óxido nítrico sintetase no Complexo Parabraquial.
7 FIG. 16- Imunorreatividade contra colina acetiltransferase no Complexo Parabraquial. FIG. 17- Imunorreatividade contra proteína acídica fibrilar glial no Complexo
8 LISTA DE ABREVIATURAS
5-HT= Serotonina Ach= Acetilcolina
Ame= Aqueduto mesencefálico AP= Área postrema
BNST= Núcleo intersticial da estria terminal
CB= Calbindina
CeA= Núcleo central da amígdala ChAT= Colina acetiltransferase
CoI= Colículo inferior CR= Calretinina
CSf= Núcleo compacto suprafascicular CTb= Subunidade B da toxina colérica D IV= Decussação do nervo troclear
DLG= Núcleo geniculado lateral dorsal ENK= Encefalina
flm= Fascículo longitudinal medial GABA= Ácido gama-amino-butílico GFAP= Proteína acídica fibrilar glial
GLU= Glutamato -IR= Imunorreatividade
KF= Kölliker-fuse
LH= Núcleo hipotalâmico lateral
9 nIV= Núcleo do nervo abducente
NMnR= Núcleo mediano da rafe
NO= Óxido nítrico
NOS= Óxido nítrico sintetase
NST= Núcleo do tracto solitário Pa5= Núcleo para trigeminal espinal PB= Complexo parabraquial pontino
PBL= PB lateral; PBM= PB medial; PBMv= PBM ventral; PBMd= PBM dorsal; PBLv= PBL ventral; PBLd= PBL dorsal; PBLe= PBL externo; PBLex= PBL extremo; PBLs= PBL superior; PBLc= PBL central; PBLi= PBL interno.
pcs= Pedúnculo cerebelar superior PV= Parvalbumina
SCN= Núcleo supraquiasmático SP= Substância P
tmV= Tracto mesencefálico do nervo trigêmio
V IV= Quarto ventrículo
VeS= Núcleo vestibular superior
VMo= Núcleo motor do nervo trigêmio
10 SUMÁRIO
Pág.
RESUMO 13
ABSTRACT 14
1. INTRODUÇÃO 15
1.1 – Complexo Parabraquial (PB) 17
1.1.1- Organização citoarquitetônica do PB 17
1.1.2- Projeções ascendentes e descendentes do PB 21
1.1.3- Características neuroquímicas 24
1.1.4- Aspectos funcionais 25
1.2- Sujeito Experimental 28
2. JUSTIFICATIVA 30
3. OBJETIVOS 31
4. METODOLOGIA 32
4.1 – Sujeitos 32
4.2 – Procedimentos experimentais 32
4.2.1 – Procedimento anestésico 33
4.2.2- Injeção intraocular de CTb 33
4.2.3- Perfusão 34
4.2.4- Remoção dos encéfalos e microtomia 34
4.2.5- Coloração Citoarquitetônica 35
4.2.6- Imunoistoquímica 35
4.2.7- Histoquímica 37
11
5. RESULTADOS 39
5.1 – Caracterização citoarquitetônica: Nissl 39
5.2- Imunorreatividade contra NeuN 39
5.3 – Projeção retiniana ao PB 40
5.4 – Neuroquímica 40
5.4.1 –Proteínas ligantes de Cálcio 40
Parvalbumina (PV) 40
Calretinina (CR) 40
Calbindina (CB) 40
5.4.2 – Serotonina (5-HT) 41
5.4.3- Encefalina (ENK) 41
5.4.4- Substancia P (SP) 41
5.4.5- Óxido Nítrico Sintetase (NOS) 42
5.4.5- NADPH- diaforase 42
5.4.6- Colina acetiltransferase (ChAT) 42
5.4.7- Proteína acídica fibrilar glial (GFAP) 43
6. DISCUSSÃO 72
6.1 – Caracterização citoarquitetônica do PB 72
6.2- NeuN 74
6.3- Projeção retiniana 75
6.4- Caracterização Neuroquímica 76
6.4.1- Proteínas Ligantes de Cálcio: PV, CR, CB 76
6.4.2- 5-HT 80
12
6.4.4- SP 84
6.4.5- NOS, ChAT e NADPH - diaforase 85
6.4.6- GFAP 88
7- CONCLUSÕES 90
REFERÊNCIAS 92
13 RESUMO
O complexo parabraquial (PB) é uma região do tronco encefálico responsável pelo
processamento e transmissão de informações fisiológicas essenciais para a sobrevivência dos organismos. Essa região é subdividida em aproximadamente nove
regiões, considerando características morfológicas, citoarquitetônicas e funcionais. Seus neurônios possuem uma ampla rede de conexões com as demais regiões do sistema nervoso. O objetivo deste trabalho foi mapear a projeção retiniana para o PB e fazer
uma caracterização citoarquitetônica e neuroquímica desta região no Callithrix jacchus (sagüi), um primata do Novo Mundo. As projeções retinianas foram mapeadas por transporte anterógrado da subunidade B da toxina colérica (CTb). A citoarquitetura foi
descrita através do método de Nissl e a caracterização neuroquímica foi feita através de técnicas imunoistoquímicas para alguns neurotransmissores e substâncias neuroativas
presentes neste centro neural. No PB do sagui, nas secções coronais coradas pelo método de Nissl, foi possível encontrar um padrão similar ao que é evidenciado em outras espécies animais. A imunorreatividade contra CTb foi encontrada em fibras
terminais do PBMv, caracterizando desta forma uma inervação retiniana nessa área. A técnica imunoistoquímicas revelou que o PB contêm células, fibras e/ou terminais
imunorreativos a proteína nuclear neuronal, colina acetiltransferase, óxido nítrico sintetase, serotonina, encefalina, substância P, proteínas ligantes de cálcio (calbindina, calretinina e parvalbumina), e a proteína acídica fibrilar glial. A partir de técnicas
histoquímicas verificou-se células e fibras reativas a NADPH-diaforase. Cada uma dessas substâncias apresentou um padrão característico de marcação no PB e algumas
serviram como marcadores específicos de subregiões.
14 ABSTRACT
The parabrachial complex (PB) is an area of the brainstem responsible for the
processing and transmission of essential physiologic information for the survival of the organisms. This region is subdivided in approximately nine subregions, considering
morphology, cytoarchitectural and functional characteristic. Its neurons have an extensive network of connections with other regions of the nervous system. The objective in this work was to map the retinal projection to the PB and make a
citoarchitectonic and neurochemical characterization of this region in the common marmoset (Callithrix jacchus), a primate of the New World. The retinal projections were mapped by anterograde transport of the choleric toxin subunit b (CTb). The
citoarchitecture was described through the Nissl method, and the neurochemical characterization was made through immunohistochemical technique to the some
neurotransmitters and neuroactives substances present in this neural center. In marmoset PB, in the coronal sections labeled by Nissl method, we found a similar pattern to that evidenced in other animal species. The immunoreactivity against CTb
was verified in the PBMv in fibers/terminal, characterizing such as retinal innervations in this area. The immunohistochemical technique reveled that the PB contain cells,
fibers and/or terminals immunoreactives to the neuronal nuclear protein, Choline acetyl transferase, nitric oxide synthase, serotonin, enkephalin, substance P, Calcium-binding proteins (calbindin, calretinin e parvalbumin), and glial fibrillary acidic protein. The
histochemical technique reveled cells and fibers NADPH-diaphorase reactive. Each one of those substances presented a characteristic pattern of demarcation in PB, and some
serve as specific markers of subregions.
