AVALIAÇÃO DE EFEITOS DE EXTRATOS DE Sambucus australis E Sambucus
nigra NA MARCAÇÃO DE CONSTITUINTES SANGÜÍNEOS COM TECNÉCIO-99M,
NA MORFOLOGIA DE HEMÁCIAS DE RATOS WISTAR, NA TOPOLOGIA
PLASMIDIAL E NA AÇÃO DO CLORETO ESTANOSO NO DNA PLASMIDIAL.
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-graduação em Ciências da Saúde, do Centro de
Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio
Grande do Norte, para a obtenção do título de Mestre
em Ciências da Saúde.
Natal, RN
ii
Camila Godinho Ribeiro
AVALIAÇÃO DE EFEITOS DE EXTRATOS DE Sambucus australis E Sambucus
nigra NA MARCAÇÃO DE CONSTITUINTES SANGÜÍNEOS COM TECNÉCIO-99M,
NA MORFOLOGIA DE HEMÁCIAS DE RATOS WISTAR, NA TOPOLOGIA
PLASMIDIAL E NA AÇÃO DO CLORETO ESTANOSO NO DNA PLASMIDIAL.
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-graduação em Ciências da Saúde, do Centro de
Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio
Grande do Norte, para a obtenção do título de Mestre
em Ciências da Saúde.
Orientador: Prof. Dr. Maria Teresa Jansem de Almeida Catanho
Co-orientador: Prof. Dr. Mario Bernardo-Filho
Natal, RN
iii
Catalogação na fonte
R364a
Ribeiro, Godinho Camila.
Avaliação de efeitos DW extratos de sambucus australis E sambucus nigra na marcação de constituintes sanguineos com tecnécio-99M, na morfologia de Hemácias de ratos wistar, na topologia plasmidial e na ação do cloreto estanoso no DNA Plasmidial / Camila Godinho Ribeiro -Natal, 2008.
38f.
Orientador: Maria Teresa Jansem de Almeida Catanho Co-orientador: Mário Bernardo-Filho
1. Morfologia - dissertação. 2. Tecnécio-99m - dissertação. 3. Marcação de Constituintes Sanguíneos – dissertação. 4. Rádiofármaco – dissertação. I. Medeiros, Aldo da Cunha. II Bernardo-Filho, Mário. III. Título.
RN-UF/BS-CCS CDD: 615.783
iv
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
Prof.Dr. Aldo da Cunha Medeiros
v
AVALIAÇÃO DE EFEITOS DE EXTRATOS DE Sambucus australis E Sambucus
nigra NA MARCAÇÃO DE CONSTITUINTES SANGÜÍNEOS COM TECNÉCIO-99M,
NA MORFOLOGIA DE HEMÁCIAS DE RATOS WISTAR, NA TOPOLOGIA
PLASMIDIAL E NA AÇÃO DO CLORETO ESTANOSO NO DNA PLASMIDIAL.
PRESIDENTE DA BANCA: Maria Teresa Jansem de Almeida Catanho - UFPE
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Aldo da Cunha Medeiros (UFRN)
Prof. Dr. Caroline Wanderley Souto Ferreira Anselmo (UFPE)
Prof. Dr. Geraldo Barroso Cavalvanti Júnior (UFRN)
vi
DEDICATÓRIA
Aos meus pais amados, Luiz de Castro Ribeiro e Sandra Mara Baptista Godinho
Ribeiro, pelo constante incentivo ao estudo e à minha formação, mas principalmente
por serem muito mais do que pais, e sim grandes amigos, que me ensinaram os
reais valores da vida, sem os quais não chegaria até aqui e não iria tão longe como
ainda vou.
Ao querido irmão Marcelo Godinho Ribeiro, que superando a distância física, sempre
se fez tão presente com seu carinho e sua atenção, minha admiração pelo exemplo
de determinação e persistência.
À Vó Nina de Almeida Baptista Godinho e à Tia Maria Lucia de Castro Ribeiro por
estarem sempre prontas a afagar e acolher, minha gratidão pela convivência com
grandissíssimos seres humanos.
Aos Tios Carlos de Almeida Baptista e Shirley Fátima de Oliveira Baptista,
participantes ativos desde o início da minha vida, pelos quais tenho um sentimento
imensurável de respeito e admiração.
vii
AGRADECIMENTOS
A Professora Maria Teresa Jansem de Almeida Catanho, que mesmo distante,
esteve sempre tão disposta a colaborar, participando ativamente de cada etapa.
Ao Professor Mario Bernardo-Filho pela oportunidade de ingressar na pesquisa
básica, e ser hoje formadora de opinião crítica, permitindo ampliar a minha visão da
prática clínica.
Ao Professor Adenilson de Souza da Fonseca, de incontestável competência
científica, que se mostrou um verdadeiro amigo nessa jornada.
Aos amigos Bernardo Machado Rebello, Jacques Natan Grynapel Frydman, Maria
Regina de Macedo Costa, Mônica de Oliveira Benarroz e Rosane de Figueiredo
Neves, companheiros na ciência nos momentos mais árduos, e também, nos mais
felizes.
Ao Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal do
Rio Grande do Norte. Ao auxílio dado pelo CNPq.
