UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
ESTUDO DE EFEITOS DE UM EXTRATO DE Arctium lappa (BARDANA) NA
MARCAÇÃO DOS CONTITUINTES SANGÜÍNEOS COM TECNÉCIO-99m, NA
BIODISPONIBILIDADE DO RADIOFÁRMACO PERTECNETATO DE SÓDIO E
NA MORFOLOGIA DE HEMÁCIAS DE RATOS WISTAR.
Rosane de Figueiredo Neves
Natal, RN
Rosane de Figueiredo Neves
ESTUDO DE EFEITOS DE UM EXTRATO DE Arctium lappa (BARDANA) NA
MARCAÇÃO DOS CONTITUINTES SANGÜÍNEOS COM TECNÉCIO-99m, NA
BIODISPONIBILIDADE DO RADIOFÁRMACO PERTECNETATO DE SÓDIO E
NA MORFOLOGIA DE HEMÁCIAS DE RATOS WISTAR.
Dissertação apresentada à Universidade
Federal do Rio Grande do Norte, como
requisito para a obtenção do título de
Mestre em Ciências da Saúde pelo
Programa de Pós-Graduação em
Ciências da Saúde.
Orientador: Prof. Dr. Aldo da Cunha Medeiros
Natal, RN
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
Prof.Dr. Aldo da Cunha Medeiros
ESTUDO DE EFEITOS DE UM EXTRATO DE Arctium lappa (BARDANA) NA
MARCAÇÃO DOS CONSTITUINTES SANGÜÍNEOS COM TECNÉCIO-99m,
NA BIODISPONIBILIDADE DO RADIOFÁRMACO PERTECNETATO DE
SÓDIO E NA MORFOLOGIA DE HEMÁCIAS DE RATOS WISTAR.
PRESIDENTE DA BANCA: Prof. Dr. Aldo da Cunha Medeiros
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Aldo da Cunha Medeiros (UFRN)
Prof. Drª. Maria Teresa Jansem de Almeida Catanho (UFPE)
Prof. Dr. Irami Araújo Filho (UFRN)
DEDICATÓRIA
Dedico este título ao meu pai Nivaldo Ferreira de Figueiredo e minha mãe
Maria de Lourdes Figueiredo que me agraciaram com seu amor, paciência e
determinação, para que sua filha pudesse alcançar mais uma vitória na vida.
À minha irmã Rosangela de Figueiredo Costa que foi a fonte de energia
quando precisei para poder atingir este sonho.
Ao meu marido e companheiro de todas as horas, alegres e tristes, Paulo
Roberto do Couto Neves, por todo seu amor e paciência.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a DEUS por ter me oferecido tudo que um servo precisa para viver e
trabalhar.
Ao Professor Dr. Aldo da Cunha Medeiros, pela orientação, carinho, respeito e
ajuda, apesar da distância, obrigado.
Ao Professor Dr. Mário Bernardo-Filho, que como orientador soube indicar
caminhos e sugerir soluções para que esta caminhada pudesse ter êxito, meus
respeitos e admiração.
Ao Professor Dr. José Brandão Neto pela acolhida no programa de
Pós-Graduação em Ciências da Saúde.
Ao Professor Dr. Sebastião David dos Santos-Filho pelo incentivo, carinho e
ajuda em todos os momentos desta pesquisa.
À Professora Dra. Silvana Ramos Farias Moreno pela cooperação nesta
pesquisa.
Ao Professor Dr. Adenilson de Souza da Fonseca pela cooperação nesta
pesquisa.
Aos amigos Bernardo, Camila, Mônica, Maria Regina, Jacques em todos os
momentos difíceis e nos momentos de alegria, muito obrigada.
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade
Federal do Rio Grande do Norte.
Ao serviço de Medicina Nuclear, ao Laboratório de Endocrinologia e ao
Laboratório Central do Hospital Universitário Pedro Ernesto.
A todos os amigos que me ajudaram, possibilitando a realização deste
LISTA DE ABREVIAÇÕES, SIGLAS E SÍMBOLOS
ANOVA análise de variância
Bq Bequerel (unidade de atividade de amostra radioativa no Sistema
Internacional, sendo que 1 Bq equivale a uma desintegração por
segundo)
BC Blood Cell (célula sanguínea)
CO2 dióxido de carbono Ca++ íon cálcio
Cl- íon cloreto
CAPES Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
CNEN Comissão Nacional de Energia Nuclear
CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
DNA Ácido Desoxirribonucléico
FAPERJ Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado
do Rio de Janeiro
FI-C fração insolúvel da célula
FS-C fração solúvel da célula
FI-P fração insolúvel do plasma
FS-P fração solúvel do plasma
Hb hemoglobina
H+ íon de hidrogênio HCO3- íon bicarbonato
IPEN Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares
MBq megabequerel
Mo molibdênio
NaCl cloreto de sódio
O2 oxigênio
P plasma
PET Tomografia por Emissão de Pósitrons
PGs Programa de Pós-Graduação
% ATI porcentagem de radioatividade
rpm rotações por minuto
SPECT Tomografia Computadorizada por Emissão de Fóton Único
Sn+2 íon estanoso SnCl2 cloreto estanoso 99mTc tecnécio-99m
TCA ácido tricloroacético
TcO4- íon pertecnetato Na99mTcO4 pertecnetato de sódio
UI Unidade Internaciomal
UERJ Universidade do Estado do Rio de Janeiro
UFRN Universidade Federal do Rio Grande do Norte
SUMÁRIO
Dedicatória...v
Agradecimento...vi
Lista de abreviaturas e símbolos...vii
Resumo...1
1 Introdução...2
2 Revisão da Literatura...4
3 Anexação de artigo...10
4 Comentários, críticas e sugestões...16
5 Anexo...19
5.1Carta de Aceite do Manuscrito...19
6 Apêndices...20
6.1 Efeito in vivo de um extrato de Bardana na distribuição da radioatividade entre o compartimento celular e plasmático de sangue de ratos Wistar...20
6.2 Efeito in vivo de um extrato de Bardana na fixação da radioatividade nas FI-P e solúvel FS-P do plasma de sangue de ratos Wistar...21
6.3 Efeito in vivo de um extrato de Bardana na fixação da radioatividade nas FI-CS e solúvel FS-CS da célula de sangue de ratos Wistar...22
6.4 Efeito in vivo na Biodistribuição do radiofármaco Na99mTcO4, em %ATI/g, em ratos Wistartratados com solução de NaCl 0,9% e tratados com extrato de Bardana...23
6.5 Efeito in vivo das Análises qualitativas das fotomicrografias não
mostraram alterações nas hemácias de animais tratados com extrato de
NaCl 0,9% (controle)...25
6.6 Efeito in vivo das Análises qualitativas das fotomicrografias não
mostraram alterações nas hemácias de animais tratados com extrato
de Bardana (tratado) quando comparadas aos animais tratados
com NaCl 0,9% (controle)...26
7 Referências...27
RESUMO
Radionuclídeos têm sido utilizados em Medicina Nuclear para diagnóstico e
tratamento de doenças. Estruturas moleculares e celulares marcadas com
tecnécio-99m (99mTc) são utilizados como radiobiocomplexos, como acontece com alguns constituintes sangüíneos. Algumas drogas naturais ou sintéticas
são capazes de alterar a marcação de constituintes sangüíneos com 99mTc, bem como a disponibilidade de radiobiocomplexos. Arctium lappa (Bardana)
tem sido empregada para tratar processos inflamatórios. O objetivo deste
estudo foi avaliar efeitos de um extrato de Bardana na marcação dos
constituintes sangüíneos marcados com 99mTc, na morfologia e na relação perímetro/área das hemácias e na biodistribuição do radiofármaco
pertecnetato de sódio (Na99mTcO4). O extrato de Bardana foi capaz de alterar a distribuição 99mTc no compartimento celular. As proteínas plasmáticas e celulares não apresentaram nenhuma alteração na fixação de radioatividade
(%ATI). O extrato de Bardana também foi capaz de alterar a morfologia e a
relação perímetro/área das hemácias. Na biodistribuição do pertecnetato de
sódio em animais tratados com o extrato de Bardana, foi observada uma
redução significante na captação do fígado, dente e língua, e uma alta
captação no estômago, pulmão e testículo (p<0,05). Em conclusão, o extrato
de Bardana parece possuir substâncias em sua composição que podem ser
responsáveis pelos achados experimentais. Desenvolvido em diferentes
Departamentos e Serviços da área biomédica do Hospital Universitário Pedro
Ernesto, UERJ, atestando o caráter multidisciplinar da pesquisa.