15 1. INTRODUÇÃO
Inúmeras funções fisiológicas vitais para os organismos vivos, como respiração,
batimentos cardíacos e mecanismos digestórios, são controladas pelo sistema nervoso. Uma região do encéfalo localizada entre a medula espinal e o diencéfalo, denominada
tronco encefálico é a responsável por comandar e regular boa parte dessas funções. Histologicamente é possível visualizar grupamentos neuronais diferenciados no tronco encefálico, estando cada um deles relacionados mais especificamente a determinadas
funções. Dentre esses aglomerados neuronais destacamos o complexo parabraquial (PB) (Parent, 1996).
O PB é uma região localizada mais especificamente na ponte dorsolateral,
circundando todo o pedúnculo cerebelar superior (pcs) (Fig.1). É considerado uma estação relé para integração de inúmeras conexões ascendentes e descendentes que
carregam informações sensório-viscerais (Parent, 1996). Hoje já se sabe que o PB possui uma grande conectividade com outros centros do sistema nervoso, o que possibilita seu envolvimento funcional em vários mecanismos homeostáticos, como
respiratório (Kobayashi e Osaka, 2003), digestório (Galvin et al., 2004), cardiovascular (Hayaward e Felder, 1998), nociceptivos (Lapirot et al., 2009), controle de liberação
hormonal (Panguluri et al., 2009) e também processos cognitivos como os de aprendizagem e memória (Tokita et al., 2007; Clark e Bernstein, 2009), bem como mecanismos corticais ligados ao sono e despertar (Saito et al., 1977; Phillips e
Robinson, 2007; Tamakawa et al., 2006).
Esse processo de homeostasia, ou seja, de equilíbrio entre os mecanismos
biológicos é essencial a vida. O sistema nervoso ajuda na manutenção desse equilíbrio através do controle dos processos autonômicos. Uma vez que o PB tem sido visto como
16 superiores nas quais é feito o processamento final da informação, o conhecimento de suas características se torna de grande importância para o entendimento do bom
funcionamento dos organismos vivos (Krukoff et al., 1993).
17 1.1- Complexo Parabraquial (PB)
1.1.1-Organização citoarquitetônica do PB
Rodeando o braço conjuntivo ou pcs é possível visualizar um conjunto de
neurônios que foi primeiramente descrito e nomeado por Olszewski e Baxter (1954), quando faziam um estudo de todo o tronco encefálico de humanos, no qual puderam subdividir o PB em duas principais regiões, o PB lateral (PBL) e PB medial (PBM). Depois de aproximadamente 30 anos, Fulwiler e Saper (1984) em um trabalho
utilizando roedores conseguiram subdividir o PBL em outros sete subnúcleos, e o PBM em dois (Fig. 2). Para tal utilizaram aspectos como, padrão de organização
citoarquitetônica, de conexão e imunorreatividade a determinados neurotransmissores. Nesses estudos utilizando roedores, bem como outras espécies de mamíferos como os
primatas não humanos e humanos (Gioia et al., 2000; Kitamura et al., 2001), também foi possível visualizar uma terceira região, o núcleo Kölliker-fuse (KF). No entanto, foi percebido que essa região é de difícil visualização em primatas, em especial os
humanos (Block e Estes, 1990; Gioia et al., 2000; Lavezzi et al., 2004), talvez devido à grande mielinização presente ao longo de todo o encéfalo, o que dificulta a delimitação
de certas porções neurais.
A parte mais caudal do PB aparece como dois aglomerados celulares mediais ao pcs, formando o PBM, em suas duas subdivisões, o PBM dorsal (PBMd) e o PBM
ventral (PBMv). O PBMd foi encontrado entre o locus ceruleus e o pcs, sendo caracterizado por células fusiformes grandes e longos axônios orientados paralelamente
à superfície medial do pcs. O PBMv foi observado na porção ventral do pcs, e é composto de pequenas células fusiformes possuindo grandes núcleos e nucléolos
18 O PBL aparece lateral ao pcs, e de acordo com o nível anatômico vai sofrendo inúmeras alterações em seus aglomerados celulares, caracterizando subnúcleos dentro
do PBL, mais o KF. Esses subnúcleos possuem distinções histológicas, morfologia e/ou distribuição espacial das células, neuroquímicas e consequentemente funcionais, o que
favorece a delimitação de cada um deles. Até hoje o PBL continua sendo dividido em sete subnúcleos, tanto em roedores (Saper e Loewy, 1980; Fulwiler e Saper, 1984), no qual se evidencia a maioria dos trabalhos, bem como em alguns primatas, incluindo o
homem (Gioia et al., 2000; Kitamura et al., 2001). Esses sete subnúcleos, são nomeados de acordo com sua localização em relação ao pcs, sendo assim denominados, PBL externo (PBLe), PBL ventral (PBLv), PBL dorsal (PBLd), PBL extremo (PBLex), PBL
central (PBLc), PBL interno (PBLi) e PBL superior (PBLs) (Fulwiler e Saper, 1984). O subnúcleo PBLe aparece em secções de níveis mais anteriores e em uma
porção mais lateral do pcs, sendo caracterizado por possuir células fusiformes ou piramidais de forte coloração citoplasmática. O subnúcleo PBLex aparece numa posição superior e ventral em relação ao PBLe, como um aglomerado retangular de
células redondas e multipolares que são ligeiramente menores do que as células do PBLe. O PBLv é composto de células compridas como hastes, paralela a superfície do
pcs. PBLd está localizado na área marginal do PBLe, sendo suas células pequenas e multipolares no formato, e tendo um citoplasma indistinto menos corado do que as células da vizinhança. PBLc aparece primeiro entre PBLv e PBLd e é composto de uma
população de células multipolares relativamente esparsas. PBLc é o maior subnúcleo do PBL e em um nível mais caudal mostra-se fusiforme como se o pcs fosse o
comprimindo contra a superfície dorsal da ponte. PBLi é densamente aglomerado e composto por células multiformes, sendo bastante fácil distingui-lo, uma vez que é
19 lateralmente das grandes e também esparsas células do PBLd. O subnúcleo PBLs encontra-se bem próximo ao PBLd imediatamente rostral ao ponto no qual o colículo
inferior está se conectando ao mesencéfalo. PBLs é densamente composto por células fusiformes (Gioia et al., 2000; Kitamura et al., 2001; Lavezzi et al., 2004).
O subnúcleo KF forma uma extensão ventrolateral do PB e possuem neurônios bem menos unidos do que aqueles do restante do complexo, o que auxilia bastante em sua delimitação. KF é caracterizado por células multiformes, mas com predomínio do
formato arredondado e pequenas. Essas células possuem diâmetros entre 14,6 + 2,8 µm. Caudalmente KF está localizado ventral ao PBLe e ao SCP, e imediatamente rostral ao pólo lateral do SCP (Kitamura et al., 2001, Saper e Loewy, 1980).
Alguns autores ao descreverem uma região específica do PB que é mais responsiva à gustação utilizam a denominação de área “ waist ”. Essa porção aparece
em secções mais caudais do PB e incorpora algumas células do PBLv, a porção mais central do PBM, bem como algumas células do pcs, tendo com isso um formato “acinturado”, e daí o nome em inglês de waist (Galvin et al., 2004). Alguns trabalhos
20 Figura 2. Fotomicrografias de secções coronais do cérebro do rato, mostrando as divisões citoarquitetônicas do PB através dos três níveis, rostral, médio e caudal (à
21
1.1.2-Projeções ascendentes e descendentes do PB
Um grande número de estudos tem tentado elucidar, principalmente, nas últimas
três décadas a base neuroanatômica das áreas de conexões ascendentes e descendentes do PB tanto em roedores (Tokita et al., 2009) como em primatas (Pritchard et al.,
2000). É possível observar que muitas dessas projeções medulares e prosencefálicas são recíprocas e se sobrepõem em várias porções do PB (Granata, 1993).