Ao serviço de Medicina Nuclear, ao Laboratório de Endocrinologia e ao Laboratório
viii
SUMÁRIO
Dedicatória…………..………...………...vi
Agradecimentos……..………...………....vii
Lista de abreviações…..………...………...ix
Resumo………..………...xi
1 INTRODUÇÃO...…...12
2 REVISÃO DE LITERATURA...…..14
2.1 Sambucus australis e Sambucus nigra...14
2.2 Radionuclídeos em Ciências da Saúde...14
2.3 Radiobiocomplexos...15
2.4 Tecnécio-99m...15
2.5 Marcação de Hemácias com 99mTc...16
2.6 Morfologia de Hemácias...16
2.7 Cloreto Estanoso...17
3 ANEXAÇÃO DE ARTIGO...18
4 COMENTÁRIOS, CRÍTICAS E CONCLUSÕES...24
5 ANEXO...28
6 REFERÊNCIAS...29
Abstract
ix
Lista de abreviações, siglas e símbolos. ANOVA análise de variância
Bq Bequerel (unidade de atividade de amostra radioativa no Sistema
Internacional, sendo que 1 Bq equivale a uma desintegração por segundo)
BC Blood Cell (célula sanguínea)
Ca++ íon cálcio
CAPES Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
Cl- íon cloreto
CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
DNA ácido desoxirribonucléico
FAPERJ Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de
Janeiro
FI-C fração insolúvel da célula
FS-P fração solúvel da célula
FI-P fração insolúvel do plasma
FS-P fração solúvel do plasma
HCO3- íon bicarbonato
keV quiloeletrovolt
MBq megabequerel
mg micrograma
mL microlitro
mg miligrama
99 Mo molibdênio 99
NaCl cloreto de sódio
P plasma
% ATI porcentagem de radioatividade
rpm rotações por minuto
Sn+2 íon estanoso
SnCl2 cloreto estanoso
SPECT Single Photon Emission Computed Tomography
99m
Tc tecnécio-99m
TCA ácido tricloroacético
x Na99mTcO4 pertecnetato de sódio
UERJ Universidade do Estado do Rio de Janeiro
xi
RESUMO
Radiobiocomplexos são utilizados em medicina nuclear para obtenção de imagens e
tratamento de doenças. Constituintes sanguíneos têm sido utilizados como
radiobiocomplexos. Produtos naturais ou sintéticos podem influenciar a marcação
de constituintes sangüíneos com tecnécio-99m (99mTc), a morfologia de hemácias e a ação do cloreto estanoso no DNA plasmidial. Sambucus australis e Sambucus
nigra são utilizados na cultura popular para o tratamento de doenças. O objetivo
desse estudo foi avaliar os efeitos dos extratos de Sambucus australis e de
Sambucus nigra na marcação de constituintes sangüíneos com 99mTc, na morfologia de hemácias de ratos Wistar, na topologia do DNA plasmidial e sua ação sobre os
efeitos do cloreto estanoso no DNA de plasmídios pBSK. Na marcação de
constituintes sangüíneos com 99mTc verificou-se que os dois extratos foram capazes de diminuir significativamente a radioatividade no compartimento celular e na fração
insolúvel do plasma. Sambucus australis diminuiu também a marcação da fração
insolúvel da célula com 99mTc. Os dois extratos não alteraram a morfologia das hemácias. Além disso, foi verificado que um extrato de Sambucus nigra não alterou
o perfil eletroforético do DNA plasmidial, entretanto diminuiu os efeitos do cloreto
estanoso no DNA plasmidial. Estes últimos resultados sugerem um efeito
genotóxico e uma ação protetora do extrato de Sambucus nigra contra a ação do
cloreto estanoso no DNA plasmidial. Este trabalho foi realizado com a colaboração
de diversos Departamentos da área biomédica do Hospital Universitário Pedro
Ernesto, da UERJ, caracterizando uma pesquisa experimental multidisciplinar.
Palavras-chave: constituintes sangüíneos, tecnécio-99m, cloreto estanoso,
1 INTRODUÇÃO
Plantas medicinais são utilizadas mundialmente para prevenção e
tratamento de diversas doenças 1, 2. Muitas dessas plantas apresentam propriedades terapêuticas em determinadas doses e tóxicas em outras 3, podendo resultar em efeitos adversos e interação com outras terapias farmacológicas 4, 5. Além disso, vários efeitos biológicos associados às plantas medicinais ainda não estão bem definidos 6, logo se torna de grande importância uma avaliação dos mecanismos de ação dessas plantas
através de modelos experimentais 7, 8, 9.
Os radiofármacos (radiobiocomplexos) são utilizados em medicina
nuclear para diagnóstico e terapia de diferentes doenças. A obtenção de imagens ocorre
através de sua administração e posterior medida externa da radiação emitida a partir de
órgãos ou tecidos alvos. Dos radiobiocomplexos utilizados para diagnóstico, aqueles que
apresentam o radionuclídeo tecnécio-99m (99mTc) em sua composição representam, aproximadamente, 90% da totalidade 10. Isso ocorre porque o 99mTc apresenta algumas características desejáveis 10, 11. Constituintes sangüíneos marcados com 99mTc têm sido utilizados em diversos procedimentos clínicos em medicina nuclear 11, 12, 13, 14, 15, 16.
O 99mTc também vem sendo utilizado no desenvolvimento de modelos experimentais 7. Um desses modelos utiliza constituintes sangüíneos marcados com 99mTc e tem sido um importante método para a avaliação de efeitos de plantas medicinais
podem alterar a marcação de constituintes sangüíneos com 99mTc, 17, 18, 19, 20, 21, 22 enquanto outras não interferem nessa radiomarcação 23.
Existem diversas espécies do gênero Sambucus. A espécie Sambucus
australis é brasileira, utilizada popularmente como agente diurético, diaforético e
carminativo. Infusões preparadas com as cascas ou as folhas são indicadas para casos de
inflamação, reumatismo, queimadura e dor 24, 25. A espécie Sambucus nigra é nativa da Europa, Ásia e norte da África. Tradicionalmente é utilizada como condimento e corante
alimentar 26, 27. Alguns autores têm demonstrado efeitos antiviral 26, 28, imunomodulador 26, 29
e antioxidante 26, 30.
Esta investigação teve como objetivo avaliar os efeitos dos extratos de
Sambucus australis e de Sambucus nigra na marcação de constituintes sangüíneos com
99mTc, na morfologia de hemácias de ratos Wistar, na topologia do DNA plasmidial e sua
ação sobre os efeitos do cloreto estanoso no DNA de plasmídios pBSK.
Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Radiofarmácia
Experimental do Departamento de Biofísica e Biometria, do Instituto de Biologia Roberto
Alcantara Gomes da Universidade do Estado do Rio de Janeiro (UERJ), com a
colaboração do Serviço de Medicina Nuclear e do Laboratório de Endocrinologia do
Hospital Universitário Pedro Ernesto, UERJ, caracterizando um estudo multidisciplinar. Os
experimentos foram possíveis através de convênio firmado entre a UERJ e a Universidade
Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), sob a orientação dos professores Maria Teresa
Jansem de Almeida Catanho e Mario Bernardo Filho, e na vigência dos auxílios
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Sambucus autralis e Sambucus nigra
Existem diversas espécies de Sambucus (Sabugueiro) na América do
Norte, Europa, oeste da Ásia e norte da África. No Brasil, a espécie Sambucus australis é
encontrada desde a Bahia até o Rio Grande do Sul 24. Em sua composição química, destacam-se como princípios ativos o tanino, os alcalóides, os flavonóides e os
glicosídios. Na forma de tintura, é utilizada como agente diaforético, carminativo e diurético
24
, sendo este comprovado cientificamente 25. Infusões preparadas com as cascas ou as folhas são indicadas para casos de inflamação, reumatismo, queimadura e dor 24, 25.
A espécie Sambucus nigra é nativa da Europa, Ásia e norte da África.
Tradicionalmente é utilizada no preparo de vinhos e doces e, também, como condimento e
corante alimentar 26, 27. Na cultura popular é utilizada como diaforético, diurético, adstringente, laxante e emético 26. Pesquisas têm demonstrado efeitos antiviral 28, imunomodulador 29 e antioxidante 26, 30. Os componentes químicos incluem os flavonóides, as antocianinas 31, as hemaglutininas 32, os glicosídeos 33, ácido vibúrnico e vitaminas A e C 34.
2.2 Radionuclídeos em Ciências da Saúde
Radionuclídeos são utilizados em medicina nuclear com finalidade
diagnóstica e terapêutica, alguns são encontrados na natureza, enquanto outros podem
como fontes de radiação (radioterapia) e como traçadores biológicos (diagnóstico por
imagem) 7, 11.
2.3 Radiobiocomplexos
Radiobiocomplexos são estruturas moleculares ou celulares marcadas
com radionuclídeos, utilizados em medicina nuclear para obtenção de imagens (com
radionuclídeos emissores de radiação gama ou que decaiam por captura eletrônica) 35, 36, 37 e para tratamento em humanos (com radionuclídeos emissores de radiação beta) 7, 35, 38, 39. Dependendo da indicação e da dose, os radiobiocomplexos podem ser administrados
por via oral, venosa ou aérea. Essas substâncias devem ser estéreis e apirogênicas 10, 35. Os exames da medicina nuclear são procedimentos não invasivos, sem
ação farmacológica, com as vantagens de avaliar o metabolismo do tecido ou órgão alvo e
de expor o paciente e os profissionais envolvidos a mínimas doses de radiação 10.
Utilizados com a finalidade terapêutica, os radiobiocomplexos captados
podem promover a destruição de células tumorais 10.
2.4 Tecnécio-99m
O 99mTc é amplamente utilizado para obtenção de imagens cintilográficas na medicina nuclear tipo SPECT (single photon emission computed
tomography) 36, 37. Isto ocorre devido a algumas características apresentadas por este radionuclídeo: (i) facilmente obtido do gerador 99Mo/99mTc; (ii) meia vida física de 6 horas; (iii) emissão de radiação gama de 140 keV; (iv) baixa dose de radiação para o paciente e
2.5 Marcação de hemácias com 99mTc
Hemácias marcadas com 99mTc são utilizadas em medicina nuclear para avaliação do sistema cardiovascular 11, 12, volemia 11, 13 e hemorragias gastrintestinais 11, 14, 15, 16
.
Existem diferentes metodologias para a marcação de hemácias com
99mTc 35, 40. Nos métodos que empregam a marcação in vitro, o sangue isolado é incubado
com o íon estanoso (Sn+2) e posteriormente com íon pertecnetato (99mTcO4-) 40.
2.6 Morfologia de hemácias
As hemácias são células anucleadas, bicôncavas e extremamente
flexíveis, permitindo a sua passagem pela microcirculação, onde têm sobrevida média de
120 dias. Sua principal função é transportar a hemoglobina, a qual carreia oxigênio e gás
carbônico no sangue 41, 42, 43.
A membrana plasmática das hemácias é formada por proteínas
integrais intensamente ligadas à bicamada fosfolipídica 41, 42. A proteína banda-3 é a responsável pela troca do íon bicarbonato (HCO3-) pelo íon cloreto (Cl-), sendo freqüentemente denominada de trocador de cloreto-bicarbonato 41, 44. Estudos demonstraram que na marcação de hemácias com 99mTc, o íon 99mTc O4- atravessa a membrana utilizando o sistema de transporte iônico da banda-3 45. Somando-se a isso, o agente redutor cloreto estanoso (SnCl2) também parece ser transportado para o interior da hemácia por um sistema de transporte específico, o canal de cálcio (Ca++) 46.
Autores têm relatado que extratos de algumas plantas medicinais, como
Passiflora edulis f. Flavicarpa 22 podem alterar a morfologia das hemácias, enquanto outras, como a Pfaffia sp. 23 e Cinnamomum zeylanicum 19 não influenciam a sua morfologia.
2.7 Cloreto Estanoso
O processo de marcação de células e moléculas com o 99mTc baseia-se na utilização de um agente redutor, visto que o íon pertecnetato de sódio (Na99mTcO4) eluído do gerador não se liga facilmente a outras espécies químicas. Por esta razão,
torna-se necessária a redução deste radionuclídeo do número de oxidação +7 para
valores mais baixos (+3, +4, +5). O SnCl2 é o agente redutor mais utilizado com este propósito (50), sendo a sua eficiência de redução do íon 99mTcO4- superior a de outros agentes 11.