Palavras-chave: tecnécio-99m, Arctium lappa, Bardana, constituintes
1 INTRODUÇÃO
A medicina nuclear é uma especialidade médica que utiliza
radionuclídeos in vivo com finalidade diagnóstica (emissores de radiação gama
”J” ou que realizem captura eletrônica ou emissores de radiação beta positiva
“ȕ+”) e terapêutica (emissores de radiação beta negativa “ȕ-“). As atividades das amostras radioativas são expressas em unidade Becquerel (Bq) (1).
As técnicas para obtenção de imagens na medicina nuclear
incluem a Tomografia Computadorizada por Emissão de Fóton Único (SPECT)
que utiliza a radiação J emitida pelo radionuclídeo ou os raios-X emitidos no
processo de captura eletrônica. A outra técnica é denominada Tomografia por
Emissão de Pósitrons (PET) que emprega radionuclídeos que emitem radiação
ȕ+. São caracterizadas como uma modalidade de imagem tridimensional, com
alta resolução metabólica ou fisiológica (2).
Para a obtenção de imagens na medicina nuclear são administrados a um
organismo vivo estruturas moleculares e/ou celulares que apresentam em sua
constituição um radionuclídeo e que denominamos radiobiocomplexo, com a
finalidade de auxiliar no diagnóstico e/ou tratamento de doenças (3).
Os radiobiocomplexos apresentam uma biodistribuição
específica nos órgãos alvo e não alvos e/ou padrões de eliminação esperados
quando administrados. Na presença de alterações bioquímicas ou fisiológicas,
os padrões normais de biodistribuição e de eliminação podem ser alterados (3,4).
A marcação de constituintes sangüíneos (hemácias,
na medicina nuclear e esses podem também ser empregados como
radibiocomplexos. As hemácias marcadas com 99mTc são utilizadas para obtenção de imagens (SPECT) que auxiliam no diagnóstico de sangramento
gastrintestinal, na detecção de hemangiomas, na determinação de tromboses e
na avaliação da função cardíaca (2-4), Além disso, a radiomarcação de constituintes sangüíneos também tem sido utilizada como modelo experimental
para avaliação de efeitos biológicos de produtos sintéticos e naturais (5-7).
O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos de um extrato
de Arctium lappa (Bardana) na marcação dos constituintes sangüíneos com 99mTc, na biodisponibilidade do radiofármaco pertecnetato de sódio e na
morfologia de hemácias de ratos Wistar.
O trabalho foi realizado no Laboratório de Radiofarmácia
Experimental do Departamento de Biofísica e Biometria, e no Departamento de
Histologia do Instituto de Biologia Roberto Alcantara Gomes da Universidade
do Estado do Rio de Janeiro. Os procedimentos experimentais foram possíveis
através de convênio firmado entre a Universidade do Estado do Rio de Janeiro
e a Universidade Federal do Rio Grande do Norte, sob a orientação dos
Professores Aldo da Cunha Medeiros e Mário Bernardo-Filho, e na vigência
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Radionuclídeos e Medicina Nuclear
A descoberta das radiações ionizantes e dos radionuclídeos
despertou interesse nas suas aplicações na Biologia e nas Ciências Médicas,
pelo seu valor como meio para auxiliar no diagnóstico, tratamento de doenças
e nas pesquisas básicas (4). Como a origem do fenômeno radioativo é nuclear, os nuclídeos que emitem radiação são chamados de radionuclídeos (4). Alguns nuclídeos naturais, enquanto outros podem ser produzidos pelo homem
(artificiais) (3,4). Os radionuclídeos são utilizados em medicina nuclear como fontes de radiação e como traçadores (5,7). No primeiro caso, as energias das radiações emitidas pelo radionuclídeo interagem com o material biológico
podendo promover um efeito. No segundo o próprio radionuclídeo está
incorporado à estrutura celular ou molecular (radiofármaco ou
radiobiocomplexo) para ser utilizado no estudo de determinado fenômeno
biológico e/ou fisiológico (5,8).
2.2 Radiobiocomplexos
A primeira etapa na preparação de radiobiocomplexos é a
produção de um radionuclídeo apropriado (3). Os radionuclídeos usados nos procedimentos em medicina nuclear podem ser obtidos, em geral, a partir de
reatores nucleares ou cíclotrons ou de sistemas geradores de radionuclídeos,
consiste na ligação desses radionuclídeos a uma molécula ou estrutura celular
formando o radiobiocomplexo propriamente dito.
2.3 Tecnécio-99m
O 99mTc é produzido artificialmente em gerador 99Mo/99mTc, possui uma meia vida de 6 horas, emissão de raio gama com energia de 140
keV, com impacto ambiental insignificante (7,9). Essas características o tornam adequado para a aquisição de imagens de qualidade com baixas doses
administradas para o paciente e rejeitos radioativos praticamente desprezíveis.
Todas essas características em conjunto são responsáveis pela grande
utilização do 99mTc em procedimentos da medicina nuclear marcando moléculas ou estruturas celulares e também em atividades de pesquisa (4,5).
2.4 Agente Redutor
O 99mTc é eluído do gerador sob a forma de pertecnetato de sódio (Na99mTcO4) (2). O íon pertecnetato não se liga facilmente a outras espécies químicas, sendo necessária a redução do seu número de oxidação de
+7 para um estado de oxidação mais baixo (7). A redução do 99mTc pode ser obtida através de diferentes agentes químicos, sendo realizada freqüentemente
com o cloreto estanoso (SnCl2)(10,11).
2.5 As hemácias
As hemácias são células sangüíneas anucleadas com vida
média de 120 dias. Exerce funções vitais no organismo, como o transporte de
(CO2) e de íons de hidrogênio (H+). A Hb, sítio preferencial de ligação do 99mTc (3), é uma proteína que possui grupamentos heme, sítio de ligação do O
2, e compõe 95% das proteínas totais das hemácias. A membrana plasmática é
composta de uma dupla camada lipídica e várias proteínas globulares que
atravessam a membrana sendo denominadas integrais ou intrínsecas. Essas
várias proteínas formam sistemas de transporte de íons e moléculas de baixo
peso molecular (12,13). A proteína da banda-3, que parece favorecer a entrada do íon pertecnetato na hemácia (14), atua como um transportador de ânion, o qual permite ao íon bicarbonato (HCO3-) cruzar a membrana em processo de troca com íon cloreto. Os canais de cálcio (Ca++), nas hemácias, parecem
estar relacionados com a entrada dos íons estanosos, importantes no processo
de marcação dessa célula (14).
2.6 Marcação de hemácias com 99mTc
A marcação de hemácias com 99mTc é empregada na medicina nuclear no diagnóstico de sangramentos gastrintestinais, na detecção
de hemangiomas, tromboses em veias profundas e na avaliação da função
cardíaca (4,5). As hemácias marcadas com 99mTc têm grande aceitação, principalmente pelo baixo custo, substituindo a soro albumina humana (HSA)
marcada99mTc na realização de alguns exames na medicina nuclear (4,8).
A marcação de constituintes sangüíneos tem sido utilizada
em na pesquisa por se tratar de um modelo experimental simples, conveniente
e útil no estudo do fenômeno de transporte, estrutura, função da membrana e
2.7 Análise morfológica de hemácias
A análise qualitativa (forma da célula) e quantitativa (relação
perímetro/área) de hemácias tem sido usada por diferentes autores visando
avaliar possíveis alterações produzidas por drogas naturais ou sintéticas na
membrana celular (18,19).