Yamada e Kitamura (1992) em um trabalho com roedores utilizaram técnicas de
dupla marcação e observaram que uma substancial população de neurônios da medula espinal, principalmente do corno dorsal espinal, projeta-se bilateralmente para os subnúcleos PBLi e PBLe, sem haver possibilidade de projeção para a porção medial do
PB, talvez devido ao tipo de informação levada. Essa projeção pode ser confirmada em trabalhos mais recentes com metodologias diferentes, também em roedores, e exibindo
o mesmo padrão de projeção (Bester et al., 2000; Li J. et al., 2006). O subnúcleo caudal do núcleo trigeminal espinal (Vc) é considerado um homólogo do corno dorsal espinal e talvez devido a isso envie projeções semelhantes às observadas pela medula (Slugg e
Light, 1994).
Estudo com traçadores possibilitaram verificar uma organização topográfica da
projeção proveniente do núcleo paratrigeminal espinal (Pa5), sendo visto que o Pa5 rostral se projeta preferencialmente para o PBM e mais raramente para o PBLi e PBLs, enquanto que a região caudal do Pa5 projeta-se apenas para o PBLv (Feil e Herbert,
1995). O Pa5 intermediário, uma região que está mais envolvido com a informação nociceptiva, projeta-se principalmente para o PBLe e KF, ainda não estando clara as
22 O núcleo do tracto solitário (NST), em suas duas principais porções, NST rostral e o NST caudal, é uma das áreas de mais forte conexão com o PB. Essa projeção, como as
demais, é topograficamente organizada, verificando-se que o NST rostral se comunica com o PBM, carregando informações gustatórias, enquanto que o NST caudal recebe e
envia informações víscero-sensoriais predominantemente para o PBL (Norgren, 1978; Travers, 1988; Suwabe e Bradley, 2009).
Lança e Van Der Kooy (1985) utilizando técnicas de imunofluorescência
combinadas a injeções no PB de marcadores retrógrados identificaram neurônios na área postrema (AP) que tinham conexões diretas com o PB. Essa projeção é direcionada para as duas regiões do PB e mais fortemente para o PBL, talvez devido o seu
envolvimento na regulação cardiovascular e na integração neural e humoral de sensações viscerais, como a dor (Papas e Ferguson, 1990; Menescal-De-Oliveira e
Hoffmann, 1993).
Saper e Loewy (1980) em um trabalho pioneiro utilizando técnicas auto-radiográficas estudaram as projeções eferentes do PB em rato. De forma geral eles
confirmaram projeções ascendentes do PB para regiões talâmicas, hipotalâmicas e corticais. Dentre as áreas prosencefálicas que se comunicam com o PB foi observado
uma forte projeção recíproca com os núcleos talâmicos (Ogawa et al., 1983; Krout e Loewy, 2000) havendo a exceção da porção parvocelular do núcleo posteromedial ventral do tálamo (VPMpc), também chamado de tálamo gustatório, que recebe a maior
aferência do PB (Krout e Loewy, 2000; Tokita et al., 2009). Junto com esse núcleo o PB forma uma das duas possíveis vias da informação gustativa até o córtex já
23 Injeções de marcadores feitos na amígdala e no PB demonstraram que o núcleo central da amígdala (CeA) é o maior recipiente para axônios provenientes do PB, bem
como o que mais envia entradas da amígdala para o PB (Huang et al., 2003; Li et al., 2004). A localização desses eferentes no PB é mais evidenciada na região lateral, uma
vez que a maioria das informações são sensório-viscerais ligadas à gustação e também a nocicepção (Jhamandas et al., 1995; Jia et al., 2005).
Evidências substanciais demonstram que no hipotálamo, a área hipotalâmica
lateral (LH) é a região que possui a mais evidente conexão com o PB (Moga et al., 1990; Lei et al.,2008). A LH está envolvida na avaliação central das entradas gustatórias provenientes, principalmente, do PBL. Juntamente com o CeA e o núcleo
intersticial da estria terminal (BNST), a LH forma a segunda via ascendente, via prosencefálica basal, que possibilita as informações gustatórias chegarem ao córtex (Lei
et al.,2008). Seguindo a mesma idéia do CeA e da LH, já que estão juntos em uma via
de informação, o BNST apresenta forte projeção descendente para os núcleos gustatórios do tronco encefálico, o NST e o PB, sugerindo uma relação na modulação
de comportamentos alimentares (Li e Cho, 2006). Estudos utilizando técnicas de marcação mostraram que neurônios da região gustatória do PB, o PBM, se projetam
para o BNST dorsal, enquanto que a área ventral recebe projeção do PBL. Ambas com predominância ipsilateral e recíproca (Moga et al., 1990; Alden et al., 1994).
Além da conexão do PB com áreas tipicamente relacionadas com informações
sensórias-viscerais e gustativas, foi verificado que o núcleo geniculado lateral dorsal (DLG), considerado o principal transmissor da informação visual ao córtex, sofre uma
modificação em sua ativação causada por alterações nas células do PB. Estudos eletrofisiológicos têm demonstrado que a ativação do PB aumenta significativamente a
24 ocorre (Fjeld et al., 2002; Ozaki e Kaplan, 2006). Outros trabalhos também mostram o envolvimento do PB com relação a esses aspectos visuais, como o de Fite e Janusonis
(2002) que demonstraram, nos roedores gerbil, degus e rato, uma possível aferência retiniana para o PBL.
Por fim, a projeção cortical para o PB origina-se principalmente de neurônios do córtex límbico, pré-frontal lateral (Yasui et al., 1985) e insular (Hanamori et al., 1998), mostrando uma distribuição de terminais corticais específicas em cada porção do PB.
Essas projeções foram mais fortes para os subnúcleos PBLv, PBLc e PBM (Yasui et al., 1985; Moga et al., 1990; Hanamori et al., 1998).
1.1.3- Características neuroquímicas
Muitos neurotransmissores já foram identificados no PB, como por exemplo, a
colecistoquinina, o glutamato (GLU), galanina, serotonina (5-HT), encefalina (ENK), somatostatina, substancia P (SP), neurotensina, acetilcolina (ACh), ácido gama-amino-butírico (GABA), óxido nítrico (NO) entre outros (Herbert e Saper, 1990; Riche et al.,
1990; Berk et al., 1993; Blomqvist et al. 1994; Zhou e Li, 1997). No entanto, o papel funcional preciso de alguns desses neurotransmissores no PB é ainda incerto, mas
alguns deles demonstram uma localização específica a certos subnúcleos indicando sua possível participação na funcionalidade da região. GLU e GABA, são as exceções, uma vez que, inúmeros trabalhos demonstram a ação desses dois neurotransmissores
mediando respostas excitatórias e inibitórias, respectivamente, nas vias que ligam o PB com o NST, áreas talâmicas, amígdala, hipotálamo e córtex (Len e Chan, 2001, Yokota
et al., 2007), além de fazerem parte de mecanismos fisiológicos como os de
25 Dentre os componentes neuroquímicos já evidênciados no PB, a SP e a ENK são considerados os neurotransmissores mais abundantes no PB, envolvidos em uma grande
variedade de funções principalmente nas somatossensoriais (Gebhart, 1982; Morita et al., 1990, Ding et al., 1995 a,b). Inúmeros trabalhos demonstram uma distribuição
homogênea dessas substâncias por todo o PB de roedores, sendo utilizado por alguns autores como um meio de delimitação para essa região (Takatsuki, et al., 1983; Milner e Pickel, 1986; Hermanson e Blomqvist, 1997).