Apesar de sua aplicação em Ciências da Saúde, tem sido descrito que
3 ANEXAÇÃO DE ARTIGO
3.1 Artigo publicado no periódico “Brazilian Archives of Biology and Technology” (2007,
Evaluation of the Effect of an Extract of
Sabugueiro (Sambucus australis)
on the Labeling
of Blood Constituents with Technetium-99m
Camila Godinho Ribeiro 1,2, Bernardo Machado Rebello1,2, Rosane de Figueiredo
Neves1,2, Sebastião David Santos-Filho1,2, Adenilson de Souza da Fonseca1, Aldo da
Cunha Medeiros2, Mario Bernardo-Filho2,3 and Maria Teresa Jansem de Almeida
Catanho4
1- Laboratório de Radiofarmácia Experimental, Departamento de Biofísica e Biometria, Instituto de Biologia Roberto Alcantara Gomes, Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Av. 28 de setembro, 87, 20551-030, Rio de Janeiro, RJ, Brasil, cacagr@yahoo.com.br
2- Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, A. Gal. Gustavo Cordeiro de Farias, s/n, 59010-180, Natal, RN, Brasil
3- Coordenadoria de Pesquisa, Instituto Nacional do Câncer, Praça Cruz Vermelha, 23, 20230-130Rio de Janeiro, RJ, Brasil
4- Universidade Federal de Pernambuco, Departamento de Biofísica e Radiobiologia,Av. Prof. Moraes Rego s/n, 50670-420, Recife, PE, Brasil
ABSTRACT
Sambucus australis (sabugueiro) has been used to treat inflammatory and rheumatologic disorders. Blood constituents labeled with technetium-99m (99mTc) have been used in nuclear medicine to obtain diagnostic images. The aim of this work was to evaluate the effect of a sabugueiro extract on the labeling of blood cells with 99mTc. Blood samples from Wistar rats were incubated with sabugueiro extract and the radiolabeling assay of blood constituents was carried out. After centrifugation, samples of plasma and blood cells were separated. Aliquots of plasma and blood cells were precipitated with trichloroacetic acid and centrifuged to isolate soluble and insoluble fractions. The radioactivity in each fraction was counted and the percentage of activity (%ATI) was determined. Incubation with sabugueiro extract altered significantly (p<0.05) the %ATI incorporated to the blood constituents. These results could be explained due the presence of chemical substances in the sabugueiro extract that present redox and/or chelating action altering the labeling of the blood constituents with 99mTc.
Key words: Sambucus australis, blood constituents, technetium-99m.
INTRODUCTION
Epidemiological and clinical studies have proved the beneficial effect of bioactive compounds of medicinal plants used in phytotherapy on prevention of several diseases (Kery et al., 2004). Moreover, investigations in basic research have permitted to understand better some properties related with the medicinal plants (Fonseca et al., 2005; Bernardo-Filho et al., 2005).
Sambucus australis, known as sabugueiro in Brazil, is used in folk medicine as diuretic, to treat inflammation, burn, pain and rheumatologic disorders (Guarrera et al., 2005; Jorge et al., 1999). In Brazil, sabugueiro is found from the Bahia State up to Rio Grande do Sul State.
Blood constituents labeled with 99mTc have also been used as experimental model to evaluate the redox properties of synthetic
and natural drugs (Abreu et al., 2006; Fonseca et al., 2007).
The labeling of blood constituents with 99mTc is based on the utilization of a reducing agent, and the stannous chloride (SnCl2) is
commonly used for this purpose. The radionuclide is used as sodium pertechnetate (Na99mTcO4). In the
labeling of red blood cells, the band-3 proteins and calcium channels seem to have strong importance to these ions reach cellular compartment (Callahan & Rabito, 1990; Gutfilen et al., 1992). The factors, as natural drugs, that can influence the labeling of blood constituents have been reported (Bernardo-Filho et al., 2005).
The aim of this work was to evaluate the influence of a sabugueiro extract on the labeling of blood constituents with 99mTc.
MATERIALS AND METHODS
Commercial Sambucus australis was obtained from the Rodomonte Laboratório Vegetal (Belo Horizonte, Brazil).
To experimental procedures the commercial sabugueiro extract (1000 mg/mL) was diluted in 0.9% NaCl solution (saline) to obtain the different concentrations (500, 250, 125, 62.5 and 31 mg/mL). A spectrophotometric analysis (Analyser, 800M, São Paulo, Brazil) of the extract was carried out (400 up to 700nm) with intervals of 10nm. The absorbance at 500 nm was considered the marker of preparation of this extract. It was also determined the pH of this preparation by standard indicator of pH (Merck, Germany). All the prepared extracts to be used in the experiments must have the optical density of 1.34±0.028 at 500 nm (Figure 1) and the pH 5.
Wistar male rats (250-300 g) from
Universidade do Estado do Rio de Janeiro, food and water ad libitum, maintained under constant environmental conditions (23±2ºC, 12h/12h of light/dark cycle) were used in experiments. The protocol was approved by the Ethical Committee to handle animals in experiments of the Instituto de Biologia Roberto Alcantara Gomes, Universidade do
Estado do Rio de Janeiro, with the number CEA/126/2006.
In vitro labeling of blood constituents with 99mTc was carried out as described in Bernardo-Filho et al. (1983).
Blood samples (0.5 ml) were incubated with 100µl of different concentrations of sabugueiro extract (500, 250, 125, 62.5 and 31 mg/mL) for 1 hour at room temperature. Blood samples were incubated with 0.9% NaCl solution as control. Then, 0.5ml of stannous chloride (Sigma Chemical Co., USA) (1.2µg/ml) solution freshly prepared was added and the incubation continued for another 1 hour. After this period of time, 99mTc (0.1ml), as sodium pertechnetate (Na99mTcO4), recently milked
from a 99Molybdenium/99mTechnetium generator (Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares, Comissão Nacional de Energia Nuclear, São Paulo, Brazil), was added and the incubation continued for 10 minutes. These samples were centrifuged (clinical centrifuge, 1500 rpm, 10 minutes) and plasma (P) and blood cells (BC) were separated. Samples (20µl) of P and BC were also precipitated with 1ml of trichloroacetic acid (5%) and soluble (SF) and insoluble fractions (IF) were separated after centrifugation (clinical centrifuge, 1500 rpm, 10 minutes). The radioactivity in P, BC, P, SF-P, IF-BC and SF-IF-BC were determined in a well counter (Automatic Gamma Counter, C5002, Packard, USA) and percentage of radioactivity (%ATI) was calculated, as previously described (Bernardo-Filho
et al., 1983).