Estudos indicam que produtos naturais também podem
alterar a forma das hemácias de ratos Wistar marcadas com 99mTc. Em um estudo in vitro com extrato de Fucus vesiculosus foi notificada a alteração
qualitativa na morfologia das hemácias associada às alterações na marcação
de constituintes sangüíneos com 99mTc (20). Moreno e colaboradores em 2004 observaram a diminuição da radioatividade nas hemácias e nas frações
insolúveis do plasma tratados in vitro com Ginkgo biloba. O estudo também
demonstrou importante alteração morfológica das hemácias tratadas com o
referido extrato, que foram confirmadas pela medida da relação perímetro/área
(17).
2.8 Biodistribuição
Radiobiocomplexos apresentam uma distribuição específica
e/ou padrões de eliminação esperados quando administrados. Na presença de
alterações bioquímicas ou fisiopatológicas, os padrões normais de
biodistribuição e de eliminação podem ser alterados. Essa alteração no
comportamento biológico dos radiobiocomplexos auxilia no diagnóstico de
biodistribuição de radiobiocomplexos devido ao uso de produtos naturais e
sintéticos(3).
Caprilles e colaboradores em 2002 (21) verificaram que o extrato de berinjela pode alterar a biodisponibilidade do pertecnetato de sódio
(Na99mTcO4) em ratos, com aumento na porcentagem de radioatividade no fígado. Nos demais órgãos não foram observados alterações (21). Moreno e colaboradores (2004) demonstraram que o extrato de Ginkgo biloba foi capaz
de diminuir a captação do Na99mTcO4 no duodeno (17). Também foi descrito que um extrato de Uncaria tomentosa diminuiu a captação do Na99mTcO4 no pâncreas e no tecido muscular (22).
O conhecimento da possibilidade de interação
medicamentosa é de grande importância para profissionais que atuam na área
de saúde e que podem utilizar os exames da medicina nuclear para auxiliar no
tratamento e diagnóstico de diversas doenças. Médicos, Dentistas e demais
profissionais da área de saúde têm como objetivo restaurar a integridade de um
órgão, sistema ou função do corpo de um paciente. É importante à acuidade da
prescrição, administração e supervisão que auxiliará no parecer de
diagnósticos através de exames de medicina nuclear utilizados na avaliação
óssea e oncológica (23,24), na detecção de sangramento gastrintestinal, hemangiomas, tromboses e avaliação da função cardíaca (2,3,4).
2.9 Plantas Medicinais
As plantas medicinais são utilizadas pelo homem em
praticamente todas as civilizações ou grupos culturais conhecidos (25). Os produtos naturais se apresentam como forma alternativa ou complementar aos
(extratos, tinturas, pomadas e cápsulas) que utiliza como matéria-prima parte
de plantas, como folhas, caules, raízes, flores e sementes, com reconhecido
efeitos farmacológicos (26). Estudos sobre os efeitos biológicos de produtos naturais são extremamente relevantes na compreensão da ação de
substâncias, sejam isoladas ou formando fitocomplexos (27).
2.9.1Arctim lappa (Bardana)
A Arctium lappa, conhecida popularmente no Brasil como
Bardana, é uma planta medicinal pertencente à família Asteraceae(28).
A Bardana é utilizada na medicina popular desde a
antigüidade em virtude de suas várias aplicações terapêuticas: ação
hepatoprotetora e antiinflamatória (28,29), inibidora da produção de óxido nítrico (30), atividade antioxidante (31), efeitos hipoglicemiante (32), gastroprotetor (33) e
efeito inibitório sobre a ligação do fator de ativação de plaquetas (34). Essas ações terapêuticas são devidas aos diferentes constituintes químicos presentes
na planta dos quais se destacam: a inulina (ajuda na manutenção da flora
intestinal), mucilagens (fibras solúveis que retardam o esvaziamento gástrico),
flavonóides (possuem propriedades antioxidantes), arctigenina (possuem
atividades citotóxicas, antitumoral, antibacteriana, antiinflamatória, antifúngica,
anticancerígenas e anti-HIV).
Dessa forma, torna-se importante realizar pesquisas que
contribuem para uma melhor compreensão da ação de produtos que possam
3 ANEXAÇÃO DE ARTIGO
Effect of an
Arctium lappa
(burdock) extract on the labeling
of blood constituents with technetium-99m and on the
morphology of the red blood cells.
Rosane de Figueiredo Neves1,2*, Silvana Ramos Farias Moreno2,3, Bernardo Machado Rebello1,2, Luiz Querino de Araújo Caldas3, Adenilson de Souza da Fonseca2, Mario Bernardo-Filho1,2,4 and Aldo da Cunha Medeiros1.
1
Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Av. Gal. Gustavo Cordeiro de Farias, s/n, 59010180, Natal, Brasil, e-mail: [email protected]
2Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Instituto de Biologia Roberto Alcântara Gomes, Departamento de Biofísica e Biometria, Av. 28 de
Setembro, 87, 20551030, Rio de Janeiro, Brasil.
3
Universidade Federal Fluminense. Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas, Rua Marquês de Paraná, 303, 24030210, Niterói, Brasil.
4
Instituto Nacional do Câncer, Coordenadoria de Pesquisa, Praça da Cruz Vermelha, 23, 20230130, Rio de Janeiro, Brasil.
ABSTRACT
Arctium lappa (burdock) has been used to treat inflammatory processes. Blood constituents labeled with technetium-99m (99mTc) have been utilized in nuclear medicine. It was evaluated the influence of a burdock extract on the labeling of blood constituents with 99mTc and on the morphometry of red blood cells. Blood samples from Wistar rats were incubated with burdock extract and the radiolabeling procedure was carried out. Plasma and blood cells, soluble and insoluble fractions of plasma and blood cells were separated. The radioactivity in each fraction was counted and the percentages of radioactivity (%ATI) were determined. Morphology and morphometric (perimeter/area ratio) measurements of red blood cells (RBC) were performed. The incubation with burdock extract significantly (p<0.05) altered the %ATI on the blood compartments and the perimeter/area ratio of RBC, as well as, induced modifications on the shape of RBC. Alterations on membrane could justify the decrease of labeling of blood cells with 99mTc obtained in this study.
Key words:Arctium lappa, technetium-99m, blood constituents, morphometry.
INTRODUCTION
The use of medicinal plants or natural products has increased in the world (Rotblat & Ziment, 2002).
Arctium lappa (burdock) has been
cultivated as a vegetable for a long time in Taiwan and Japan (Morita et al., 1993). Lieber et al.
(1994) have reported that this natural product has been used as a very popular health drink in Taiwan to treat hypertension, gout, arteriosclerosis, hepatitis and other inflammatory disorders. Moreover, Song-Chow et al. (2002) have described that the hepatoprotective mechanism associated to burdock treatment could be attributed, at least in part, to its antioxidative activity, what decreases the oxidative stress of hepatocytes, or to other unknown protective mechanism.
An investigation has demonstrated that burdock presents an inhibitory effect on the binding of platelet activating factor to rabbit
platelets and this factor is resistant to heat and proteolysis enzymes (Iwakamiet al., 1992). Linet al. (1996) reported that burdock has anti-inflammatory and free radical-scavenging activities. Arctigenin, a chemical compound present in burdock, appears to have antimutagenic effect and to inhibit thein vitro tumor growth (Lin
et al., 1996).
In nuclear medicine, red blood cells (RBC) are labeled with technetium-99m (99mTc) and used to detect clinical disorders (Saha, 2004; Bernardo-Filho et al., 2005). The labeling of blood constituents with 99mTc is also used as an experimental assay to evaluate in vitro (Morenoet al., 2004; Abreuet al., 2006) and in vivo (Fonseca
et al., 2007) interactions between drugs and
radiopharmaceuticals (radiobiocomplexes). This labeling technique involves the intracellular reaction between reduced 99mTc and hemoglobin (Owunwanne et al., 1995). When the blood is labeled with 99mTc, the radioactivity is mainly found on cellular compartment and, but it is also
fixed on plasma proteins (Bernardo-Filho et al.,
1990). Plasma proteins labeled with 99mTc are used for evaluation of lung perfusion (Hunt et al.,
2006), hepatic tumors and portal hemodynamic changes (Schneider et al., 2003).
Authors have reported that extracts of some medicinal plants are capable to alter the labeling of blood constituents with 99mTc (Oliveira
et al., 2003; Moreno et al., 2004; Abreu et al.,
2006), while other extracts are not capable to interfere in this labeling (Fernandeset al., 2005).
