230 Recebido em 13/09/05. Aceito em 14/02/06
Revista Brasileira de Farmacognosia Brazilian Journal of Pharmacognosy 16(2): 230-235, Abr./Jun. 2006
Artigo
ISSN 0102-695X * E-mail: maique@univali.br, Tel./Fax: + 55-47-3417600
Análise de óleos-resinas de copaíba: contribuição para o seu
controle de qualidade
Maique W. Biavatti
1*, Daniela Dossin
1, Francisco C. Deschamps
2, Maria da Paz Lima
31Universidade do Vale do Itajaí, UNIVALI, Curso de Farmácia, Caixa Postal 360, 88302-202, Itajaí, SC, Brasil,
2Estação Experimental de Itajaí, EPAGRI, Rod. Antonio Heil, km 6, Caixa Postal 277, 88301-970, Itajaí, SC, Brasil,
3Centro de Pesquisas em Produtos Naturais, Instituto Nacional de Pesquisas Amazônicas, CPPN-INPA, Caixa Postal 476, 69083-000, Manaus, AM, Brasil
RESUMO: A óleo-resina de copaíba pode ser extraída de forma sustentável do tronco de várias espécies de Copaifera. Ela contém principalmente ácidos resinosos e substâncias voláteis, tendo ampla utilização medicinal. A padronização cromatográfi ca do óleo é a garantia da identidade desta matéria-prima complexa. Neste trabalho analisaram-se por CG três amostras de óleos de copaíba obtidas de Colombo/PR e doze amostras adquiridas no Estado do Amazonas. O óleo de copaiba foi fracionado por cromatografi a em sílica gel impregnada com KOH e metilado e as frações obtidas foram avaliadas por CG. Numa segunda etapa, os óleos brutos metilados por meio de diazometano ou transesterifi cados com KOH/MeOH foram injetados diretamente em CG. Foram utilizados para comparação os ácidos diterpênicos hardwíckiico, copaiferólico e caurenóico além do sesquiterpeno 14-hidroxi- -cariofi leno (cariofi lenol). A presença do ácido copaiferólico foi observada em 100% e cariofi lenol em 80% das amostras. Os ácidos caurenóico e hardwíckiico ausentes nas amostras do Paraná, foram detectados em 8,3% e 41,7% respectivamente nas amostras do Amazonas. Os resultados obtidos indicam que podem ser analisados diretamente através de CG após metilação com diazometano, sem necessidade de fracionamento prévio. Adicionalmente, a determinação do índice de acidez para óleos de copaíba não demonstrou resultados inequívocos para as amostras analisadas.
Unitermos: Copaifera, óleo de copaíba, cromatografi a gasosa.
ABSTRACT: “Copaiba oil-resin analysis: contribution to quality control”. Copaiba oil can be extracted from the trunk of some Copaifera species and contains mainly resinous acids and volatile substances, which have wide medicinal use. The chromatographic standardization of the oil characteristics is the guarantee of the identity of raw material. In this work, three copaiba oil samples from Colombo/PR, and twelve from Amazonas State were analyzed. The copaiba oil was fractionated in silica gel impregnated with KOH, esterifi ed and the fractions were evaluated by TLC and GC. In a second stage, the crude oil was esterifi ed with diazomethane or transesterifi ed with KOH/MeOH and injected in GC. The diterpene acids used for comparison were hardwickiic, copaiferolic and caurenoic and the 14-hydroxy-β-caryophyllene (caryophyllenol). The presence of copaiferolic acid was observed in all analyzed samples and caryophyllenol in 80% of the samples. Hardwickiic and caurenoic acids were absent in the samples from Paraná State, and respectively detected in 8.3% and 41.7%, of the samples from Amazonas. The obtained results indicate that the oil can be directly analyzed through GC after methylation with diazomethane, without previous fractionation. Also, an acidity index method proposed for copaiba oil analysis did not show to be reliable for the analyzed samples.
Keywords: Copaifera, gas chromatography, copaiba oil-resin.