Data are reported as media ± standard deviation of %ATI and absorbance. Statistical analysis was performed by One-way ANOVA followed by Bonferroni post-test with p<0.05 as significance level.
RESULTS
Figure 1: Absorption spectrum of sabugueiro extract.
Table 1 shows the distribution of the radioactivity between plasma and cellular compartments of blood incubated with sabugueiro extract. The data presented in this table suggest that the incubation with sabugueiro extract induces a significant (p<0.05) alteration of the distribution of radioactivity between these compartments.
Table 2 shows the fixation of the radioactivity in the insoluble fraction of plasma obtained from whole blood treated with sabugueiro extract. The analysis of these results indicates that the extract used is capable of significantly (p<0.05) modify the fixation of 99mTc on the insoluble and soluble fractions of plasma.
Table 1- Effect of a sabugueiro extract on the distribution of 99mTc between plasma and cellular
compartments. Sabugueiro extract (mg/mL) %ATI Cells %ATI Plasma 0.00 (control) 96.50±1.03 3.50±1.03
31(*) 92.14±0.69 7.86±0.69
62.5(*) 91.28±1.14 8.72±1.14
125.0(*) 87.30±3.27 12.70±3.27
250.0(*) 65.52±3.08 34.48±3.08
500.0(*) 27.47±4.95 72.53±4.95
Blood samples were incubated with a sabugueiro extract for 1 hour. The radiolabeling of blood constituents was performed; the samples were centrifuged to plasma (P) and blood cells (BC) separation. The radioactivity in plasma (P) and blood cells (BC) was counted and the percentage of
radioactivity (%ATI) was calculated. (*) p<0.05 when compared with control.
Table 2 - Effect of a sabugueiro extract on the fixation of 99mTc on insoluble and soluble
fractions of plasma. Sabugueiro extract (mg/mL) %ATI IF-P %ATI SF-P 0.00 (control) 69.01±1.35 30.99±1.35
31(*) 55.51±4.52 44.49±4.52
62.5(*) 57.04±4.44 42.96±4.44
125.0(*) 52.43±1.89 47.57±1.89
250.0(*) 51.49±9.65 49.51±9.65
500.0(*) 51.62±1.97 48.38±1.97
Blood samples were incubated with a sabugueiro extract for 1 hour. Radiolabeling of blood constituents was performed; the samples were centrifuged to plasma (P) and blood cells (BC) separation. Aliquots of P were precipitated with trichloroacetic acid and insoluble (IF) and soluble fraction (SF) were separated. The radioactivity in SF-BC and IF-BC was counted and the percentage of radioactivity (%ATI) was calculated. (*)
p<0.05 when compared with control.
Table 3 shows the effect of sabugueiro extract on the fixation of the radioactivity on the insoluble and soluble fractions of blood cells. The results indicate a significant (p<0.05) modification of fixation of 99mTc on insoluble and soluble fractions of the blood cells from blood samples incubated with sabugueiro extract.
Table 3 - Effect of a sabugueiro extract on the fixation of 99mTc on insoluble and soluble
fraction of blood cells. Sabugueiro extract (mg/mL) %ATI IF-BC %ATI SF-BC 0.00 (control) 78.48±0.29 21.52±0.29
31(*) 51.78±2.02 48.22±2.02
62.5(*) 54.38±2.68 45.62±2.68
125.0(*) 52.77±8.02 47.23±8.02
250.0(*) 52.15±8.74 47.85±8.74
500.0(*) 53.74±4.81 46.26±4.81
Blood samples were incubated with a sabugueiro extract for 1 hour. Radiolabeling of blood constituents was performed; the samples were centrifuged to plasma (P) and 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6
400 420 440 460 480 500 520 540
blood cells (BC) separation. Aliquots of BC were precipitated with trichloroacetic acid and insoluble (IF) and soluble fraction (SF) were separated. The radioactivity in SF-BC and IF-BC was counted and the percentage of radioactivity (%ATI) was calculated. (*) p<0.05 when compared with control.
DISCUSSION
There are evidences that natural drugs could affect the radiolabeling of red blood cells with 99mTc and some findings have been considered in the development of an experimental model to verify properties of these drugs (Santos-Filho et al., 2005; Abreu et al., 2006, Freitas et al., 2007). Moreover, the possible interference of the medicinal plants on the nuclear medicine procedures based on red blood cells labeled with 99mTc and the consequences in the interpretation of these examinations could be considered.
Investigators have reported that natural products, as Coffea arabica, Mentha crispa and
Psidium guajava are able to interfere with the labeling of BC with 99mTc. Furthermore, extracts of Sechium edule and Pfaffia sp. do not alter the fixation of this radionuclide on the blood constituents (Oliveira et al., 2003; Santos-Filho et al., 2004; Abreu et al., 2006; Diré et al., 2004; Fernandes et al., 2005).
Sambucus australis is one of the plants widely used in popular medicine in Brazil due to its diuretic action, as well as is indicated to inflammation, burn, pain and rheumatologic disorders (Guarrera et al., 2005).