Morphometric analysis has been used as a tool for research in several studies, such as: (i) to verify changes in optic disc structure and thickness of retinal nerve fibre layer in chronic ocular hypertensive monkeys (Shimazawa et al., 2006), (ii) to study the relationship between infarct-related artery stenosis and capillary density (Prech
et al., 2005) and (iii) to evaluate the effects of sex hormones on normal mammary gland of rats (Pompei et al., 2005). Engström and Löfvenberg (1998) have described that after treatment with
hydroxyurea, the membrane area of RBC has an
increase of 24% and the cell volume has an increase of 39%. Berezina et al. (2004) showed that alterations on shape of RBC appear within the first hours after trauma and persist for at least 7 to 10 days. These changes are more severe in patients with secondary septic complications. Panis and Souza (2005) have studied the volume of RBC exposed to osmotic stress and have observed that the hematocrit ratio, mean corpuscular volume, optical density and the mean cellular hemoglobin yield were significantly altered.
The morphometric analysis of RBC treated with plant extracts has also been utilized to evaluate possible alterations of area, shape and volume of these cellular structures (Moreno et al.,
2004; Oliveira et al., 2005).
The aim of this work was to evaluate the effect of a burdock extract on the labeling of blood constituents with 99mTc and its action on the morphology of red blood cells.
MATERIALS AND METHODS
The burdock extract was prepared with 2g of leaf, stem and flowers of Arctium lappa
(Estrella da Terra Produtos Naturais LTDA, Brazil, lot number 002, expiration date August 2005) in 100mL of 0.9% NaCl solution at room temperature. It was triturated with a domestic
electric extractor. This mixture was filtered (Schleicher & Schulle filter paper) and the filtered solution was considered to be 20mg/mL. All the experiments were performed up to June 2005.
Absorption spectrum of burdock extract (400-700nm, intervals of 20nm) obtained by spectrophotometer (Analyser 800M, Analyser Comércio e Indústria LTDA, São Paulo, Brazil) was used as reproductively marker of this extract (Figure 1).
The protocols of the experiments were approved by the Ethical Committee of theInstituto de Biologia Roberto Alcantara Gomes, Universidade do Estado do Rio de Janeiro
(protocol number CEA/141/2006).
Samples (0.5mL) of heparinized blood from adult male Wistar rats (3-4 months, 262±12g) were incubated with 100PL of different concentrations of burdock extract (1.25, 2.5, 5.0, 10 and 20mg/mL) for 1 hour at room temperature. Blood samples also were incubated with saline solution (0.9% NaCl) as controls. Afterwards, 0.5mL of a freshly prepared stannous chloride solution (1.2Pg/mL, Sigma, USA) was added and the incubation continued for another 1 hour. After this period of time,99mTc (100PL, 3.7MBq/mL), as sodium pertechnetate, recently milked from a
99Mo/99mTc generator (Instituto de Pesquisas
Energéticas e Nucleares, Comissão Nacional de
Energia Nuclear, Brazil), was added and the
incubation continued for 10 min. The samples were centrifuged (1500 rpm, 5 min) and aliquots of plasma (P) and blood cells (BC) were separated. Samples (20µL) of P and BC were also precipitated with 1mL of trichloroacetic acid (5%) and the soluble (SF) and insoluble fractions (IF) were separated. The radioactivity in P, BC, IF-P, SF-P, IF-BC and SF-BC was determined in a well counter (Automatic Gamma Counter, C5002, and Packard, USA). After that, the percentage of radioactivity (%ATI) was calculated, as previously reported (Bernardo-Filhoet al., 1983).
A morphometric study of the samples was also performed. Blood smears were prepared in glass slides (5 slides for each sample) and the May-Grünwald-Giemsa (MGG) method was performed (Moreno, 2004). The smears were evaluated under optical microscope of clear field (Eclipse E 400TM), in the immersion objective (100x), with photographer ocular. The quantification of the data was realized by Software
image pro plus (media Cybernetics) to measure automatically the area and perimeter.
Statistical analysis (Kruskal-Wallis com pós-teste Dunns, p<0.05) was used to compare the experimental data, based on the morphometry evaluation.
RESULTS
The absorption spectrum of the burdock extract used in the experiments is showed in Figure 1. It presents the highest measure of the optical density (0.754) at 500 nm.
Figure 1: The absorption spectrum of burdock extract.
Table 1 presents the effects of burdock extract on the radioactivity distribution between cellular and plasma compartments. These data indicate that burdock extract could induce a significant alteration (p<0.05) of 99mTc between cellular and plasma compartments.
Table1: Effect of burdock extract on the radioactivity distribution on the cells and plasma compartments
labeled with 99mTc. Burdock
(mg/mL)
%ATI
P BC
0.00 (control) 3.76±1.11 96.24±1.11 1.25 15.67±0.12 84.33±0.12 2.5 16.49±0.38 83.51±0.38 5.0 15.69±1.43 84.31±1.43 10 15.39±1.47 84.61±1.47 20 22.89±1.35 77.11±1.35
Blood samples were incubated with burdock extract and radiolabeling procedure was performed. Plasma and blood cells were isolated, radioactivity was counted and the percentage of incorporated radioactivity (%ATI) was calculated. (*) p<0.05 when compared with control.
Table 2 presents the effect of burdock extract on the fixation of 99mTc on insoluble and soluble fractions plasma proteins. These data indicate that the burdock extract was not capable to
interfere on the fixation of the radioactivity on the insoluble and soluble fractions of plasma.
No alteration on fixation of radioactivity on proteins of blood cells from blood samples incubated with burdock extract (Table 3).
Table 4 presents the perimeter/area ratio of red blood cells from blood samples incubated with burdock extract.
The results showed in table 4 indicate that the perimeter/area ratio was significant (p<0.05) altered in the samples incubated with burdock extract at the highest concentrations used (10 and 20 mg/mL). 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
400 440 480 520 560 600 640 680
Wavelength (nm)
Absorbance
Table 2 - Effect of burdock extract on the fixation of radioactivity on the insoluble and soluble
fractions of plasma. Burdock
(mg/mL)
%ATI
SF-Plasma IF-Plasma 0.00 (control) 72.06±1.30 27.94±1.30
1.25 72.13±2.10 27.87±2.10 2.5 70.66±2.06 29.34±2.06 5.0 73.84±1.40 26.16±1.40 10 70.00±0.32 30.00±0.32 20 70.79±0.48 29.21±0.48
Blood samples were incubated with burdock extract and radiolabeling procedure was performed. Plasma and blood cells were separated, insoluble (IF) and soluble (SF) fractions of plasma were isolated by precipitation in trichloroacetic acid. The radioactivity was counted and the percentage of incorporated radioactivity (%ATI) was calculated.
Table 3 - Effect of burdock extract on the fixation of radioactivity on the insoluble and soluble
fractions of the blood cells. Burdock
(mg/mL)
%ATI
SF-Blood cells IF-Blood cells 0.00 (control) 87.56±1.71 12.44±1.71
1.25 89.12±0.31 10.88±0.31 2.5 85.93±1.92 14.07±1.92 5.0 83.86±2.45 16.44±2.45 10 88.79±2.20 11.21±2.20 20 86.96±1.27 13.04±1.27
Blood samples from Wistar rats were incubated with burdock extract and radiolabeling procedure was performed. Plasma and blood cells were separated, insoluble (IF) and soluble (SF) fractions of blood cells were isolated by precipitation in trichloroacetic acid. The radioactivity was counted and the percentage of incorporated radioactivity (%ATI) was calculated.
The qualitative evaluation of the shape of the red blood cells (incubated with 0.9% NaCl and incubated with burdock at 20 mg/mL) under optical microscopy is shown in the figures 1 and 2.
Table 4 - Effect of burdock extract on perimeter/area ratio of red blood cells
Blood samples were incubated with burdock extract for 60 minutes. After that, blood smears were prepared, dried and stained with a total of five fields per each slide and five slides to each extract concentration. Images were captures and the software Image pro plus, media Cibernetics, USA) was used to determinate the perimeter/area ratio. (*) p<0.05 when compared with control.