Outro neurotransmissor também já evidenciado no PB é o NO. Funcionalmente ele tem sido implicado nos mecanismos de plasticidade sináptica, principalmente quando envolvem aspectos cognitivos, regulação do fluxo sanguíneo cerebral, entre
outros. No PB ele aparece como um dos mais fortes candidatos a participarem de vias que carregam informações noxias, provenientes de áreas como o BNST, medula espinal
e núcleo trigeminal, por isso sua concentração em roedores é mais evidenciada no PBL (Hayashi e Tabata, 1991; Slugg e Light, 1994; Li, L., et al., 2006).
A serotonina (5HT) também já foi identificada no PB, vinda de neurônios da AP
(Lança e Van Der Kooy, 1985), sendo atribuída a sua presença um importante papel no controle de ingestão do sódio e nos testes de condicionamento aversivo juntamente com
a dopamina (Petr et al., 2006; Tanaka et al., 2004).
1.1.4- Aspectos Funcionais
Funcionalmente o PB se mostra envolvido na regulação cardiovascular (Chamberlin e Saper, 1992; Guo et al., 2005), respiração (Chamberlin, 2004; Mizusawa
et al., 1995), regulação dos fluidos, gustação (Cho e Li, 2008) e processamento de
muitos outros comportamentos complexos (Bielavska et al., 2000; Reilly e Trifunovic,
26 citoarquitetônica dos sistemas de projeções aferentes e eferentes, além da quimioarquitetura presente em cada região mediando todas as suas conexões (Pritchard
et al, 2000).
Evidências anatômicas e eletrofisiológicas sugerem que os neurônios gustatórios
do PB estão localizados principalmente no subnúcleo medial enquanto que as informações viscerais estão representadas na região lateral do PB, mais precisamente, a informação visceral geral (incluindo processos cardiovasculares, respiratórios, e gastrointestinais) (Bernard et al., 1994; Hashimoto et al., 2009). Uma das funções mais
efetivas do PB está relacionada com a gustação, mecanismo responsável por diferenciar nutrientes necessários aos organismos de certas toxinas, levando essa informação para
os centros superiores (Spector et al., 1992). Evidências baseadas em experimentos utilizando testes de condicionamento suportam o conceito que o PB, em roedores, é
necessário para a formação de associações entre os aspectos gustatórios e pós-ingestivos, ou viscerais, da alimentação (Spector et al., 1992; Sclafani et al., 2001). Lesões restritas a porção medial parecem ser o suficiente para fazer o animal perder a
informação sensorial requerida para a aquisição, retenção e restabelecimento de memórias de associação gustatória necessária a sobrevivência do organismo
(Yamamoto et al., 1995). Não cabe só a porção medial o envolvimento com a gustação, é possível perceber que o PBL também está envolvido com a ingestão alimentar. Administração de midazolam, um benzodiazepínico, no PBL promoveu um acentuado
aumento na ingestão alimentar e quando administrada em todo o PB causou aumento no consumo de dieta pastosa mesmo em animais já saciados (Higgs e Cooper, 1996).
O papel inibitório do PBL sobre a ingestão de água e sódio tem sido demonstrado em vários estudos. Lesões eletrolíticas ou químicas (ácido ibotênico) no
27 ingestão hídrica (Ohman e Johnson, 1995). Ainda com estudos de lesão foi possível perceber que rupturas em partes gustatórias do PB aboliam a expressão comportamental
de ingestão de sódio e promovia um maior consumo de quinino, sacarose e NaCl, sugerindo também sua atuação no controle de ingestão de sódio e sacarose (Flynn et al.,
1991).
O PB, principalmente o PBLe, PBLd e PBLs, tem sido reconhecido como um importante relé no processamento sensorial nociceptivo visceral, como por exemplo, os
que possuem aspectos emocionais/afetivos (Bernard et al., 1994; Li, L. et al., 2006; Lapirot et al., 2009). Neurônios no PBL que respondem a estimulação nóxica recebem informações ascendentes de regiões medulares e posteriormente projetam-se
principalmente para a amígdala, formando a via espinoparabraquial-amígdala que constitui um circuito essencial para o componente afetivo-motivacional da dor visceral
(Gauriau e Bernard, 2002; Murphy et al., 2009).
Chamberlin e Saper (1992) demonstraram através de estimulações químicas que, bem especificamente, o PBL evoca um efeito excitatório que se manifesta como
taquicardia e hipertensão. Alterações de pressão sanguínea ou volume promovem expressão da proteína C-Fos nos subnúcleos PBLc, PBLd, PBLe (Rocha e Herbert,
1996). Em situações de hipotensão hemorrágica, o PB é essencial para a restauração da pressão arterial normal e em especial o PBL para a expressão completa da bradicardia que acompanha a hipotensão (Blair et al., 2001).
Além disso, são evidenciados trabalhos que demonstram a participação do PB aumentando a taxa cardíaca e a de captura de oxigênio quando há uma necessidade de
28 mecanismos termorreguladores ao frio, dentre eles o aumento na taxa de captura de oxigênio para a produção de calor (Kobayashi e Osaka, 2003).
No que diz respeito à informações imunológicas, também foi atribuída certa participação dos neurônios do PB (Paues et al., 2006). A projeção do PBLe para a
amígdala estendida, que tem forte participação nos processos imunológicos, foi evidenciada por Buller et al., (2004) no qual administrações de interleucina, uma citocina pró-inflamatória ativava consideravelmente o PB e posteriormente o CeA e o
BNST.
1.2- Sujeito Experimental
Figura 3: Sagui
O sagüi (Callithrix jacchus) é um membro pertencente ao filo Chordata, classe
29 das caatingas e das florestas pluviais atlânticas, bem como a área de transição entre ambos.
É um animal de pequeno porte, medindo cerca de 30 cm de corpo e mais 17 cm de cauda, o que confere equilíbrio ao animal. O seu peso varia entre 230 a 420g e esse
tamanho relativamente pequeno e organização social em pequenos grupos familiares facilita sua instalação em cativeiros.
O sagüi vem adquirindo maior importância para a investigação em neurociência
e áreas afins, incluindo a farmacologia, etologia, genética, endocrinologia e biologia reprodutiva. Isso porque um grande número de características anatômicas encontradas nele, como fissuras laterais, lobos temporais estruturas internas são muito semelhantes
30 2. JUSTIFICATIVA
Considerando a importância fisiológica do complexo parabraquial em grande parte dos processos homeostáticos na maioria dos mamíferos, se faz necessário explorar
as características morfológicas e neuroquímicas desse grupamento neuronal no maior número possível de espécies. Nota-se na literatura, uma escacez de dados sobre o PB em primatas. Portanto o Callithrix jacchus, um primata do novo mundo, que vem sendo
31 3. OBJETIVOS
3.1- Objetivo geral
Caracterizar a citoarquitetura e a composição neuroquímica do Complexo Parabraquial do sagui, o Callithrix jacchus, bem como sua aferência óptica.
