Peptídeos intracelulares como novos moduladores da transdução de sinal de receptores acoplados à proteína G

(1)

FERNANDA MARQUES DA CUNHA

PEPTÍ DEOS I NTRACELULARES COMO NOVOS

MODULADORES DA TRANSDUÇÃO DE SI NAL DE

RECEPTORES ACOPLADOS À PROTEÍ NA G

Tese apresentada à Universidade

Federal de São Paulo – Escola Paulista

de Medicina para obtenção do título de

Doutor em Ciências

São Paulo

(2)

Cunha, Fernanda Marques

Peptídeos intracelulares como novos moduladores da transdução de sinal de receptores acoplados à proteína G. / Fernanda Marques da Cunha.-- São Paulo, 2008.

(3)

Tese elaborada no Departamento de Biologia

Celular e Desenvolvimento durante o curso de pós-graduação em Biologia Molecular e

apresentada à Universidade Federal de São

Paulo – Escola Paulista de Medicina como requisito parcial para obtenção do título de

Doutor em Ciências.

(4)

(5)

“O correr da vida embrulha tudo, a vida é

assim: esquenta e esfria, aperta e daí

afrouxa, sossega e depois desinquieta. O que ela quer da gente é coragem.”

(6)

(7)

AGRADECI MENTOS

Aos meus queridos avós, José e Maria Marques cujo carinho e incentivo são tão

fortes que irradiam até mim.

Ao meu orientador Emer pela oportunidade de desenvolver um trabalho muito interessante e extremamente desafiador com as melhores ferramentas.

Aos meus colegas e amigos Denise, Lilian, Leandro e Sayami, não só pelas

discussões científicas e não científicas e ajuda de todos os tipos, mas também pela

cumplicidade e por terem dividido comigo risos e lágrimas, alegrias e angústias. Sempre sorrirei ao lembrar de vocês.

À Grazi e Maurício, minha família em São Paulo.

Ao Alex, meu melhor companheiro de todas as horas, pelo carinho, cuidado e

paciência.

Às novas colegas Carla e Camila pelo agradável convívio.

Ao Zeca e ao Fio, pelos momentos de descontração.

Às Profs. Regina P. Markus e Zulma F. Ferreira pelo carinho com que me

receberam em seu laboratório e pela orientação nos ensaios de microfisiometria.

À Andréa S. Heimann pelo auxílio nos ensaios com as colunas de afinidade.

Ao Clécio pelos ensaios de espectrometria de massa.

A todos aqueles que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste

(8)

Í NDI CE

LI STA DE FI GURAS... xi

LI STA DE TABELAS... xiii

LI STA DE ABREVI ATURAS... xiv

ABREVI ATURA DOS AMI NOÁCI DOS... xvi

RESUMO... xvii

1 I NTRODUÇÃO... 01

1.1 Módulos de interação... 01

1.2 Efeito de peptídeos intracelulares desenhados... 07

1.3 Geração de peptídeos pela célula... 08

1.4 Geração de peptídeos intracelulares... 08

1.5 Endo-oligopeptidase EC3.4.24.15... 11

1.6 Peptídeos intracelulares e sinalização... 17

2 OBJETI VO... 19

3 MATERI AI S E MÉTODOS... 20

3.1 I solamento de peptídeos de cérebro de rato... 20

(9)

3.6 Síntese dos peptídeos escolhidos acoplados ao TAT por pontes

dissulfeto... 24

3.7 Cultura de células... 24

3.8 Monitoramento da entrada do peptídeo na célula e do desligamento do TAT... 24

3.9 Ensaio microfisiométrico... 26

3.10 Ensaio de gene repórter: Ensaio da luciferase... 27

3.10.1 Construção do plasmídeo reporter... 28

3.10.1.1 I nserção do CRE/ VI P no pGL3 básico... 28

3.10.1.2 Clonagem dos MREs no pGL3 + CRE... 29

3.10.2 Transfecção celular e ensaio da luciferase... 31

3.11 Fosforilação dos peptídeos pela PKC... 32

3.12 Aumento da expressão da EP24.15 em células CHO-S e HEK293 e ensaio da luciferase... 32

3.13 Acoplamento dos peptídeos a colunas de purificação por afinidade e captura de ligantes... 33

3.14 Análise estatística... 35

4 RESULTADOS... 36

4.1 I dentificação de novos peptídeos de cérebro de rato... 36

4.2 Ensaios cinéticos com a EP24.15 recombinante ativa e determinação dos sítios de hidrólise... 38

(10)