Alterations on the morphology of the red blood cells incubated with burdock extract at the higher concentration were found (Figure 2) when compared with control (Figure 1).
Figure 1: Photomicrography of blood smear from blood incubated with 0.9% NaCl (control). Blood samples
from Wistar rats were incubated with saline (0.9%
NaCl) for 60 minutes. After that, blood smears were prepared, dried and stained by May-Grünwald-Giemsa method. The slides were analyzed by optical microscopy (x1000).
DISCUSSION
The labeling of blood constituents with
99mTc has been used as an experimental model to
assess some important biological properties of natural products extracts. Extracts of different medicinal plants, as Ginkgo biloba (Moreno et al.,
2002; Moreno et al., 2004), Paullinia cupana
(Oliveira et al., 2003) and Hypericum perforatum
(Santos-Filho & Bernardo-Filho, 2005) could alter the labeling of blood constituents with 99mTc. However, extracts of pfaffia sp. (Fernandes et al., 2005) were not capable to interfere in this labeling. These findings are worthwhile to justify this model using the labeling of blood constituents with 99mTc, as an important scientific tool to study properties of physical and chemical agents.
Burdock (mg/mL) Perimeter/area (1/µm)
0.00 (control) 0.42 ± 0.011 1.25 0.44 ± 0.016 2.5 0.45 ± 0.012 5.0 0.44 ± 0.008 10(*) 0.66 ± 0.043
20(*) 0.71 ± 0.011 Figure 2: Photomicrography of blood smear from blood
incubated with burdock extract. Blood samples from
Wistar rats were incubated with burdock extract
(20mg/mL) for 60 minutes. After that, blood smears were prepared, dried and stained by May-Grünwald-Giemsa method. The slides were analyzed by optical microscopy (x1000).
Chemical compounds in burdock extract have been demonstrated to interfere with platelet function (Iwakami et al., 1992). The findings about the decrease of the radioactivity in blood cell compartment (Table 1) could be explained due to the action of the burdock extract on the membrane of the RBC.
As it is indicated in the Table 2, the burdock extract was not capable to interfere on the fixation of the radioactivity on the cellular and plasma proteins (IF-Plasma and IF-Blood cells, respectively). The binding of compounds present in burdock extract seems not interfere with the fixation of 99mTc on these proteins.
Some authors have described that some biological effects of the stannous chloride are associated with the generation of free radicals (Dantas et al., 1999). Reducing agents are necessary on the labeling process involving the 99mTc, and stannous ions is usually used (Saha, 2004). Lin et al. (1996) have reported that Arctium
lappa has free radical-scavenging activities. Probably this activity would be not too strong, due to the burdock extract was not capable to interfere on the labeling plasma and cellular proteins (Table 2 and 3).
In the clinical and laboratory investigation, the morphological analysis of RBC could aid to understand physiological disorders (Engström & Löfvenberg, 1998). Concerning to other important approach related with the morphological analysis, it has demonstrated that roast coffee beansCoffea arabica extract altered the shape of red blood cells (Oliveira et al., 2003). These results were also found with burdock extract at the highest concentrations (Table 4) with a significant (p<0.05) alteration of the perimeter/area ratio of red blood cells isolated from whole blood samples incubated the burdock extract. The qualitative analysis has also showed morphologic alterations on the shape of the red blood cells from blood samples incubated with this extract (Figure 3).
Although the exact mechanism related with the effect of the burdock extract on the labeling of RBC is not elucidated yet, the damages observed on the membrane of the RBC could alter the transport of ions (stannous and pertechnetate ions) through the cellular membrane and could justify the decrease of labeling of red blood cells with99mTc.
ACKNOWLEDGEMENTS
The present work was carried out with financial support of the Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) and Universidade do Estado do Rio de Janeiro.
RESUMO
Arctium lappa (bardana) tem sido
utilizada na medicina popular para o tratamento de processos inflamatórios. Constituintes sangüíneos marcados com tecnécio-99m (99mTc) são utilizados na medicina nuclear para obtenção de imagens. Neste trabalho foi avaliada a influência de um extrato de bardana na marcação de constituintes sangüíneos com 99mTc e na morfologia de
hemácias. Amostras de sangue de ratos Wistar
foram incubadas com extrato de bardana e o processo de radiomarcação de constituintes sangüíneos foi realizado. Plasma e células sangüíneas, frações solúvel e insolúvel do plasma e das células sangüíneas foram separadas, a radioatividade em cada fração foi contada e as porcentagens de radioatividade (%ATI) foram determinadas. A morfologia e a relação perímetro/área das hemácias foram avaliadas. A incubação de sangue com o extrato de bardana alterou significativamente (p<0.05) a %ATI a distribuição de radioatividade nos compartimentos plasmático e celular. A relação perímetro/área de hemácias, bem como a forma das hemácias também sofreram alterações Modificações na membrana poderiam justificar a diminuição da marcação das células sangüíneas com 99mTc obtidas neste estudo.
REFERENCES
Abreu, P. R.; Almeida, M. C.; Bernardo, R. M.; Bernardo, L. C.; Brito, L. C.; Garcia, E. A.; Fonseca, A. S. and Bernardo-Filho, M. (2006), Guava extract (Psidium guajava) alters the labelling of blood constituents with technetium 99m. J. Zhejiang. Univ. Sci., 7, 429-435.
Berezina, T. L.; Zaets, S. B. and Machiedo, G. W. (2004), Alterations of Red Blood Cell Shape in Patients with Severe Trauma. J. Trauma-Injury Infection Critical Care., 57, 82-87.
Bernardo-Filho, M.; Iacy, N. S. M. and Edson, M. B. (1983), 99m Technetium- Labeling red blood cells “in vitro”. Arq. Biol. Tecnol.,26, 455-461.
Bernardo-Filho, M.; Nogueira, J.; Sturm, J. and Boasquevisque, E. (1990), Plasma proteins labelling with 99m Technetium. Braz. Arch. Biol. Technol.33, 811-817.
Bernardo-Filho, M.; Santos-Filho, S. D.; Moura, E. G.; Maiworm, A. I.; Orlando, M. M. C.; Penas, M. E.; Cardoso, N.; Bernardo, L. and Brito, L. C. (2005), Drug interaction with radiopharmaceuticals: a review.
Braz. Arch. Biol. Technol.,48, 13-27.
Dantas, J. S. F.; Morais, O.; Mattos, C. P. J.; Bezerra, J. A. C. R.; Carvalho, F. E.; Bernardo-Filho, M. and Araújo, C. A. (1999), Stannous chloride mediates single strand breaks in plasmid DNA through reactive oxygen species formation. Toxicol. Lett., 110, 129-136.
Engström, K. G. and Löfvenberg, E. (1998), Treatment of myeloproliferative disorders with hydroxyurea: effects on red blood cell geometry and deformability Blood. Am. Society J. Hematol.,91, 3986-3991.
Fernandes, J. F.; Brito, L. C; Frydman, J. N. G.; Santos-Filho, S. D. and Bernardo-Santos-Filho, M. (2005), An aqueous extract of Pfaffia sp. does not alter the labeling of blood constituents with technetium-99m and the morphology of the red blood cells. Braz. J. Pharmacogn.,15, 126-132.
Fonseca, A. S.; Frydman, J. N.; Rocha, V. C. and Bernardo-Filho, M. (2007), Acetylsalicylic acid decreases the labeling of blood constituents with technetium-99M.Acta Biol Hung.2, 187-98.
Hunt, A.; Frier, M.; Johnson, R.; Berezenko, S. and Perkins, A. C. (2006), Preparation of Tc-99m-macroaggregated albumin from recombinant human albumin for lung perfusion imaging. Euro. J. Pharmaceut. Biopharmaceut.,62, 26-31.
Iwakami, S.; Wu, J. B.; Ebizuka, Y. and Sankawa, U. (1992), Platelet activating gastro factor (PAF) antagonists contained in medicinal plants: lignans and sesquiterpenes.Chem. Pharm. Bull.,40, 1196-1198. Lieber, C. S. (1994), Alcohol and the liver.
Gastroenterology,106, 1085-1105.