3.2- Objetivos específicos
o Verificar o padrão citoarquitetônico do PB, no sagui, comparando-o com padrões
observados em outras espécies de mamíferos, através do método de Nissl.
o Fazer uma caracterização neuroquímica, através do protocolo Avidina-Biotina, do
PB do sagui a fim de delimitar especificamente possíveis subregiões nesta estrutura.
o Mapear a projeção óptica para o PB do sagüi, através da injeção intraocular de
32 4. METODOLOGIA
4.1- Sujeitos
Foram utilizados seis saguis adultos jovens, quatro machos e duas fêmeas, provenientes do núcleo de primatologia da Universidade Federal do Rio Grande do
Norte, estando em boas condições de saúde. Neste local os animais são mantidos em gaiolas de alvenaria e tela de arame, medindo 2,00 x 1,00 x 2,00m, estando expostos às condições de temperatura, umidade e iluminação naturais, com alimentação e água
continuamente à disposição.
Esses animais são também utilizados em vários outros projetos de pesquisas de nosso laboratório que abordam outras regiões do encéfalo. Todos os cuidados são
tomados durante o manuseio dos animais, buscando sempre seu bem-estar, bem como minimizar qualquer possível estresse e/ou sofrimento. Os procedimentos experimentais
seguem estritamente as normas estabelecidas pelo National Research council of the National Academy, publicadas no livro “Guidelines for the Care and Use of Mamals in
Neuroscience and Behavioral Research”. Uma versão em pdf está disponível
gratuitamente no site da Sociedade Brasileira de Neurociências e Comportamento (SBNeC) – http:// www.sbnec.org.br/links.
4.2- Procedimentos experimentais
No dia anterior aos procedimentos, os animais foram mantidos isolados em
gaiolas menores medindo 0,90 x 0,60 x 0,75m, numa sala do Núcleo de Primatologia destinada a quarentena. No dia do experimento os animais foram transportados para o
33
4.2.1-Procedimento Anestésico
Os animais receberam como medicação pré-anestésica o sulfato de atropina na
dose de 0,04 mg/kg, por via subcutânea e 2mg/kg de tramadol por via muscular. Após 15 minutos era administrado como indutor da anestesia, por via intramuscular
quetamina e xilazina, misturadas na mesma seringa, na dose de 20mg/kg e 2mg/kg respectivamente, e para manutenção da anestesia foi utilizado isoflurano através de mascara e oxigênio 100%.
4.2.2-Injeção intraocular de CTb
Após evidênciado a completa anestesia do animal, eles foram submetidos a uma
injeção intra-ocular unilateral de 70 µl de uma solução aquosa da subunidade B da toxina colérica (CTb, List Biological Laboratories, Inc., Campbell, CA) a 5%, contendo
dimetilsulfóxido (DMSO) a 10 % para aumentar a permeabilidade e consequentemente, melhorar a captação da CTb. A injeção foi feita no olho esquerdo, seguindo o protocolo do laboratório, utilizando-se uma agulha calibre 30 (8,00mm X 0,3mm),
lentamente, sob pressão, com auxílio de uma micro-bomba propulsora, que impulsiona a solução num fluxo de 1µl/minuto. Essa agulha é introduzida na junção
esclera-corneal, atingindo o corpo vítreo, em um ângulo de aproximadamente 45º. Após o término do fluxo da solução, a agulha era mantida por mais 15 minutos, visando diminuir um possível refluxo da solução. Após a retirada da agulha foi colocado uma
pomada cicatrizante no olho do animal. Encerrado o procedimento da injeção intra-ocular, os animais retornavam à gaiola de isolamento, permanecendo em observação
34 Passado esse período os animais foram novamente anestesiados, utilizando o mesmo protocolo descrito para a injeção de CTb, para que fosse iniciado o
procedimento de perfusão.
4.2.3-Perfusão
O animal estando completamente anestesiado e imobilizado, é feito um acesso à cavidade torácica seccionando a pele e partes moles, expondo a cavidade abdominal e
fazendo-se a incisão do músculo diafragma para que o coração seja exposto. Posteriormente é feita a inserção no ventrículo esquerdo de uma agulha através do ápice do coração, posicionando-a na direção da aorta, seguindo-se de uma pequena incisão no
átrio direito. Esta agulha é ligada a uma bomba peristáltica (Cole-Parmer) pela qual é passado 500ml de solução salina a 0,9% em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4 com heparina
(2 ml/1000ml) seguida de 700 ml de paraformaldeído a 4% em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4.
4.2.4-Remoção dos encéfalos e microtomia
Após, aproximadamente 2 horas, os encéfalos foram retirados da cavidade
craniana, por fratura dos ossos da calota craniana, em seguida pós-fixados na mesma solução fixadora acrescida de sacarose a 30% por 4 horas e então colocada em outra solução de sacarose a 30% em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4 até serem submetidos a
microtomia. As secções são obtidas por congelamento com gelo seco em um micrótomo de deslizamento. Foram obtidas secções frontais de 30 µm, as quais são distribuidas
sequencialmente em 6 compartimentos, em um meio líquido contendo tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4. Cada um desses compartimentos terá 1 de 6 secções, de maneira que a
35 são armazenados em uma solução anti-congelante à base de etileno-glicol e tampão fosfato e posteriormente conservados a 4ºC até as reações de imunoistoquímica ou
coloração pelo método de Nissl.
4.2.5-Coloração citoarquitetônica
Uma das séries de cada encéfalo é utilizada para coloração citoarquitetônica pelo método de Nissl, utilizando como corante a tionina. Através da coloração por essa
técnica todas as células são tingidas, neurônios ou células da glia, proporcionando a possibilidade de identificá-las através de seus tamanhos, forma e localização. Esse procedimento é feito com cada um dos animais utilizados, uma vez que, podem ocorrer
diferenças individuais nas estruturas cerebrais.
4.2.6-Imunoistoquímica
Cortes da região pontina foram submetidos as técnicas imunoistoquímicas para revelação da CTb transportada anterogradamente, com a finalidade de detectar a
projeção proveniente da retina. As secções são submetidas inicialmente a 5 lavagens de 5 minutos cada, em uma solução de tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4 em agitador.
Segue-se o pré-tratamento, para eliminação de artefatos e recuperação de antigenicidade, com água oxigenada a 0,03% durante 20 minutos. Em seguida as secções são colocadas em contato com o anticorpo primário anti-CTb obtido em cabra (List Labs), diluído em
tampão fosfato contendo Triton X-100 a 0,3% em diluição de 1:5000, contendo soro normal de asno a 2%, por um período de aproximadamente 24 horas em rotor com
rotação lenta. Passado esse período as secções entram em contato com o anticorpo secundário biotinilado anti-cabra obtido em asno (Jackson Laboratories, Inc.,
36 Para visualização da reação os cortes são colocados em contato com o complexo avidina-biotina-HRP por mais 90 minutos (Protocolo Complexo Avidina-Biotina, Kit
elite da Vector), seguindo-se a reação final em um meio contendo peróxido de hidrogênio (H2O2), como substrato e a 3,3’,4,4’ tetrahidrocloreto-diaminobenzina
(DAB), como cromógeno. Esta reação ocorre em torno de 15 minutos. Entre uma etapa e a outra e ao final os cortes são lavados por 5 vezes, de cinco minutos cada, em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4 no agitador orbital. Os cortes foram montados sequencialmente
em lâminas previamente gelatinizadas, as quais, após secarem à temperatura ambiente, eram mergulhadas rapidamente em solução de tretróxido de ósmio a 0,05% para intensificação da reação, seguindo-se a desidratação e diafanização, e só então cobertas
lamínulas. Os cortes de outros compartimentos foram submetidos a imunoistoquímica para os neurotransmissores, SP, ENK, 5-HT. E contra as enzimas óxido nitríco sintetase
(NOS) e Colina acetiltransferase (ChAT). Também foram analisadas através de imunohistoquímica as proteínas ligantes de cálcio calbindina (CB), calretinina (CR) e parvalbumina (PV), além da proteína acídica fibrilar glial (GFAP) e a proteína nuclear
neuronal (NeuN). Na solução contendo o anticorpo primário, em concentrações específicas (Ver tabela 1), era acrescentado soro normal a 2% do animal no qual foi
obtido o anticorpo secundário. Em todos os casos, o anticorpo secundário foi dirigido contra as proteínas do animal no qual foi obtido o anticorpo primário, utilizando na diluição de 1:200. Para visualização da reação foi utilizado o mesmo protocolo ABC
descrito para o CTb.