INTRODUÇÃO
A origem do nome copaíba relaciona-se ao tupi “cupa-yba”: a árvore de depósito, ou que tem jazida, em alusão clara ao óleo que guarda em seu interior. Popularmente conhecidas como copaibeiras ou pau-d’óleo, as espécies de copaíba são largamente distribuídas nas regiões amazônica e centro-oeste do Brasil, sendo o
A coleta do óleo pode ser realizada de forma sustentável por incisão com trado a cerca de um metro de altura do tronco. O óleo de copaíba é um líquido transparente de viscosidade variável cuja coloração também pode variar, do amarelo ao marrom. Popularmente é utilizado como antiinfl amatório (Braga et al., 1998; Cascon; Gilbert, 2000; Pinto et al., 2000), anti-séptico em feridas, eczemas, na psoríase e urticária (Cascon e Gilbert, 2000; Pinto et al., 2000), antiinfl amatório das vias urinárias, em afecções pulmonares (tosses e bronquites, gripes e resfriados) (Paiva et al., 1998), cicatrizante de pequenas irritações do couro cabeludo, antiasmático, expectorante, na pneumonia, sinusite, disenteria, incontinência urinária, cistite e leucorréia (Veiga-Júnior; Pinto, 2002), como analgésico (Pinto et al., 2000), antiúlcera (Paiva et al., 1998), e como antitumoral (Ohsaki et al., 1994). O óleo de copaíba é utilizado também pelas indústrias de cosméticos e de vernizes como agente fi xador (Veiga-Júnior; Pinto, 2002, Veiga-Júnior et al., 1997).
Até o momento, não foram encontrados estudos clínicos utilizando óleo de copaíba, porém alguns trabalhos sobre a atividade biológica em animais foram recentemente publicados, como atividade antitumoral (Lima et al., 2003), efeito protetor de colite aguda e do dano intestinal (Paiva et al., 2004a e 2004b) e antiinfl amatório (Falcão et al 2005). Alguns poucos estudos químicos apontam sesqui e diterpenos como os principais componentes do óleo-resina das espécies de Copaifera (Arrhenius et al., 1983; Monti et al., 1996 e 1999, Braga et al., 1998; Cascon; Gilbert, 2000).
A carência de estudos químicos visando à caracterização do óleo de copaíba, aliada à variabilidade
natural inerente a esta matéria-prima e à crescente demanda do mercado por medicamentos fi toterápicos, pode comprometer a autenticidade e a efetividade dos produtos contendo óleo de copaíba. Além disso, não há como garantir de maneira direta a identidade botânica da copaibeira, já que o óleo vem sendo obtido na maioria das vezes via extrativismo sustentável e, simultaneamente, de várias espécies de Copaifera. A falta de parâmetros efetivos para caracterizar e consequentemente realizar o controle de qualidade de óleo de copaíba é um dos principais entraves para o registro e exportação de produtos fi toterápicos contendo este insumo.
Alguns trabalhos analíticos recentes têm sido realizados buscando a padronização desta matéria-prima, apesar de suas variações naturais, sendo que a cromatografi a gasosa é a técnica mais empregada (Tappin et al., 2004, Cascon; Gilbert, 2000). Um método titulométrico alternativo para padronização do óleo de copaíba foi publicado recentemente (Vasconcelos; Godinho, 2002).
Neste trabalho obtiveram-se perfi s cromatográficos através de cromatografi a gasosa de várias óleos-resinas de copaíba autênticas (C. multijuga, coletadas em diferentes épocas) e comerciais provenientes do Estado do Amazonas, comparando com três lotes de óleo-resinas obtidas no Estado do Paraná. Os cromatogramas obtidos foram comparados com padrões dos diterpenos ácido hardwíckiico, ácido copaiferólico e ácido caurenóico, e com o sesquiterpeno cariofi lenol, marcadores químicos deste insumo.
Foram também investigadas diferentes maneiras de preparação das amostras para análise em CG: fracionamento com sílica gel impregnada com
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0
Mi
livo
lt
s
TEMPO DE RETENÇÃO
ÁCIDO HARDWICKIICO
C O2H O
CO2H CH2OH ÁCIDO COPAIFERÓLICO
ÁCIDO CAURENÓICO
H CO2H
H
H H OH
14-hidroxi-β-cariofileno
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Rev. Bras. Farmacogn. Braz J. Pharmacogn. 16(2):abr/jun. 2006 KOH, metilação direta com diazometano e por meio
de reação de transesterifi cação com KOH em MeOH. Comparativamente, as amostras selecionadas de óleo de copaíba foram analisadas pelo método titulométrico proposto por Vasconcelos e Godinho (2002).