citoplasmáticos de cérebro de ratos, células CHO-S e HEK293... 42

4.4 Monitoramento da entrada do peptídeo na célula e do desligamento do TAT... 42

4.5 Ensaio microfisiométrico... 45

4.6 Ensaio de gene repórter: Ensaio da luciferase... 47

4.6.1 Construção do plasmídeo reporter... 47

4.6.2 Ensaio da luciferase... 48

4.7 Fosforilação dos peptídeos pela PKC... 52

4.8 Aumento da expressão da EP24.15 em células CHO-S e HEK293 e ensaio da luciferase... 54

4.9 Acoplamento dos peptídeos a colunas de purificação por afinidade e captura de ligantes... 55

5 DI SCUSSÃO... 58

6 CONCLUSÕES... 69

7 REFERÊNCI AS BI BLI OGRÁFI CAS... 70

ANEXO I – Proteínas identificadas no eluato das colunas de afinidade

ANEXO I I - Artigos publicados durante o período de doutoramento

(11)

LI STA DE FI GURAS

FI GURA 1 Domínios de interação e organização protéica... 02

FIGURA 2 Natureza modular das proteínas envolvidas na sinalização... 03

FI GURA 3 Famílias de domínios de interação e seus ligantes... 05

FI GURA 4 Mecanismo de troca tiol-dissulfeto proposta para a multimerização da EP24.15 através da S-glutationilação... 13

FIGURA 5 Distribuição dos sítios encontrados em 39 peptídeos isolados com a EP24.15 inativa... 17

FI GURA 6 Esquema temporal do ensaio de microfisiometria... 27

FI GURA 7 Vetor reporter pGL3-MRE-CRE... 28

FI GURA 8 Vetores usados no ensaio da luciferase... 31

FI GURA 9 Esquema temporal do ensaio da luciferase... 32

FI GURA 10 Cinética enzimática da EP24.15 na presença dos peptídeos estudados... 39

FI GURA 11 Cromatogramas das análises por HPLC do produto de incubação dos peptídeos com a EP24.15... 40

FI GURA 12 Padrão de clivagem dos peptídeos 5A e FE2 pela EP24.15... 41

FI GURA 13 Cromatogramas das corridas de HPLC... 44

FI GURA 14 Ensaios microfisiométricos... 46

(12)

FI GURA 17 Ensaio da luciferase... 52

FIGURA 18 Fosforilação in vitro dos peptídeos pela PKC... 53 FIGURA 19 Efeito do aumento da expressão da EP24.15 sobre expressão de

(13)

LI STA DE TABELAS

TABELA 1 Peptídeos extraídos de cérebro de ratos com a metodologia de

captura pela EP24.15 inativa e identificados por espectrometria de massa... 36

TABELA 2 Peptídeos escolhidos para síntese e análise... 37

TABELA 3 Constantes de inibição da EP24.15 calculadas para os

peptídeos estudados... 38 TABELA 4 Concentração intracelular de peptídeos nas células CHO-S... 43

TABELA 5 Proteínas identificadas nos eluatos das colunas e que possuem

(14)

ABREVI ATURAS

AMPc monofosfato cíclico de adenosina

ANG I I angiotensina I I

AT1 receptor AT1 para a angiotensina

ATP trifosfato de adenosina

CHO-S células de ovário de hamster chinês

DNA ácido desoxirribonucléico

EP24.15 endo-oligopeptidase E.C. 3.4.24.15

GDP difosfato de guanosina

GTP trifosfato de guanosina

GPCR receptor acoplado à proteína G

HEK293 células de rim embrionário humano

HI V vírus da imunodeficiência humana

HPLC cromatografia líquida de alta performance

HSP65 heat shock protein 65

JNK c-Jun N-terminal kinase

(15)

PTB ligação a fosfotirosina

QFS quenched fluorescent substrate

RNA ácido ribonucléico

SH2 região de homologia à Src 2

SH3 região de homologia à Src 3

CKI caseína quinase I

CKI I caseína quinase I I

(16)