Os demais compartimentos foram utilizados para repetição, quando necessário,
37
4.2.7-Histoquímica
Foi utilizado o método histoquímico para marcação de NADPH-diaforase. Esse
processo inicia-se diluindo 15 mg de azul de nitrotetrazólio em 0,5 ml de dimetil sulfóxido, formando uma substância I. Em seguida acrescenta-se 300 mg de ácido
málico em um béquer contendo 50 ml de tampão TRIS 0,05M, ajustando-se o pH da solução resultante em 8.0 (passo crítico para a obtenção de uma boa reação). Após o ajuste do pH acrescenta-se 50 mg do composto β-NADP e 20 mg de cloreto de
manganês, formando a solução II. Após a homogeneização desta última, misturam-se as duas soluções, acrescentando-se em seguida 1.5/3 ml de Triton-X100. Uma vez que, a solução resultante é fotossensível ela deve sempre ser protegida da luz com papel
laminado.
As secções foram imersas nessa solução e colocadas para reagir sob agitação
constante a aproximadamente 37°C e protegido da luz. A duração tem uma alta variabilidade que depende da temperatura e da iluminação passando aproximadamente 4 horas em reação. No entanto passado um período de 90 minutos é necessário observar
o grau de marcação em intervalos de 10 minutos. Após a reação é feito 3 lavagens sucessivas em Tampão Fosfato 0.1M de 3 minutos cada ou em tampão TRIS 0.05M
(pH 8.0). Todo esse procedimento histoquímico foi realizado no laboratório de neurobiologia celular da Universidade de São Paulo.
4.3- Análise dos resultados
As lâminas histológicas são analisadas através do microscópio óptico (Olympus BX41) em campo claro. Imagens digitais do PB foram obtidas através de um sistema de
imagem (Nikon digital câmera DXM1200) acoplado ao microscópio. Ajustes de brilho e contraste foram feitos, quando se fizeram necessários, utilizando o Adobe Photoshop
38 Tabela 1: Especificações de concentrações e laboratoriais das substâncias utilizadas nos procedimentos imunoistoquímicos.
Antígeno Anticorpo Primário
Anticorpo
Secundário Soro normal
CTb Cabra [1:9000] List Biological
Asno [1:200]
Sigma Asno [1:200]
NeuN Camundongo [1:1000] Chemicon
Coelho [1:200]
Sigma Coelho [1:50]
ChAT Camundongo
[1:1000] Chemicon
Coelho [1:200]
Chemicon Coelho [1:50]
NOS
Camundongo [1:5000]
Sigma
Coelho [1:200]
Sigma Coelho [1:50]
5-HT Coelho [1:5000] Protos Biotech Cabra [1:1000] Jackson Cabra [1:50]
CB Camundongo
[1:1000] Sigma
Coelho [1:200]
Sigma Coelho [1:50]
CR Coelho [1:1000] Chemicon Cabra [1:1000] Jackson Cabra [1:50]
PV Camundongo
[1:5000] Sigma
Coelho [1:200]
Sigma Coelho [1:50]
GFAP Camundongo [1:2000] Sigma
Coelho [1:200]
39 5. RESULTADOS
5.1- Caracterização citoarquitetônica: Nissl
A coloração pelo método de Nissl mostrou o conjunto de células que formam o complexo parabraquial do sagüi localizado na região dorso-lateral pontina, envolvendo
o pedúnculo cerebelar superior (Fig. 4 A-F). Nas porções mais rostrais este complexo é localizado ventralmente a região do colículo inferior mesencefálico, lateralmente ao aqueduto mesencefálico e dorsal ao núcleo motor do nervo trigêmeo (Fig 4 A-D). Em
suas porções mais caudais o PB é atravessado no sentido crânio-caudal pelo tmV, e se limita medialmente ao quarto ventrículo, mantendo as outras referencias anatômicas (Fig. 4 E-F). A figura 5 (A-C) mostra três níveis rostral, médio e caudal do PB em
maior aumento. Na porção rostral (Fig. 5 A) foi evidenciado 5 subnúcleos do PBL, o PBLe, PBLex, PBLs, PBLc e o PBLv. O PBM mostrou-se subdividido em suas duas
porções o PBMd e o PBMv. Na porção média (Fig. 5 B) o PBL apresenta os subnúcleos PBLi, PBLd, PBLv, PBLc, PBLs, área waist e o KF com esparsas células. O PBM está subdividido em PBMv e PBMd. Na porção caudal (Fig 5 C) o PBL apresentando 4
subnúcleos, o PBLe, PBLd, PBLc, PBLv. O KF está mais evidente e o PBM com suas duas subdivisões PBMv e PBMd.
5.2- Imunorreatividade contra NeuN
A imunoistoquímica contra NeuN apresentou imunorreatividade em toda a
seqüência rostro-caudal do PB (Fig. 6 A - C) e em ambas as regiões lateral e medial. As células são fortemente marcadas e apresentam tamanhos diferenciados caracterizando
40 5.3- Projeção Retiniana ao PB
Fibras\terminais imunorreativas a (CTb-IR) (Fig. 7) foram observadas na região
do PBM, com a maioria da marcação concentrada no PBMd, estendendo-se desde a porção rostral até a mais caudal.
5.4- Neuroquímica
5.4.1-Proteínas ligantes de Cálcio
- Parvalbumina (PV)
A imunorreatividade contra PV não foi encontrada em nenhum dos subnúcleos do PB em seus três níveis (Fig. 8 A-C).
- Calretinina(CR)
No nível rostral (Fig. 9 A) uma distribuição uniforme de células CR-IR foram
marcadas em todo PBL, com pequenas concentrações nos subnúcleos PBLe, PBLex e no PBMv. No nível médio (Fig. 9 B) temos algumas aglomerações celulares CR-IR em todo o PB, com exceção do PBMd. Na secção caudal (Fig. 9 C) neurópilas CR-IR estão
aglomeradas nos subnúcleos PBLc, PBLd e PBLv. O PBMv apresenta marcação diminuída em relação aos outros níveis.