Our data suggest that the sabugueiro extract was capable to modify the distribution of the radioactivity between the cellular and plasma compartments reducing the uptake of 99mTc in the cellular compartment (Table 1). The %ATI was also reduced in the insoluble fractions of plasma and cells form blood samples incubated with this extract (Tables 2 and 3). As the fixation of the 99mTc depends on the presence of a reducing agent, it is possible to suggest that chemical substances in sabugueiro extract could present redox and/or chelating actions that could to alter the labeling of the blood constituents with 99mTc. These properties have also been suggested to other medicinal plant, as Hypericum perfloratum,
Coffea arabica, Mentha crispa and Gingko biloba
(Santos-Filho et al., 2005; Oliveira et al., 2003; Santos-Filho et al., 2004; Moreno et al., 2004). Other possibility could be an alteration on the ion transport systems of Sn++ and pertechnetate through of membrane of red blood cells, which could interfere on the labeling of the blood constituents with 99mTc. In fact, alterations on the membrane of red blood cells and reduction of labeling of red blood cells have been reported to other extracts, as Coffea arabica, Mentha crispa and Gingko biloba (Oliveira et al., 2003; Santos-Filho et al., 2004; Moreno et al., 2004).
In conclusion, our experimental data showed that the labeling of blood constituents with 99mTc could be altered in the presence of
sabugueiro extract. These findings suggest that chemical compounds in this extract could present redox and/or chelating properties capable to interfere in this labeled assay with 99mTc. Morphological experiments are ongoing to try to verify the action of this extract on the shape of the red blood cells.
ACKNOWLEDGEMENTS
This research was supported by Universidade Federal do Rio Grande no Norte, Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) and Universidade do Estado do Rio de Janeiro.
RESUMO
precipitadas em ácido tricloroacético e centrifugadas para isolamento das frações solúvel (FS-P e FS-C) e insolúvel (FI-P e FI-C). A radioatividade em cada fração foi contada e a porcentagem de radioatividade incorporada (%ATI) foi determinada. A incubação com o extrato de sabugueiro alterou significativamente (p<0.05) a %ATI dos constituintes sangüíneos Esses resultados poderiam ser explicados devido à presença de substâncias químicas no extrato de sabugueiro com ação redox e/ou quelante, que poderiam alterar a marcação dos constituintes sangüíneos.
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4 COMENTÁRIOS, CRÍTICAS E CONCLUSÕES
O ingresso no Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte contribuiu imensamente para o meu
desenvolvimento profissional na pesquisa básica e tem ampliado minha visão crítica na
prática da fisioterapia.
A convivência no laboratório, a troca de experiências com profissionais
de diferentes áreas da saúde, o aprendizado de diversas metodologias, o cumprimento
dos créditos, a elaboração de artigos e trabalhos para eventos científicos, cada etapa
experimentada na pesquisa básica foi imprescindível para o desenvolvimento de uma
visão científica, criando bases sólidas para a prática clínica.
Paralelamente ao crescente interesse nas plantas medicinais para
prevenção e tratamento de diversas doenças, há um aumento da preocupação
relacionada aos riscos associados ao consumo dessas plantas. Isto se deve ao fato de
que sua origem natural não implica necessariamente em ausência de efeitos adversos. O
consumo dessas plantas, muitas vezes indiscriminado, também é feito por pacientes que
nos têm procurado profissionalmente.
Desta forma, o elevado consumo e o conhecimento restrito sobre os
efeitos adversos de plantas medicinais despertou o interesse em estudar os seus efeitos e
mecanismos de ação em sistemas biológicos. Foi apresentado ao Programa de
Pós-Graduação em Ciências da Saúde o projeto de tese intitulado “Avaliação do efeito de um
com tecnécio-99m, na morfometria de hemácias e na biodisponibilidade do radiofármaco
pertecnetato de sódio”.
Os modelos experimentais bem estabelecidos e de fácil execução
foram fundamentais para o desenvolvimento deste trabalho, onde avaliou-se os efeitos
dos extratos de Sambucus australis e Sambucus nigra na marcação de constituintes
sangüíneos com 99mTc, na morfologia de hemácias de ratos Wistar, bem como seu
potencial genotóxico e sua ação sobre os efeitos do cloreto estanoso em plasmídios
bacterianos.
O caráter multidisciplinar deste estudo, que foi realizado com a
colaboração do Serviço de Medicina Nuclear e do Laboratório de Endocrinologia do
Hospital Universitário Pedro Ernesto, foi de grande relevância no surgimento de novas
diretrizes.
Com os resultados obtidos com os estudos sobre a espécie Sambucus
australis foi elaborado o artigo “Evaluation of the Effect of an Extract of Sabugueiro
(Sambucus australis) on the Labeling of Blood Constituents with Technetium-99m”, aceito
para publicação no periódico “Brazilian Archives of Biology and Technology”, indexado no
Scielo, Qualis Internacional B.
Os procedimentos experimentais realizados com a espécie Sambucus
nigra foram descritos sob a forma de apêndice e estão sendo utilizados na elaboração do
segundo artigo.
Na marcação de constituintes sangüíneos com 99mTc, foi observado
que as maiores concentrações de um extrato de Sambucus nigra (250,0 e 500,0 mg/mL)
fração insolúvel do plasma. Esses resultados poderiam ser explicados pela interação dos
componentes fenólicos, como os flavonóides, na estrutura da membrana. Entretanto, a
análise morfológica indica que o extrato de Sambucus nigra não alterou a forma das
hemácias. Esse resultado sugere que o extrato de Sambucus nigra não modifica a
estrutura da membrana e que outros mecanismos estariam relacionados ao efeito desse
extrato na radiomarcação de constituintes sangüíneos.
Tem sido relatado que os componentes químicos do extrato de
Sambucus nigra possuem propriedades antioxidantes (26). Além disso, é descrito que o cloreto estanoso induz lesões no DNA pela geração de radicais livres, que poderia ser
diminuida pela presença de agentes antioxidantes (18, 51). Para verificar se a ação redox estaria relacionada ao efeito do extrato de Sambucus nigra na radiomarcação de
constituintes sangüíneos, plasmídios foram tratados com cloreto estanoso na presença do
extrato. Os resultados obtidos mostram que o extrato de Sambucus nigra foi capaz de
proteger o DNA plasmidial contra o efeito do cloreto estanoso. Esses dados indicam que
na presença do extrato de Sambucus nigra, o perfil eletroforético de plasmídios tratados
com cloreto estanoso é similar ao do plasmídios incubados com água destilada. Outro
importante efeito biológico estudado foi o potencial genotóxico do extrato de Sambucus
nigra, no qual observou-se que o perfil eletroforético e a quantificação das formas
topológicas de plasmídios incubados com o extrato não apresentaram alterações.