ABREVI ATURA DOS AMI NOÁCI DOS

Alanina Ala A

Asparagina Asn N

Ácido aspártico Asp D

Arginina Arg R

Cisteína Cys C

Fenilalanina Phe F

Glicina Gly G

Glutamina Gln Q

Ácido glutâmico Glu E

Histidina His H

I soleucina I le I

Leucina Leu L

Lisina Lys K

Metionina Met M

Prolina Pro P

Serina Ser S

Tirosina Tyr Y

Treonina Thr T

Triptofano Trp W

(17)

RESUMO

A degradação de proteínas pelo sistema ubiquitina-proteassoma gera uma

grande quantidade de oligopeptídeos dentro das células. Para investigar possíveis

efeitos desses oligopeptídeos, alguns deles foram isolados do cérebro de rato,

sintetizados acoplados à seqüência peptídica TAT através de pontes dissulfeto,

sendo então analisados nas vias de transdução de sinal de receptores acoplados à

proteína G. A mistura contendo os quatro peptídeos analisados (20-80 µM) inibiu de forma significativa o aumento da taxa de acidificação do meio extracelular

induzido pela angiotensina I I em células CHO-S que expressam o receptor AT1

(CHO-S-AT1). Adicionalmente, tanto sozinhos quanto em mistura, estes peptídeos

aumentaram a transcrição do gene repórter da luciferase induzida pela

angiotensina I I em células CHO-S-AT1, assim como aquela induzida pelo

isoproterenol em células HEK293. Os peptídeos sem TAT, incapazes de atravessar

a membrana das células, não alteraram as respostas à estimulação dos receptores,

sugerindo um efeito intracelular dos peptídeos nas cascatas de transdução de

sinal. Além disso, todos os peptídeos estudados inibiram competitivamente a

degradação de um substrato sintético da oligopeptidase EP24.15 in vitro. O aumento da expressão da EP24.15 em células CHO-S e HEK293 foi suficiente para

reduzir a atividade do gene repórter luciferase induzida pela angiotensina I I ou

pelo isoproterenol. Finalmente, a utilização dos peptídeos como “isca” em colunas

de afinidade revelou que diversas proteínas envolvidas na sinalização de

(18)

adaptina A-alfa e a dinamina-1. Estes resultados sugerem que antes de serem

completamente degradados, os peptídeos intracelulares semelhantes àqueles

gerados pelo proteassoma podem afetar ativamente a sinalização intracelular,

(19)

Introdução

1 I NTRODUÇÃO

Com a elucidação do genoma de diversos organismos, constatou-se que,

contrariamente ao que se acreditava na era pré-genômica, a complexidade dos

organismos não era diretamente relacionada ao número de genes, mas sim

definida pela interação dos produtos destes genes no tempo e no espaço (GAVI N

et al., 2002; STUMPF et al., 2008). De fato, o grande desafio da biologia pós-genômica tem sido entender como a informação genética resulta na ação

orquestrada dos produtos gênicos nos âmbitos temporal e espacial. I sto é refletido

pelo fato do número de doenças humanas exceder o número de genes do genoma

(ROSES et al., 2000). Além disso, o número total de genes em humanos não difere substancialmente do número de genes do verme nematóide Caenorhabtidis elegans, reforçando a idéia de que a complexidade reside na combinação contextual dos produtos gênicos (GAVI N et al., 2002).

1.1 Módulos de interação

As proteínas raramente agem sozinhas. Na maior parte das vezes, elas

interagem com outras proteínas, DNA, RNA ou ainda moléculas de outra natureza

para orquestrar uma tarefa celular determinada. Estes complexos proteicos

representam mais do que a soma das partes, adquirindo uma nova função (GAVI N

(20)

Introdução

Figura 1. Domínios de interação e organização protéica. Um vasto repertório de domínios de interação que contribuem para as propriedades bioquímicas e biofísicas das proteínas foi caracterizado. Os domínios são usados de forma combinatória para formar proteínas com diferentes funções bioquímicas. De forma semelhante, as proteínas são usadas para a formação de complexos

com diversos efeitos biológicos. Adapatado de Gavin et al. (2003).