MATERIAL E MÉTODOS
Obtenção das óleo-resinas de copaíba
Amostras comerciais e autênticas (coletadas da espécie C. multijuga) de óleo-resinas de copaíba (OC) foram adquiridas no Estado do Amazonas (amostras 1-12) e obtidas através da FHSP (Colombo/PR) (amostras 13-15), de diversas procedências. As informações de cada amostra poderão ser disponibilizadas pelos autores. Todas as amostras foram mantidas refrigeradas durante a execução do trabalho. Os padrões de ácido hardwíckiico, ácido copaiferólico e cariofi lenol, foram obtidos através de isolamento fi toquímico e identifi cados por métodos espectrométricos em comparação com dados da literatura.
Cromatografi a em coluna (CC)
A amostra 13 (5 g) foi cromatografada na coluna impregnada com KOH utilizando-se como eluentes 400 ml de n-hexano, diclorometano e metanol, respectivamente. Evaporaram-se os solventes e obtiveram-se as três frações: fração n-hexano (1,5 g), fração diclorometano (2,0 g) e fração metanol (1,5 g). A fração metanol foi acidifi cada com acido clorídrico 1% até pH 4,0 e posteriormente extraída com diclorometano e evaporada (1,2 g) (Pinto et al., 2000).
Preparação do diazometano para metilação das amostras brutas
O diazometano foi preparado de acordo com o método descrito por Leonard et al. (1995). Para confi rmar se o diazometano foi realmente produzido, uma alíquota do mesmo foi gotejado sobre um ácido carboxílico produzindo forte efervescência correspondente ao desprendimento de N2. As amostras de óleo bruto e a fração metanólica obtida acima foram metiladas utilizando-se 1 ml de amostra bruta diluída (ou padrão) em 1 ml de diclorometano e 2 ml de diazometano. As amostras
fi ltradas (0,45 μm) foram injetadas no cromatógrafo a gás um dia após a metilação.
Metilação através de método alternativo
Utilizou-se para fi ns comparativos o método descrito por Hartman e Lago (1973) para produzir ésteres metílicos das amostras brutas.
Cromatografi a gasosa (CG)
As análises dos óleos por cromatografi a gasosa de alta resolução (CGAR) foram realizadas em cromatógrafo Shimadzu, modelo GC-17A, equipado com detector de ionização de chama (DIC), e injetor automático AOC20I com volume de injeção de 1 μl e razão de split de 100. Hélio foi utilizado como gás de arraste a uma vazão de 1,7 ml.min-1. A programação da temperatura do forno foi de uma isoterma inicial de 5 min a 120 ºC seguida de taxa de 4 ºC.min-1 até 240ºC mantidos por 25 min. As temperaturas do injetor e do detector foram de 250ºC e 260ºC, respectivamente. Em todas as análises foi
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Biavatti, Daniela Dossin, Francisco C. Deschamps, Maria da Paz Lima
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. Bras. Farmacogn.
Braz J. Pharmacogn.
16(2):abr/jun. 2006
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Ác
Caurenoico
Ác Hardwíckiico
Ác Copaiferólico
Cariofilenol
9,597 9,582 9,593 9,684 9,634 9,537 9,611 9,578 9,585 9,565 9,579 11,034 10,998 11,028 11,017 11,000 10,994 11,005 11,014 11,002 10,996 10,973 10,987 11,829 11,832 11,818 11,809 11,804 11,795 11,806 11,886 11,824 11,785 11,798 11,771 11,789 11,944 11,930 11,953 11,937 11,934 11,937 11,911 11,927
12,492 12,495 12,485 12,458 12,512 12,450 12,487
12,757 12,771 12,757 12,719 12,724 12,787 12,752 12,752 12,727 12,762 13,031 13,022 13,023 13,009 12,958 13,024 13,048 13,077 12,982 12,998 13,257 13,242 13,236 13,227 13,230 13,319 13,191
13,370 13,380 13,353 13,339 13,343 13,348 13,339 13,306 13,330 13,568 13,559 13,556 13,558 13,535 13,551 13,500 13,473 13,577 13,519 13,544 13,511 13,535 14,101 14,116 14,095 14,084 14,074 14,070 14,087 14,092 14,069 14,074 14,042 14,067 14,362 14,383 14,357 14,345 14,334 14,331 14,350 14,355 14,348 14,334 14,304 14,328
14,560 14,550 14,535 14,492 14,485 14,560
14,930 14,929 14,918 14,909 14,896 14,906 14,859 14,899 14,864 14,887 15,078 15,057 15,063 15,037 15,077 15,057 15,053 15,017