Os resultados apresentados sugerem uma propriedade redox do extrato
e poderiam indicar que o efeito obtido na radiomarcação de constituintes sangüíneos está
A interação das plantas medicinais com outras drogas pode influenciar
os resultados de exames, inclusive os da medicina nuclear, o que poderia levar a
diagnósticos imprecisos e a conseqüente repetição do exame, expondo o paciente e a
equipe profissional a doses adicionais de radiação. Como fisioterapeuta, utilizo os exames
complementares para endossar o diagnóstico físico-funcional, e, por conseguinte, traçar a
conduta terapêutica mais adequada.
Acredito que os resultados contidos neste trabalho possam contribuir
para a melhor compreensão dos possíveis efeitos de plantas medicinais e sua interação
com outras drogas e, dessa forma, auxiliar os profissionais da área da saúde com novos
parâmetros que possam interferir no diagnóstico e tratamento dos pacientes, até agora
não amplamente discutidos.
Outras metodologias devem ser realizadas para um maior
esclarecimento dos efeitos biológicos dos extratos de Sambucus australis e Sambucus
nigra. Assim, a avaliação dos efeitos dos extratos de Sambucus australis e Sambucus
nigra na biodisponibilidade do radiofármaco pertecnetato de sódio poderá trazer
importantes informações sobre os efeitos, em nível sistêmico, desses extratos. Outra
contribuição relevante poderá ser a avaliação do efeito citotóxico dos referidos extratos em
culturas bacterianas. Isso poderá contribuir para melhor avaliação das conseqüências e
possíveis tipos de lesões induzidas no material genético. Para tanto, serão utilizadas
culturas bacterianas de linhagens proficientes ou deficientes em genes cujos produtos são
5 ANEXO
Carta de Aceite
Brazilian Archives of Biology and Technology
DECLARAÇÃO
Declaramos para os devidos fins que o artigo:
“
Evaluation of the Effect of
an Extract of Sabugueiro (Sambucus australis) on the Labeling of Blood
Constituents with Technetium-99m
”,
de autoria
de Camila Ribeiro
Godinho, Bernardo Machado Rebello, Rosane de Figueiredo Neves,
Sebastião David Santos-Filho, Adenilson de Souza da Fonseca, Aldo da
Cunha Medeiros, Mario Bernardo-Filho and Maria Teresa Jansem de Almeida
Catanho,
foi aceito e será publicado no
Brazilian Archives of Biology and
Technology.
Curitiba, 11 de setembro de 2007
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Abstract
Radiobiocomplexes are used in nuclear medicine to obtain images and to treat diseases.
Blood constituents have been used as radiobiocomplexes. Natural or synthetic products
can influence on the labeling of blood constituents with technetium-99m (99mTc), the morphology of red blood cells and on the stannous chloride (SnCl2) action on plasmid DNA. Sambucus australis and Sambucus nigra are used in popular culture for treating
diseases. The aim of this work was to evaluate the effects of the extracts of Sambucus
australis and Sambucus nigra on the labeling of blood constituents with 99mTc, on morphology of red blood cells of Wistar rats, on the topology of plasmids DNA and the
action against the SnCl2 effects on the DNA of plasmids pBSK. On the labeling of blood constituents with 99mTc it was verified that both extracts were capable to decrease significantly the radioactivity in the cellular compartment and in the insoluble fraction of
plasma. Sambucus australis also decreased the labeling of insoluble fraction of blood cells
with 99mTc. Both extracts did not alter the morphology of red blood cells. Moreover, it was verified that Sambucus nigra did not alter the electrophoretic profile of plasmid DNA, but
decreased the effect of SnCl2 on plasmid DNA. These last results sugest a genotoxic effect and a protective action of Sambucus nigra extract against the SnCl2 action on plasmid DNA. This work was developed with the contribution of several Departments of
biomedical area of the Hospital Universitário Pedro Ernesto, of the UERJ, characterizing a
multidisciplinary experimental research.
Key-words: blood constituents, technetium-99m; stannous chloride, morphology, plasmid
Apêndice
1 - Materiais e Métodos - Morfologia de Hemácias
Amostras de sangue de ratos Wistar foram tratadas in vitro, nas mesmas
concentrações utilizadas nos estudos de radiomarcação, com extratos de Sambucus
australis e Sambucus nigra por uma hora. Em seguida, distensões sangüíneas foram
preparadas, secadas, fixadas e coradas pelo método May-Grünwald-Giemsa. A análise
morfológica qualitativa foi realizada em microscópio óptico.
2 - Fotomicrografia de distensão de sangue tratado com solução salina (controle).
Amostras de sangue de ratos Wistar
3 - Fotomicrografia de distensão de sangue tratado com um extrato de
Sambucus australis (500,0%).
Amostras de sangue de ratos Wistar
foram tratadas com um extrato de
4 - Relação perímetro/área de hemácias de amostras de sangue de ratos Wistar tratadas com diferentes concentrações de um extrato de
Sambucus australis.
Hemácias de ratos Wistar foram tratadas com diferentes concentrações de um extrato de
Sambucus australis. Como controle, amostras de sangue foram incubadas com solução salina. Em seguida, distensões sangüíneas foram preparadas, secadas e coradas pelo método May-Grünwald-Giemsa. As lâminas foram analisadas por microscopia óptica (aumento de 1000x) e as imagens capturadas para análise. e determinação da relação perímetro/área das hemácias.