As proteínas regulatórias são construídas de forma modular (Fig. 2), onde

cada módulo corresponde a um domínio de interação ou dotado de atividade

enzimática, possibilitando a previsão das funções biológicas de uma dada proteína

com base nos domínios que a compõem (COPLEY et al., 2002). Os domínios de interação possuem seqüências de aminoácido conservadas (COPLEY et al., 2002) e encontram-se presentes em centenas de cópias no proteoma humano. De fato, os

Domínios, ~ 20 Å

Proteínas, ~ 50 - 100 Å

Complexos proteicos, ~ 500 - 1000 Å Domínios, ~ 20 Å

Proteínas, ~ 50 - 100 Å

(21)

Introdução

Figura 2. Natureza modular das proteínas envolvidas na sinalização. Membros de várias famílias de proteínas e a organização dos domínios que as compõem. CH- homologia à calponina, C1- região conservada 1 da PKC (ligação ao PMA), C2- região conservada 2 da PKC (ligação aos fosfolipídeos),

DNA BD- domínio de ligação ao DNA, EF – mãos EF, FCH- domínio de homologia Fes/ CI P4, 4H- four

helix bundle, GAP- domínio ativador de GTPase, GEF- fator de troca GDP-GTP, PH- domínio de homologia à plecstrina, PLC- fosfolipase C, PTB- domínio de ligação à fosfotirosina, PTPc/ DSPc- tirosina fosfatase, SAM- sítio estéril alfa, SH2- domínio de homologia à Src 2, SH3- domínio de homologia à Src 3, SOCS supressor da sinalição de citocina, STAT- transdutor de sinal e ativador da transcrição, TA- domínio de ativação da transcrição, Uba- domínio associado à ubiquitina. Adaptado

de Pawson et al. (2001).

Os domínios possuem funções variadas, incluindo o endereçamento de

proteínas a um local subcelular específico, o reconhecimento de modificações

pós-Adaptador

Scaffold

Quinases

Fosfatase

Sinalização da Ras

Transcrição

Ubiquitinação

Regulação do citoesqueleto

Regulação da sinalização

Sinalização por fosfolipídeos

Adaptador

Scaffold

Quinases

Fosfatase

Sinalização da Ras

Transcrição

Ubiquitinação

Regulação do citoesqueleto

Regulação da sinalização

(22)

Introdução

traducionais em outras moléculas, a formação de complexos multiprotéicos de

sinalização, além do controle da conformação, atividade e especificidade de

substrato das enzimas (PAWSON & NASH, 2000). Para isso, eles reconhecem sítios

expostos em outras proteínas, incluindo sítios fosforilados, ricos em prolina e

regiões C-terminais, ou ainda se ligam às cabeças polares de fosfoinositídeos de

membrana (PAWSON & NASH, 2003 – Fig. 3), com constantes de dissociação que

variam de nano a micromolar. Embora alguns domínios sejam bastante específicos

a ponto de sua afinidade por um sítio peptídico ser suficiente para a interação

específica nas células, outros são muito versáteis em suas propriedades de ligação.

Um domínio determinado pode interagir com diversos ligantes distintos de forma

simultânea e seqüencial, nas etapas sucessivas da transdução de sinal. Além disso,

domínios de um mesmo grupo podem ter ligantes bastante diferentes. Nestes

casos, a especificidade da sinalização é garantida por fatores outros que somente

a afinidade por seus ligantes, incluindo interações terciárias, localização subcelular

e a organização estrutural das proteínas envolvidas, competição entre domínios e

interações multidomínios (PAWSON &NASH, 2003).

Durante a transdução de sinal, enzimas, como por exemplo, as quinases,

(23)

Introdução

Figura 3. Famílias de domínios de interação e seus ligantes. Os domínios de interação ligam proteínas, fosfolipídeos ou ácidos nucléicos. Um grupo destes domínios encontra-se ilustrado, com seus ligantes indicados por flechas (PAWSON & NASH, 2003).