- Calbindina(CB)
No nível rostral (Fig. 10 A) células CB-IR foram encontradas nos subnúcleos PBLc e no PBMv. No nível médio (Fig. 10 B) células CB-IR estão mais concentradas
no PBLe, PBLd, PBLc, PBLs e KF. Enquanto que o PBMv apresentou varicosidades CB-IR. No nível caudal (Fig. 10 C) varicosidades CB-IR são encontradas nos
41
5.4.2- Serotonina (5-HT)
Fibras\terminais 5-HT-IR são encontradas em toda a extensão rostro-caudal do PB
do sagui (Fig. 11 A-C). Essas fibras de maneira geral apresentam varicosidades (Fig. 11 D). No nível rostral (Fig. 11 A) encontramos fibras\terminais 5-HT-IR espalhadas de
forma uniforme por todo o PB. No nível médio (Fig.11 B) os subnúcleos PBLc e PBLe e PBLd apresentam uma maior marcação de fibras 5-HT-IR, e de forma mais espaçada nas demais áreas do PB. No nível caudal (Fig.11 C) uma forte marcação está presente
nos subnúcleos PBLv, PBLc e PBLd. Todo o PBM mostrou fibras 5-HT-IR fortemente marcadas.
5.4.3-Encefalina (ENK)
Uma grande quantidade de fibras ENK-IR se apresenta em toda a região do PB,
rodeando o pcs. No nível rostral (Fig. 12 A) uma maior concentração de fibras ENK-IR estão localizadas nos subnúcleos PBLc e PBMv. Nos níveis médio e caudal (Fig. 12 B e C) um aglomerado de varicosidades ENK-IR (Fig.12 D) estão concentradas na região
correspondente aos subnúcleos PBLd, parte do PBLc, PBLi, PBLv e no PBMd.
5.4.4-Substância P (SP)
SP-IR foi observada em fibras por toda a extensão rostro-caudal do PB (Fig. 13 A-C). No nível rostral (Fig. 13 A) visualizamos fibras SP-IR mais concentradas no
subnúcleo PBLs, e de forma mais espaçada por toda a região do PB. No nível médio (Fig. 13 B) a marcação SP-IR pode ser mais fortemente visualizada ocupando os
42 marcação é mais espaçada. SP-IR no PB apresenta em sua maioria varicosidades (Fig. 13 D).
5.4.5-Óxido nítrico sintetase (NOS)
Neurônios fortemente marcados para NOS-IR são observados no PB do sagui (Fig. 14 A-C). No nível rostral (Fig. 14 A) visualizamos muitas células NOS-IR nos subnúcleos PBLv, PBMd e neurópila NOS-IR no PBLs. Nas outras regiões do PB
também é possível verificar, de forma mais espaçada algumas células NOS-IR. No nível médio (Fig. 14 B) o subnúcleo PBLd foi a única região que apresenta uma considerável marcação de varicosidades NOS-IR. No nível caudal (Fig. 14 C)
encontramos células NOS-IR no PBLc, PBLd, PBLe e bem espaçadas no PBM.
5.4.6-NADPH-diaforase
Uma forte marcação de NADPH- diaforase pode ser observada no PB do sagui. No nível rostral (Fig. 15 A) encontramos muitas células marcadas histoquimicamente para
NADPH-diaforase nas regiões correspondentes aos subnúcleos PBLv, PBLs e PBMd. No nível médio (Fig. 15 B) apenas o PBLs apresentou uma forte marcação em
neurópila. Nas demais regiões é possível observar espaçadas células e fibras. No nível caudal (Fig. 15 C) a marcação é bastante diminuída, apresentando poucas fibras e células ao redor do PB, sem uma especificidade de subnúcleo.
5.4.7-Colina Acetiltransferase (ChAT)
Muitos neurônios ChAT-IR são observados no PB do sagui. No nível rostral (Fig. 16 A) encontramos um grande aglomerado de células ChAT-IR nos subnúcleos PBLv e
43 (Fig. 16 B) visualizamos concentrações celulares de ChAT-IR nos subnúcleos PBLc, PBLv e KF, com algumas fibras rodeando o PB em suas regiões medial e lateral. No
nível caudal (Fig. 16 C) encontramos células ChAT-IR, formando uma neurópila nos subnúcleos PBLc e PBLe. No PBMd é possível visualizamos neurópila ChAT-IR no
PBLc, PBLe e PBMd.
5.4.8-Proteína acídica fibrilar glial (GFAP)
Células gliais, em forma de estrela, provavelmente astrócitos, GFAP-IR foram observadas por todo o PBL de forma bem uniforme, sem nenhuma localização mais específica. Essa característica se mostrou em todos os três níveis rostal (Fig. 17 A),
72 6 – DISCUSSÃO
Nesse estudo trazemos algumas das características morfológicas e neuroquímicas
do PB do sagui, uma estrutura que aparentemente tem se mostrado filogeneticamente estável entre as espécies. O PB pode ser divido em diferentes subnúcleos que tem uma
relação específica com determinadas entradas e saídas de informação, essa complexidade anatômica está refletida na diversidade funcional atribuída a essa região. O PB tem conexões com um grande número de diferentes regiões no prosencéfalo,
tronco encefálico e medula espinal. Muitos de seus neurônios expressam uma grande variedade de substâncias neuroativas que possibilitam a transmissão de cada informação. Além disso, o PB recebe uma grande quantidade de aferências, desta forma
podemos encontrar terminais com uma grande quantidade de substâncias neuroativas espalhadas pelos subnúcleos do PB. O conhecimento do fenótipo neuroquímico nos
diferentes subnúcleos é de fundamental importância para entender o papel funcional dessas regiões, uma vez que, cada uma dessas substâncias são intermediárias na transmissão das informações.
6.1- Caracterização citoarquitetônica
Inicialmente o PB foi subdivido em duas regiões, o PBL e o PBM utilizando o cérebro de humanos (Olszewski e Baxter, 1954). Posteriormente verificou-se em ratos uma terceira possível região o KF, e o PB foi subdividido em mais outros sete
subnúcleos (Fulwiler e Saper, 1984). Essa subdivisão se baseia no padrão morfológico e de distribuição das células, funcionalidade, aspectos neuroquímicos e de conectividade
73 Mostramos em nossos resultados que o PB do sagui apresentou uma organização citoarquitetônica bastante similar ao que já foi mostrado em roedores (Fulwiler e Saper,
1984; Hashimoto et al., 2009). Para fazer essa subdivisão utilizamos como critérios a distribuição e morfologia das células em torno do pcs, padrões neuroquímicos e
comparações com dados pré-existentes. Kitamura et al., (2001), fizeram uma caracterização citoarquitetônica do PB no macaco japonês, Macacus fuscatus, no qual, foi descrito de forma detalhada a morfologia de cada uma dos subnúcleos e que
serviram como base para este trabalho.
Demarcamos no nível rostral do PB, na região correspondente ao PBL, cinco subnúcleos o PBLv, PBLc, PBLs, PBLe e PBLex. O padrão de distribuição dessas
células em subregiões é bem evidente e alguns puderam ser confirmados pela imunorreatividade contra alguns componentes neuroquímicos. O PBM aparece com
duas subregiões, o PBMd localizado numa porção mais dorsal e medial, próximo ao PBLv, e o PBMv mais ventral e lateral em relação ao pcs. No nível médio o PBLex desaparece, o PBLe fica mais caudal e aparece acima dele o PBLs. Entre o PBLv e o
PBLc é possível visualizar as espaçadas células do PBLi. Nesse nível também é possível visualizar a área “waist”, que se forma a partir da união de algumas células do
PBLi, pcs e PBMd. Alguns autores (Halsell e Frank, 1991; Galvin et al., 2004) consideram essa região como um subnúcleo mais responsivo a gustação. É interessante perceber que o formato “acinturado” que lhe propiciou o nome também foi evidenciado
nos nossos dados. Nos nossos dados o PBMd que estava mais cranial em relação ao pcs desce mais e é divido do PBMv pelo tmV. O KF que no rato pode ser bem visualizado
desde o nível mais rostral (Fulwiler e Saper, 1984; Li, L. et al., 2006; Hashimoto et al., 2009), só mostra algumas de suas grandes células a partir do nível médio e de forma
74 al., 2000; Kitamura et al., 2001) essa região é de difícil visualização em primatas e as
vezes imperceptível quando se trata de humanos. Acredita-se que nesses animais a
mielinização presente nessa região não permita a caracterização do KF. No nível caudal, o pcs fica mais achatado causando alterações nos subnúcleos que aparecem
nessa porção. Encontramos nesse nível apenas 4 subnúcleos laterais, o PBLc, PBLv, PBLe e PBLd. O PBM continua com suas duas subdivisões, PBMv e PBMd, bem demarcadas.