0,0 31,0 62,5 125,0 250,0 500,0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 re la ç ã o p e rí m e tr o /á re a ( 1 /m m 2 )
5 - Espectro de absorção de um extrato de Sambucus nigra
Sambucus nigra
0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000 1,200 1,400
400 420 440 460 480 500 520 540
Comprimento de onda (nm)
A
b
s
o
rb
â
n
c
ia
6 - Efeito de um extrato de Sambucus nigra na distribuição do 99mTc nos compartimentos plasmático e celular.
Concentração de
Sambucus nigra (mg/mL)
Célula
%ATI
Plasma
%ATI
0,00 98,22±0,71 1,78±0,71
31,0 97,17±2,73 2,83±2,73
62,5 96,75±2,85 3,25±2,85
125,0 90,08±11,80 9,92±11,80
250,0(*) 81,15±12,48* 18,85±12,48
500,0(*) 70,43±11,91* 29,57±11,91
Amostras de sangue foram incubadas com um extrato de Sambucus nigra
7 - Efeito de um extrato de Sambucus nigra na fixação do 99mTc nas frações insolúvel e solúvel do plasma.
Concentração de
Sambucus nigra (mg/mL)
Fração insolúvel
%ATI
Fração solúvel
%ATI
0,00 69,94±6,25 30,06±6,25
31,0 60,94±10,79 39,06±10,79
62,5 62,97±9,57 37,03±9,57
125,0 60,10±19,41 39,90±19,41
250,0(*) 23,25±8,45* 76,75±8,45
500,0(*) 24,57±12,67* 75.43±12,67
Amostras de sangue foram incubadas com um extrato de Sambucus nigra
8 - Efeito de um extrato de Sambucus nigra na fixação do 99mTc nas frações insolúvel e solúvel da célula.
Concentração de
Sambucus nigra (mg/mL)
Fração insolúvel
%ATI
Fração solúvel
%ATI
0,00 87,71±6,68 12,29±6,68
31,0 88,37±5,55 11,63±5,55
62,5 89,55±5,85 10,45±5,85
125,0 86,19±6,07 13,81±6,07
250,0 85,93±10,41 14,07±10,41
500,0 82,41±11,85 17,59±11,85
Amostras de sangue foram incubadas com um extrato de Sambucus nigra
9 - Fotomicrografia de distensão de sangue tratado com solução salina (controle).
Amostras de sangue de ratos Wistar
10 - Fotomicrografia de distensão de sangue tratado com um extrato de
Sambucus nigra (500,0%).
Amostras de sangue de ratos Wistar
foram tratadas com um extrato de
11 – Materiais e Métodos – Eletroforese de Plasmídios Bacterianos
Plasmídios bacterianos foram obtidos através da técnica de lise alcalina
(54)
. Amostras de plasmídio pBSK foram incubadas com (i) diferentes concentrações de um
extrato de Sambucus nigra, (ii) diferentes concentrações de um extrato de Sambucus nigra
e SnCl2 (200mg/ml), (iii) somente com SnCl2 (controle positivo) e (iv) água destilada (controle negativo). As incubações foram realizadas em temperatura ambiente, por 40
minutos. Alíquotas de cada amostra foram misturadas com tampão de carregamento. O
procedimento de eletroforese em gel de agarose (0,8%) foi realizado em aparato
horizontal, com tampão tris-acetato-EDTA, voltagem de 7 V/cm, durante 30 minutos. Em
seguida, o DNA plasmidial foi corado com brometo de etídio (0,5 mg/ml) e visualizado por
fluorescência. As porcentagem de plasmídeos pBSK nas formas I e II foram comparadas
entre os grupos controle e tratados através da análise de variância One Way-ANOVA,
12 - Fotografia da eletroforese com gel de agarose de plasmídeo pBSK+ tratado com um extrato de Sambucus nigra na presença e na ausência do SnCl2.
1 2 3 4 5 6 7 8
Plasmídeos incubados com água destilada foram utilizados como controle negativo e plasmídeos incubados com SnCl2 (200 mg/mL), como controle positivo. Cada amostra foi homogeneizada e submetida a eletroforese com gel de agarose a 0,8%. Linhas: (1) pSBK, controle negativo; (2) pBSK + SnCl2, controle positivo; (3) pBSK + extrato de Sambucus nigra (500,0 mg/mL); (4) pBSK + extrato de
Sambucus nigra (125,0 mg/mL); (5) pBSK + extrato de Sambucus nigra (31,0 mg/mL); (6) pBSK + extrato de Sambucus nigra (500,0 mg/mL) + SnCl2; (7) pBSK + extrato de Sambucus nigra (125,0 mg/mL) + SnCl2; (8) pBSK + extrato de
Sambucus nigra (31,0 mg/mL) + SnCl2. Os experimentos foram realizados quatro vezes.
¬Forma II
13 - Porcentagem de plasmídeo pBSK+ nas formas I e II tratados com um extrato de Sambucus nigra na presença ou ausência do SnCl2.
0 20 40 60 80 100
1 2 3 4 5 6 7 8
Plasmídeos incubados com água destilada foram utilizados como controle negativo, enquanto plasmídeos incubados com SnCl2 (200 mg/mL) foram utilizados como controle positivo. Cada amostra foi homogeneizada e submetida a eletroforese com gel de agarose a 0,8%. Os experimentos foram realizados quatro vezes. Linhas: (1) pSBK, controle negativo; (2) pBSK + SnCl2, controle positivo; (3) pBSK + extrato de Sambucus nigra (500,0 mg/mL); (4) pBSK + extrato de Sambucus nigra (125,0 mg/mL); (5) pBSK + extrato de Sambucus nigra (31,0 mg/mL); (6) pBSK + extrato de Sambucus nigra (500,0 mg/mL) + SnCl2; (7) pBSK + extrato de Sambucus nigra (125,0 mg/mL) + SnCl2; (8) pBSK + extrato de Sambucus
nigra (31,0 mg/mL) + SnCl2. (■) forma I (super enovelada), (□) forma II (aberta).
ns
*
ns
* ns * ns *
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* ns *