15,518 15,500 15,493 15,413
15,753 15,797 15,725 15,661 15,688 15,708
Região 1 – hidrocarbonetos sesquiterpenicos e sesquiterpenos oxigenados
17,599 17,585 17,591 17,515 17,589 17,549 17,573 22,125 22,088 22,083
23,857 23,864 23,748
24,314 24,359 24,309 24,316
24,743 24,753 24,799 24,745 24,769 24,615
25,223 25,264 25,215 25,271 25,210
25,403 25,528 25,368 25,492 25,547 25,489 25,494 25,540 25,406 25,491 25,449 25,478 25,471
26,689 25,773 25,781 25,793 25,727 25,777 25,733 25,764 25,830 25,813 25,803 25,834 25,849 25,804 25,926
26,380 26,326 26,317 26,307 26,204 26,672 26,669 26,685 26,726 26,676 26,662 26,551
26,965 26,961 26,908
27,397 27,378 27,350 27,361 27,408 27,355 27,318 27,363 27,320 27,351 27,848 27,800 27,797 27,788 27,685
Região 2 – hidrocarbonetos diterpenicos e diterpenos oxigenados
28,053 28,043 28,040 28,028 28,032 28,080 28,005 28,024 27,907 28,033 27,990 28,024
29,790 29,818 29,779
30,113 30,155 30,090 30,151 29,990 30,072 35,954 35,886 36,026
36,210 36,186 36,172 36,209 36,159 36,146 36,215
40,741 40,730 40,708 40,695 40,692 40,682 40,687 40,736 40,677 40,678 40,729 40,596 40,681 40,617 40,666 40,701
41,452 41,353
58,100 58,105 58,190 58,219 58,091 58,125
Região 3 – diterpenos ácidos
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Rev. Bras. Farmacogn. Braz J. Pharmacogn. 16(2):abr/jun. 2006 utilizada coluna capilar de sílica SP2340 [100%
poli(bis-cianopropil-siloxano) - 60 m x 0.25 mm id x 0.2 μm]. Todas as amostras foram fi ltradas através de membrana tipo Millex (0,45 μm) antes da injeção.
Os picos referentes aos padrões foram identificados através de co-injeção e comparação dos tempos de retenção obtidos através do injetor automático.
Índice de acidez
Utilizou-se para fi ns comparativos o método descrito por Vasconcelos e Godinho (2002).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
O fracionamento inicial por cromatografi a fl ash em sílica impregnada com KOH visou facilitar a análise e a caracterização do óleo por cromatografi a gasosa devido a sua complexidade, no entanto nos cromatogramas obtidos por CG para as frações hexano e diclorometano mostraram-se tão complexas quanto para os óleos brutos, sendo desnecessária portanto a separação previa do óleo bruto em coluna cromatográfi ca. A fração mais polar (metanolica metilada) forneceu as melhores condições para análise por apresentar menor sobreposição dos picos, sendo também a que possui componentes mais característicos de óleo de copaíba. O perfi l cromatográfi co por CG de uma amostra bruta de óleo de copaíba apresentou três regiões de eluição bem defi nidas, sendo a primeira mais congestionada e as duas últimas mais facilmente analisáveis, porém todas contendo abundantes picos. Seriam, pela ordem hidrocarbonetos sesquiterpênicos, sesquiterpenos oxigenados, hidrocarbonetos diterpênicos e diterpenos oxigenados (Pinto et al., 2000).
Pela analise das frações metanólicas dos óleos comerciais obtidos de Colombo (PR), observou-se a presença de poucos diterpenos, ao contrário do que se esperava conforme citado na literatura (Pinto et al., 2000). A análise direta por CG dos óleos brutos metilados apresentaram também um perfil carente de ácidos diterpênicos (Figura 1). Apenas duas amostras (amostras 8 e 9, que foram coletadas em épocas diferentes das demais) provenientes do Amazonas apresentaram o perfi l próximo ao desejado por cromatografi a gasosa, segundo
a literatura (Figura 2). Esta observação confi rma que a sazonalidade é um fator importante para a padronização da óleo-resina de copaíba. Sugere-se, portanto, que os fornecedores padronizem não apenas as características organolépticas do óleo coletado para formar seus lotes (por exemplo, a cor), mas também a época do ano em que o óleo foi coletado. Tradicionalmente, coletores relatam que a época reconhecida como ideal para a coleta da óleo-resina de copaíba é na lua cheia do mês de setembro (informação não publicada).