Algumas dessas subregiões puderam ser comprovadamente delimitadas utilizando métodos imunoistoquímicos. No entanto é possível perceber que o processamento desses cortes contra as substâncias neuroativas causa certas modificações no formato do
corte, modificando também a localização das regiões em relação à técnica de Nissl.
6.2- NeuN
NeuN é uma proteína nuclear específica de neurônios que é expressa na maioria dos tipos de células neurais dos vertebrados. Devido à especificidade dessa expressão,
NeuN tem se tornado um excelente marcador para fenótipos neurais, bem como um marcador citoarquitetônico de regiões neuronais que juntamente com a tradicional
técnica de Nissl fornecem um arcabouço estrutural e morfológico de regiões em estudo (Muller et al., 1992; Wolf et al., 1996). Essa proteína só é expressa em células que concluíram seus estágios de desenvolvimento, tendo sua funcionalidade já definida
(Sarnat et al., 1998).
Apesar desta proteína ter sido identificada em grande parte das células nervosas,
existem neurônios negativos à NeuN incluindo os neurônios Cajal-Retzius da camada um do córtex cerebral em desenvolvimento, o núcleo olivar inferior no bulbo, as células
75 fotorreceptores na retina (Sarnat et al., 1998). Além disso, NeuN não é expressa em células da glia (Mullen et al., 1992).
Em nossos resultados a reação contra NeuN mostrou neurônios NeuN-IR marcados por todo o PB, primeira vez que essa reação é mostrada nesses neurônios. As células
NeuN-IR mostraram diferentes tamanhos e formas que auxiliaram na subdivisão feita pelo método de nissl.
6.3- Projeção Retiniana
A injeção de CTb, um sensível marcador neuronal, tem possibilitado o estudo mais detalhado das regiões retinorrecipientes de mamíferos (Costa et al., 1999;
Derobert et al., 1999; Cavalcante et al., 2005; Nascimento Jr. et al, 2008). Utilizando essa técnica de traçado neuronal encontramos no PB do sagui, mais especificamente no
PBM, fibras CTb-IR com algumas varicosidades, caracterizando um axônio terminal. Fite e Janusonis, (2002) utilizando três tipos de roedores, camundongo, degus e o gerbil, demonstraram uma aferência retiniana para o PB, no entanto, em todos os três
animais a projeção foi marcada no PBL, região contrária de onde encontramos a projeção do sagui. Essa variação hodológica pode ser uma característica evolutiva
espécie-específica e, portanto, exclusiva do sagui.
O papel funcional dessa projeção no sagui é incerto. Uma conexão exercida pelo PB merece destaque nessa discussão, que é a eferência ao DLG, a principal estação
visual primária a caminho do córtex (Bickford et al, 1993). O PB exerce uma forte modulação sobre os neurônios do DLG, em roedores (Fjeld et al., 2002). Essa
modulação tem sido sugerida ocorrer através de uma projeção colinérgica que parte do PB. Em nossos resultados encontramos uma forte marcação colinérgica na mesma
76 roedores existe uma hipótese de que a inervação óptica seja uma extensão de fibras que chegam ao núcleo da rafe (Fite e Janusonis, 2002). A mesma hipótese não pode ser a
inervação encontrada no sagui, uma vez que foi observada varicosidades, que caracterizam fibras terminais e não fibras de passagem como pode ser a encontrada nos
roedores.
6.4- Caracterização Neuroquímica
O uso de métodos imunoistoquímicos em estudos de estruturas subcorticais tem oferecido dados adicionais que permitem comparações entre diferentes espécies animais com relação à suas propriedades morfológicas e funcionais ao longo da evolução.
6.4.1- Proteínas ligantes de cálcio (PLC): PV, CR e CB.
O cálcio tem um importante papel na sinalização transmembrana e na transmissão intracelular de sinais, e muitas células contêm uma variedade de PLC citosólicas que modula ou media as ações deste íon (Baimbridge et al., 1992). As PLC: PV, CR e CB
são altamente solúveis e podem ser encontradas no citosol, o que facilita estudos de formas neurais e conectividade, sendo por isso, extensivamente utilizadas como
marcadores (Andressen et al., 1993). PV, CR e CB fazem parte de um grupo de PLC denominado EF-hand, de baixo peso molecular e com sequência de aminoácidos semelhantes. Elas estão associadas à diminuição e controle da concentração
citoplasmática do íon cálcio, sendo enão chamadas de “tamponantes”, representando um sistema mais passivo responsável pela diminuição da amplitude dos sinais de cálcio
(Hof et al., 1999). Essas proteínas ocorrem em diferentes subpopulações de neurônios no sistema nervoso central e no periférico, bem como, é possível observar uma grande
77 servirem como indícios de sua importância e funções no sistema nervoso (Scotti e Nitsch, 1991).
Verificamos em nossos resultados uma marcação de células imunorreativas a CB em algumas específicas sub-regiões, como no PBMv, PBLv e região correspondente ao
PBLs e PBLe. A presença de terminais e pericários reativos a CR também foram verificadas por todo o PB, sua distribuição foi bem similar a encontrada com CB. A imunorreatividade para PV mostrou-se de forma negativa em toda a área do PB.
Na literatura não é possível encontrar dados que demonstre, de forma específica, a presença dessas proteínas no PB, sendo esse o primeiro trabalho a mostrar de forma mais detalhada a distribuição das PLC no PB.
Celio, (1990) verificando a distribuição de PV e CB no cérebro do rato, não encontrou marcação para PV no PB. PV foi à primeira PLC descrita e inicialmente
extraída do músculo de um peixe (Gerday, 1982). Alguns trabalhos tem citado seu envolvimento nos mecanismos de sensibilidade epicrítica no sistema sensorial (Scotti e Nitsch, 1991), bem como, com funções mais relacionadas à variados tipos de
movimentos, como por exemplo, os movimentos dos olhos (Celio, 1990; León et al., 1995; Soares et al., 2001). Esses aspectos não estão inseridos, de forma geral, dentre as
funções atribuídas ao PB e talvez devido a isso PV não esteja presente nos neurônios dessa região. Essa ausência de imunorreatividade a PV, não é específica para o PB, ela também foi citada em outras regiões neurais, como por exemplo, em alguns
componentes circadianos de roedor e primata (Cavalcante et al., 2008).
CB foi originalmente extraída do duodeno do pinto, onde possivelmente facilita o
transporte de cálcio através da mucosa (Wassermann and Taylor, 1966), só depois pode ser mapeado no cérebro (Celio, 1990). Alguns trabalhos demonstram a presença de CB