Lin, C. C.; Lu, J. M.; Yang, J. J.; Chuang, S. C. and Ujiie, T. (1996), Anti-inflammatory and radical scavenge effects of Arctium lappa. Am. J. Chin. Med.,24, 127-137.
Moreno, S. R .F.; Diré, G.; Freitas, R. S.; Farah, M. B.; Lima-Filho, G. L.; Rocha, E. K.; Jales, R. L. C. and Bernardo-Filho, M. (2002), Effect of Ginkgo biloba
on the labeling of blood elements with technetium-99m: in vitro study. Rev. Bras. Farmacogn., 12, 62-63.
Moreno, S. R. F.; Freitas, R S.; Rocha, E. K.; Lima-Filho, G. and Bernardo-Lima-Filho, M. (2004), Protection of plasmid DNA byGinkgo biloba from the effects of stannous chloride and the action on the labeling of blood elements with technetium-99m. Braz. J. Med. Biol. Res.,37, 267-271.
Moreno, S. R. F.; Rocha, E. K.; Pereira, M., Mandarim-Lacerda, C.; Freitas, R. S.; Nascimento, A. L. R.; Carvalho, J. J.; Lima-Filho, G. L.; Diré, G.; Lima, E. A. C. and Bernardo-Filho, M. (2004),Ginkgo biloba
extract: experimental model to evaluate its action on the labeling of blood elements with Technetium-99m and on the morphometry of red blood cells. Pak. J. Nutr.,3, 68-71.
Morita, T.; Ebihara, K. and Kiriyama, S. (1993), Dietary fiber and fat-derivatives prevent mineral oil toxicity in rats by the same mechanism.J. Nutrition. , 123, 1575-1585.
Oliveira, J. F.; Santos-Filho, S. D.; Catanho, M. T. J.; Srivastava, S. C.; Lima-Filho, G. and Bernardo-Filho, M. (2003), Effect of extract medicinal plants on the labeling of blood elements with technetium-99m and on morphology of red blood cells (RBC):
toxicological action of roast coffee beans (Coffea Arabica). Indian J. Nucl. Med.,18, 52-56.
Oliveira, J. F. F.; Brito, L. C.; Frydman, J. N. D.; Santos-Filho, S. D. and Bernardo-Filho, M. (2005), An aqueous extract of Pfaffia sp. does not alter the labeling of blood constituents with technetium-99m and the morphology of the red blood cells. Braz. J. Pharmacol.,15, 126-132.
Owunwanne, A.; Patel, M. and Sadek, S. (1995),
Preparation of radiopharmaceuticals.The hand book of radiopharmaceuticals. London: Chapman & Hall Medical.
Panis, C. and Souza, M. (2005), Methods of measuring volume changes in erythrocytes under hyposmotic stress: a comparison. Analytical and Quantitative Cytology and Histology.,27, 95-100.
Pompei, L. M.; Carvalho, F. M.; Ortiz, S. C.; Motta, M. C.; Cruz, R. J. and Melo, N. R. (2005), Morphometric evaluation of effects of two sex steroids on mammary gland of female rats.Maturitas. 5,370-379.
Prech, M.; Grajek, S.; Marszalek, A.; Lesiak, M.; Jemielity, M.; Araszkiewicz, A.; Mularek-Kubzdela, T. and Cieslinski, A. (2005), Chronic infarct-related artery occlusion is associated with a reduction in capillary density. Effects on infarct healing.Eur. J. Heart. Fai.l. 8, 373-80. Rotblatt, M. and Ziment, I. (2002), Evidence-Based
Herbal Medicine. Philadelphia. Hanley & Belfus. Saha, G. B. (2004). Fundamentals of Nuclear
Pharmacy. New York. Springer.
Shimazawa, M.; Tomita, G.; Taniguchi, T.; Sasaoka, M.; Hara, H.; Kitazawa, Y. and Araie, M. (2006),
Morphometric evaluation of changes with time in optic disc structure and thickness of retinal nerve fibre layer in chronic ocular hypertensive monkeys.
Exp. Eye Res., javascript:AL_get(this, 'jour', 'Exp Eye Res.');3, 427-440.
Song-Chow, L.; Chia-Hsien, L.; Chun-Ching, L.; Yun-Ho, L.; Chin-Fa, C.; Cheng, C. and Li-Ya, W. (2002), Hepatoprotective effects of Arctium lappa linne on liver injuries induced by chronic ethanol consumption and potentiated by carbon tetrachloride.J. Biol. Sci., 5, 401-409.
Santos-Filho, S. D. and Bernardo-Filho, M. (2005), Efeito de um extrato de Hipericum perforatium na marcação in vitro de elementos sanguíneos com tecnécio-99m e na biodisponibilidade do radiofármaco pertecnetato de sódio em ratos Wistar.
Acta Cir. Bras.,20, 121-125.
Schneider, A.; Attaran, M.; Gratz, K. F.; Bleck, J. S.; Winkler, M.; Manns, M. P. and Ott, M. (2003), Intraportal infusion of 99mtechnetium-macro-aggregrated albumin particles and hepatocytes in rabbits: assessment of shunting and portal hemodyn changes.Exp. Transplant.,75, 296-302.
4 COMENTÁRIOS, CRÍTICAS E SUGESTÕES
Minha formação profissional de Cirurgiã Dentista foi voltada
para a parte clínica direcionada por embasamentos científicos especializados.
O ingresso no Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte veio imensamente contribuir
para o meu desenvolvimento profissional na pesquisa básica e de suas
possíveis aplicações, levando-me a estudar e buscar conhecimentos além da
minha vida profissional. O curso de Mestrado foi de grande relevância ao
complementar minha formação, através da pesquisa básica, aperfeiçoando-me
para o ingresso no meio acadêmico, onde ministrando aulas posso utilizar os
conhecimentos adquiridos.
A motivação de estudar efeitos do produto natural Bardana
nos modelos experimentais que foram utilizados nessa dissertação deveu-se
ao fato de esta planta medicinal ter aplicações diversas na medicina popular.
Além disso, seus efeitos poderiam também estar relacionados a alterações de
exames da medicina nuclear. Os achados experimentais poderiam estar
indicando cautela na avaliação dos resultados falso positivo ou falso negativo.
Isso poderia garantir aos profissionais responsáveis pela interpretação
diagnóstica uma maior segurança, evitando repetições desnecessárias de
exames utilizados na medicina nuclear.
Assim, foi apresentado ao Programa de Pós-Graduação em
Ciências da Saúde o projeto de dissertação para o mestrado intitulado
“Avaliação do efeito de um extrato de Arctium lappa (Bardana) na marcação de
radiofármaco pertecnetato de sódio e na morfologia de hemácias de ratos
Wistar”.
A metodologia de simples aplicação foi importante para o
desenvolvimento deste trabalho. A escolha de ratos Wistar deveu-se ao fato de
ter sido o animal utilizado em estudos anteriores sobre biodistribuição de
radiofármacos(18,23), onde foram avaliados os efeitos do extrato de Bardana na marcação de constituintes sangüíneos com 99mTc, na morfologia de hemácias de ratos Wistare na biodisponibilidade do radiofármaco pertecnetato de sódio.
Com os resultados obtidos foi elaborado o artigo “Effect of an
Arctium lappa (burdock) extract on the labeling of blood constituents with
technetium-99m and on the morphology of the red blood cells”, aceito para
publicação no periódico “Brazilian Archives of Biology and Technology”,
indexado no Scielo e no ISI, Qualis Internacional B.
A análise dos resultados sugere que os efeitos do extrato de
Bardana observados através de diferentes metodologias, podem ser causados
pelos constituintes químicos presentes nesse extrato.
Exames de medicina nuclear podem ser alterados pela
interação de substâncias presentes nas plantas medicinais com fármacos,
podendo implicar em diagnósticos imprecisos e na repetição de exames,
expondo o paciente e a equipe profissional a doses excessivas de radiação.
Como Cirurgiã-Dentista, utilizo os exames complementares como ajuda no
diagnóstico, seguido do tratamento, ou encaminhamento desse paciente a um
centro hospitalar especializado.