Comparando-se os diversos tempos de retenção obtidos por CG para todas as amostras analisadas, detectou-se a presença de ácido copaiferólico em todas as amostras, podendo este ser utilizado como um marcador quimiotaxonômico de óleos de copaíba por este ser característico e restrito ao gênero Copaifera. O cariofi lenol foi observado nas amostras do Paraná e em cerca de 50% das amostras analisadas, porém os ácidos caurenóico e hardwíckiico não foram detectados, de acordo com os padrões utilizados (Tabela 1).
A tabela 1 mostra os principais picos obtidos para as amostras, em relação aos padrões analisados. A grande complexidade de insumos de origem natural, conduziu a OMS a considerar e aceitar técnicas cromatográfi cas
fi ngerprint como uma maneira mais robusta de analisar a qualidade de produtos naturais, focalizando a comparação qualitativa e sistemática dos picos obtidos nas diferentes amostras. Desta maneira, a amostra é considerada como “substância ativa”, facilitando a repetibilidade e a credibilidade de pesquisas clínicas e farmacológicas de insumos naturais (WHO, 1991). Neste sentido, três das amostras analisadas apresentaram menos de vinte substâncias detectadas, oito delas apresentaram entre 20-26 picos, e quatro apresentaram mais de quarenta picos. Com isso observa-se a grande problemática envolvida na padronização do perfi l ideal para o óleo de copaíba como insumo para a indústria farmacêutica.
Apesar da metodologia de transesterifi cação com KOH/MeOH ser rápida e de baixo custo, nota-se que esta não é efi ciente para os ácidos diterpênicos do óleo de copaíba como a metilação com diazometano. Esta conclusão deve-se a observação de que alguns compostos detectados por este segundo método não foram evidenciados no primeiro, como o ácido hardwickico e o cariofi lenol. Pode-se sugerir com isso que a metilação por
Amostra IA (mg KOH/g)
Amostra 13 19,9
Amostra 14 20,5
Amostra 15 21,5
Amostra 8, Carauari/AM 45,8
Amostra 9, Carauari/AM 44,3
Amostra 10, Carauari/AM 9,5
Amostra 11, Apuí/AM (C. multijuga) 24,9
meio de diazometano é mais efi ciente do ponto de vista reacional, ou então a etapa extrativa na transesterifi cação com KOH/MeOH leva a perda de substâncias.
O método analítico clássico (índice de acidez) sugerido para óleo-resina de copaíba por Vasconcelos e Godinho (2002) foi aplicado em algumas amostras selecionadas, por necessitar um maior volume para as análises. Este é um método titulométrico tradicional e de baixo custo para investigação de adulterações grosseiras do óleo de copaíba. Foram selecionadas as amostras procedentes do Paraná e procedentes de Carauari (AM) (com grau de complexidade maior, segundo análise por CG), porém, não se obteve os índices de acidez esperados segundo a proposição do autor (maior que 80 mg KOH/g) para nenhuma das amostras testadas, inclusive a autêntica (Tabela 2). Apesar de ser um método acessível do ponto de vista econômico, não conduz a resultados inequívocos, contradizendo a conclusão dos autores, que o julgaram eficiente. Devido aos resultados encontrados neste trabalho, acredita-se que este método deve ser avaliado contemplando um numero maior de amostras, antes de ser sugerido como método para controle de qualidade de óleos de copaíba.
Este trabalho utilizou pela primeira vez como marcadores de amostras de óleo de copaíba o ácido copaiferólico e o cariofi lenol, sendo o primeiro encontrado em todas as amostras analisadas por cromatografi a gasosa, e testou comparativamente método para determinação titulométrica do índice de acidez para detecção de substâncias adulterantes, o qual não se mostrou efi caz.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem o apoio da Fundação Herbarium de Saúde e Pesquisa (FHSP), INPA (AM), EPAGRI (SC), CNPq – EDITAL FITOTERÁPICOS, e os pesquisadores Prof. Dr. Franco Delle Monache, Centro Nazionale di Ricerca (CNR), Roma, Itáliae Prof. Dr. Valdir Cechinel Filho, UNIVALI que gentilmente cederam padrões para as análises.
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