Os resultados desse trabalho são reprodutíveis, e
com plantas medicinais e radiobiocomplexos. O presente trabalho mostrou-se
relevante, pois contribuiu para melhor compreensão das possíveis interações
entre compostos químicos presentes em plantas medicinais e
radiobiocomplexos. Os próximos desafios serão de usar outras técnicas que
nos possibilitarão o aprofundamento deste trabalho, através de estudos de
toxicidade e morfologia de alguns órgãos que apresentaram alterações de
captação durante o estudo de biodisponibilidade, o estudo do efeito do extrato
de Bardana em culturas bacterianas e em preparações de DNA plasmidial. Do
mesmo modo, a apresentação de novos resultados experimentais para a
comunidade científica nacional e internacional através de publicações em
revistas científicas especializadas também constitui nossa meta.
Os recursos necessários para a conclusão dessa pesquisa
foram fornecidos pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de
Janeiro (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CNPq) e Instituto de Biologia Roberto Alcantara Gomes, através
do Laboratório de Radiofarmácia experimental. No entanto cabe ressaltar que a
colaboração com diferentes Departamentos e Serviços da área biomédica do
Hospital Universitário Pedro Ernesto como o Setor de Medicina Nuclear, que
nos forneceu o material radioativo e também realizou todo o processo de
controle de qualidade, do Laboratório Central e de Endocrinologia, onde foram
contadas as amostras radioativas, atestando assim o caráter multidisciplinar da
5 ANEXO
5.1 Carta de Aceite do Manuscrito
Brazilian Archives of Biology and Technology
Declaramos para os devidos fins que o artigo:
“
Effect of an
Arctium lappa
(burdock) extract on the labeling of blood
constituents with technetium-99m and on the morphology of
the red blood cells
”,
de autoria de Rosane de Figueiredo Neves,
Silvana Ramos Farias Moreno, Bernardo Machado Rebello, Luiz
Querino de Araújo Caldas, Adenilson de Souza da Fonseca, Mario
Bernardo-Filho and Aldo da Cunha Medeiros, foi aceito e será
publicado no
Brazilian Archives of Biology and Technology.
Curitiba, 11 de setembro de 2007
6 APÊNDICES
6.1 Efeito in vivo de um extrato de Bardana na distribuição da radioatividade
entre o compartimento celular e plasmático de sangue de ratos Wistar.
Grupos %ATI
C P
Controle (NaCl 0,9%) 95,45r 1,52 4,55r 1,52
Bardana (20mg/kg) 96,31r 0,91 3,69r 0,91
Amostras de sangue dos animais tratados e do grupo controle foram incubadas
com SnCl2 e com Na99mTcO4. Após centrifugação, contagem de alíquotas de plasma e células, as ATI% nas células e no plasma foram calculadas (n=5). A
análise estatística foi realizada com teste One-way ANOVA seguido do
6.2 Efeito in vivo de um extrato de Bardana na fixação da radioatividade nas
frações insolúvel (FI-P) e solúvel (FS-P) do plasma de sangue de ratos Wistar.
Grupos ATI%
FI-P FS-P
Controle (NaCl 0,9%) 70,15r 1,56 29,85r 1,56
Bardana (20mg/kg) 72,01r 1,22 27,99r 1,22
Amostras de sangue dos animais tratados e do grupo controle foram incubadas
com SnCl2 e com Na99mTcO4. Após a precipitação em TCA 5% e centrifugação, contagem de frações insolúvel e solúvel do plasma, as ATI% nas frações
insolúvel e solúvel foram calculadas (n=5). A análise estatística foi realizada
com teste One-way ANOVA seguido do pós-teste de Tukey (p<0,05). Os
6.3 Efeito in vivo de um extrato de Bardana na fixação da radioatividade nas
frações insolúvel (FI-CS) e solúvel (FS-CS) da célula de sangue de ratos
Wistar.
Grupos ATI%
FI-C FS-C
Controle (NaCl 0,9%) 90,23r 1,97 9,77r 1,97
Bardana (20mg/Kg) 92,08r 1,81 7,92r 1,81
Amostras de sangue dos animais tratados e do grupo controle foram incubadas
com SnCl2 e com Na99mTcO4. Após precipitação em TCA 5% e centrifugação, contagem de alíquotas de fração insolúvel e solúvel das células sangüíneas, as
ATI% nas frações insolúvel e solúvel das células sangüíneas foram calculadas
(n=5). A análise estatística foi realizada com teste One-way ANOVA seguido do
6.4 Efeito in vivo na Biodistribuição do radiofármaco Na99mTcO4, em %ATI/g, em ratos Wistar tratados com solução de salina (NaCl 0,9%) e tratados com
extrato de Bardana.
Órgãos Controle (%ATI/g) Tratado (%ATI/g)
Cérebro 0,04±0,01 0,11±0,15
Fígado 1,07±0,06 0,56±0,15̅
Duodeno 0,93±0,57 0,89±0,17
Coração 0,29±0,05 0,25±0,17
Rim 0,53±0,12 0,57±0,09
Estômago 1,87±0,56 2,75±0,76̅
Pâncreas 0,37±0,01 0,66±0,71
Pulmão 0,45±0,40 1,02±0,15̅
Testículo 0,12±0,01 0,18±0,02̅
Osso 0,25±0,36 0,15±0,06
Músculo 0,11±0,01 0,11±0,15
Tireóide 5,71±0,91 5,37±0,93
Baço 0,40±0,01 0,39±0,06
Sangue 2,93±0,17 2,92±0,38
Dente 0,24±0,08 0,06±0,13̅
Língua 0,38±0,06 0,08±0,16̅
Grupos de ratos Wistar machos (329±16g) foram tratados durante sete dias
com um extrato de Bardana na concentração de 20mg/mL (intragástrica),
considerado como grupo tratado (n=5), e outro grupo (n=5) com solução de
salina (NaCl 0,9%) considerado grupo controle. No oitavo dia, os animais foram
0,07mg/mL. Em seguida foi injetado através do plexo ocular 0,3mL do
radiofármaco Na99mTcO4(3,7MBq) recentemente eluído do gerador 99Mo/99mTc. Após 10 minutos os animais foram sacrificados, os órgãos removidos (dente
incisivo superior esquerdo) pesados e suas radioatividades obtidas através de
cintilador sólido. A % de ATI/g foi calculada, comparada entre os grupos
controle e tratado. A análise estatística foi realizada (teste t não-pareado,
p<0,05). Os valores são apresentados como média ± desvio padrão.
6.5 Efeito in vivo das Análises qualitativas das fotomicrografias não mostraram
alterações nas hemácias de animais tratados com extrato de Bardana na
concentração de 20mg/mL (tratado) quando comparadas ao aos animais
tratados com salina (NaCl 0,9%) (controle).
Fotomicrografia de distensão de sangue de ratos Wistar tratado com salina por
via intragástrica durante 7 dias (controle), n=5. Após este período, uma gota do
sangue foi homogeneamente distendida na superfície de uma lâmina e seca à
temperatura ambiente. As lâminas foram coradas com o método
6.6 Efeito in vivo das Análises qualitativas das fotomicrografias não mostraram
alterações nas hemácias de animais tratados com extrato de Bardana na
concentração de 20mg/mL (tratado) quando comparadas ao aos animais
tratados com salina (NaCl 0,9%) (controle).
Fotomicrografia de distensão de sangue de ratos Wistar tratado com extrato de
Bardana por via intragástrica durante 7 dias (tratado), n=5. Após este período,
uma gota do sangue foi homogeneamente distendida na superfície de uma
lâmina e seca à temperatura ambiente. As lâminas foram coradas com o
método May-Grünwald-Giemsa, visualizadas em microscópio óptico (aumento
7 REFERÊNCIAS
1. Thrall JH, Ziessman HA. Nuclear medicine the requisites. St Louis, Missouri: Mosby Year Book. 1995.
2. Sampson CB. Complications and difficulties in radiolabelling blood cells: a review. Nuclear Medicine Communications. 17:648-658. 1996.
3. Owunwanne A, Patel M, Sadek S. Preparation of radiopharmaceuticals. The handbook of Radiopharmaceuticals. Chapman and Hall, London. 1995.
4. Early PJ & Sodee DB. Principles and practice of nuclear medicine. 2 ed. London, Mosby. 50 -112, 1995.
5. Perkins A, Frier M, Nuclear Medicine Pharmaceutical Research. London: Taylor & Francis. 178. 1999.
6. Santos-Filho SD, Bernardo-Filho M. Efeito de um extrato de Hipérico (Hypericum perforatum) na marcação in vitro de elementos sangüíneos com tecnécio-99m e na biodisponibilidade do radiofármaco pertecnetato de sódio em ratos Wistar. Acta Cir Bras. 2005; 20:76-80.
7. Saha GB. Fundamentals in Nuclear Pharmacy, New York. Springer Verlag. 2004.
8. Bernardo-Filho M, Santos-Filho SD, Moura EG, Orlando MMC, Penas ME, Cardoso VN, Bernado LC. Drug interaction with radiopharmaceuticals: a review. Braz Arch of Biol Technol. 2005; 48: 13-2.
9. Hladik III WB, Saha GB, Study KT. Essentials of Nuclear Medicine Science. London: Willians & Wilkings. 1987.
10. Harbert JC, Eckelman WC, Neumann RD. Nuclear Medicine Diagnostic Therapy. New Yok: Thieme. 1996.
11. Srivastava SC, Straub RF. Blood cell labeling with Tc-99m: progress and perpectives. Seminars in Nuclear Medicine. 1990; 1:41-51.
12. Stryer L. Bioquímica. Guanabara Koogan. Rio de Janeiro. 2003.
13. Guyton AC & Hall JE. Tratado de Fisiologia Médica. Guanabara Koogan, Rio de Janeiro. 2006.
14. Guttfilen B, Boasquevisque EM, Bernardo-Filho M. Calcio Channel Blockers: Interference on Red Blood Cells and Plasma Protein Labeling with 99mTc. Rev Esp Med Nucl. 1992; 19:195-199.
16. Callahan RJ & Rabito AC. Radiolabeling of erythrocytes with technetium-99m: role of band-3 protein in transport of pertechnetate across the cell membrane. J Nucl Med. 1990; 31:2004-2010.
17. Moreno SRF, Carvalho JJ, Nascimento ALR, Freitas RS, Diré LA, Lima-Filho GL, Rocha LK and Bernardo-Lima-Filho M. Biodistribution of Sodium Pertecnetate and Light Microscopy of Organs Isolated from the Rats: Study of the Effects of a Ginkgo biloba Extract. Pak J Nut. 2004; 3 (1):64-67.
18. Oliveira JF, Oliveira MBN, Ávila A, et al. Effect of extract of medicinal plants on the labeling of blood elements with techentium-99m and on the morphology of red blood cells: I – a studi with Paullinia cupana. Fitoterapia. 2002; 73: 305-312.
19. Fonseca AS, Frydman JNG, Rocha VC, Bernardo-Filho M. Acetylsalicylic acid decreases the labeling of blood constituents with technetium-99m. Acta Biol Hung. 2007; 58: 187-198.
20. Oliveira JF, Oliveira MBN, Ávila AS, Braga ACS, Catanho MTJA, Jales RLC, et al. Assessment of the effect of Fucus vesiculosus extract on the labeling of blood constituents with technetium-99m and the histological modifications on the shape of the red blood cells. Food Chem Toxicol. 2003; 41:15-20.
21. Caprilles PVSZ, Dias APM, Costa TEMM, Oliveira MBN, Faria MVC, Moura EG, Abreu BAL and Bernardo-Filho M. Effect of eggplant (Solanum melongena) extract on the in vitro labeling of blood elements with technetium-99m and on the biodistribution of sodium pertechnetate in rats. Cel Mol Biol. 2002; 48:771-76.
22. Moreno SRF, Silva ALC, Diré G, Honeycut H, Carvalho JJ, Nascimento AL, Pereira M, Rocha EK, Oliveira-Timóteo M, Arnóbio A, Olej B, Bernardo-Filho M, Caldas LQA. Effect of oral ingestion of on extract of the herb Uncaria tomentosa on the biodistribution of sodium pertecnetate in rats. Braz J Med Biol Res. 2007; 40:77-80.
23. Alberico RA, Husain SH, Sirotkin I. Imaging in head and neck oncology. J Clin Oncol. 2004; 13:13-35.
24. Bambini F, Meme L, Procaccini M, Rossi B, Lo Muzio L. Bone Scintigraphy and SPECT in the Evaluation of the Osseointegrative Response to Immediate Prosthetic Loading of Endosseous Implants: A Pilot Study. Int J Oral Maxillofac Implants. 2004; 19:80-86.
25. Giachetti D, Monti L. Medicinal Plant in Phytotherapy. Ann Ist Super Sanità. 2005; 41:17-22.
27. Botsaris AS, Boorhem RL, Corrêa CBV. Fititerapia Chinesa e Plantas Brasileiras. 2Th ed. São Paulo: Cone. 2002; 550.
28. Song-Chow L, Chia-Hsien L, Chun-Ching L, Yun-Ho L, Chin-Fa C, I-Cheng C, Li-Ya W. Hepatoprotective Effects os Arctium lappa Linne on Liver Injuries Induced by Chronic Ethanol Consumption and Pontentiated by Carbon Tetrachloride. J Biomed Sci. 2002; 9:401-409.
29. Lin C, Lin J, Yang J, Ujie T. Anti-inflamatory and radical scavenger effects ofArtium lappa. Am J Chin Med. 1996; 24:2,127-137.
30. Park SY, Hong SS, Han XH, Hwang JS, Lee D, Ro JS, Hwang BY, Lignans from Arctium lappa and Their Inhibition of LPS-Induced Nitric Oxide Production, Chem Pharm Bull. Japan. 2007; 55, 1:150-152.
31. Lima AR, Barbosa VC, Santos-Filho PR, Gouvêa CMCP. Avaliação in vitro da atividade do extrato hidroalcoólico de folhas de bardana. Braz J Pharm. 2006; 16:4.
32. Cavalli VLLO, Sordi C, Tonini K, Grando A, Muneron T, Guigi A, Júnior WAR. Avaliação in vitro do efeito hipoglicemiante de extratos obtidos da raiz e folha de bardana Arctium lappa. Braz J Pharm. 2007; 17:64-70.
33. Santos AC. Mecanismo de ação envolvidos nos feitos da bardana (Arctium lappa L.) sobre o trato gastrintestinal [Dissertação]. Paraná (RS): Universidade Federal do Paraná. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia. 2007.
34. Iwakami S, Wu JB, Ebizuka Y, Sankawa U. Platelet activating factor (PAF) antagonists contained in medicinal plants: lignans and sesquiterpenes. Chem Pharm Bull (Tokyo). 1992; 40,5:1196-8.
ABSTRACT
Radionuclides have been used in Nuclear Medicine for diagnostic and
treatment. In basic research, cellular and molecular structures are labeled with
technetium-99m (99mTc) and used as radiobiocomplexes. Some natural or synthetic drugs are capable to alter the labeling of blood constituents with
99mTc, as well as in the biodistribution of radiobiocomplexes. Arctium lappa
(Bardana) has been used to treat inflammatory processes. The aim of this work
was to evaluate the effects of an extract of Bardana on the labeling of blood
constituents with 99mTc, on the morphology of red blood cells, on the perimeter/area ratio of red blood cells and on the biodistribution of
radiophamaceutical sodium pertechnetate in Wistar rats. Extract of Bardana
was capable to alter the labeling of cellular compartment with 99mTc. Plasma and cellular proteins did not present alteration on the percentage of
radioactivity (%ATI). Extract of Bardana was also capable to alter the
morphology and the perimeter/area ratio of red blood cells. On the
biodistribution of sodium pertechnetate in animals treated with the extract of
Bardana, it was observed a small and significant uptake in liver, tooth and
tongue, and a high and a significant uptake in stomach, lung and testis
(p<0.05). In conclusion, these findings could be justified due to the effects of
some chemical compounds in the Bardana extract. This study was a
multidisciplinary experimental research. It was developed with the contribution
of the different Departments and Services of the Hospital Universitário Pedro
Key-words: technetium-99m, Arctium lappa, Bardana, blood constituents,