Uma análise recente sugeriu que aproximadamente 10.000 tipos de

interações protéicas estruturalmente diferentes podem ser antecipadas com base

nos módulos que constituem cada uma das proteínas (ALOY et al., 2004). A vasta maioria destas interações pertence a um dos seguintes grupos: i) a interação entre

domínios, que envolve uma extensa superfície de interação física ou ii) interação

com sítios peptídicos curtos (Fig. 3). Muitas das interações onde um domínio se

liga a uma seqüência peptídica curta (sítio) são relativamente fracas (acontecem Peptídeo modificado

Peptídeo

Domínio/ domínio

Fosfolipídeo

Ácido nucleico Peptídeo modificado

Peptídeo

Domínio/ domínio

Fosfolipídeo

Ácido nucleico Peptídeo modificado

Peptídeo

Domínio/ domínio

Fosfolipídeo

(24)

Introdução

na faixa de concentração micromolar) e freqüentemente dependem de

modificações pós-traducionais do ligante peptídico. Estas modificações incluindo

fosforilação, hidroxilação, acetilação, metilação e ubiquitinação muitas vezes

completam os sítios de ligação para os domínios de interação funcionando como

pontos de controle para as interações protéicas (SEET et al., 2006). Em alguns casos, a interação domínio-sítio requer uma alteração conformacional do domínio

de interação para que sua superfície de ligação seja exposta. Desta forma, a

interação domínio-sítio tende a ser transitória, característica que a torna bastante

apropriada à regulação das vias de sinalização (PAWSON & LI NDI NG, 2005).

Exatamente por serem transitórias e condicionais, as interações entre domínio e

peptídeo são difíceis de serem estudadas. De fato, elas são sub-representadas em

ensaios de larga escala de purificação por afinidade e podem ser perdidas em

ensaios de duplo híbrido se necessitam, por exemplo, da fosforilação de uma

tirosina, evento que não acontece em leveduras (PAWSON & LI NDI NG, 2005).

Além disso, a identificação sistemática de sítios de interação funcionalmente

relevantes é complicada pelo fato de serem seqüências peptídicas bastante curtas

(4 a 8 resíduos de aminoácidos) que freqüentemente encontram-se em regiões

(25)

Introdução

1.2 Efeito de peptídeos intracelulares desenhados

Estudos demonstram que seqüências peptídicas curtas racionalmente

criadas são capazes de alterar a interação proteína-proteína normal, com efeitos

significativos em modelos animais. Peptídeos como o Ht31, derivado da proteína

associada à quinase de tireóide humana dependente de AMPc (AKAP) têm sido

usados para alterar a localização da PKA na célula (ROSENMUND et al., 1994). Da mesma forma, foi demonstrado que a quinase c-Jun NH2-terminal (JNK), membro do grupo das quinases ativadas por mitógenos (MAPKs), é inibida por um peptídeo

derivado da JNK interacting protein (JI P) que impede o acesso da quinase ao seu substrato, o c-Jun. Quando uma versão permeável à célula deste peptídeo foi

injetada em camundongos, observou-se uma melhora significativa da resistência à

insulina e por conseguinte da tolerância à glicose em um modelo de diabetes do

tipo 2 (KANETO et al., 2004). Além disso, Kheifets et al. (2006) mostraram que um peptídeo de 8 resíduos de aminoácidos derivado da anexina V era capaz de inibir a

translocação da δPKC após ativação e conseqüentemente sua ação, como confirmado por seu efeito protetor em um modelo animal de infarto cardíaco.

Diante destes e de outros dados, fica claro que peptídeos que mimetizam os sítios

de interação entre proteínas são capazes de interferir acentuadamente na

(26)

Introdução

1.3 Geração de peptídeos pela célula

Peptídeos são produzidos pelas células a partir de proteínas sintetizadas

especificamente para esta finalidade (pró-proteínas), ou como sub-produtos do

metabolismo protéico. No primeiro caso, os produtos formados são conhecidos

agentes moduladores da comunicação celular (neuropeptídeos) que agem através

da ligação a receptores localizados na membrana plasmática. No segundo caso,

peptídeos intermediários são gerados em compartimentos outros que não aqueles

especializados em degradação protéica pela digestão limitada de proteínas.

Enquanto que os neuropeptídeos já foram extensivamente estudados e

caracterizados, pouco se sabe a respeito dos intermediários peptídicos gerados

durante o metabolismo protéico.

1.4 Geração de peptídeos intracelulares

A proteólise é um processo indispensável à homeostase celular e

desenvolveu-se em seres eucarióticos muito antes do sistema imunológico. Quase

todas as proteínas nas células de mamíferos são continuamente degradadas e

substituídas por re-síntese. A taxa de degradação dos constituintes celulares varia

(27)

Introdução

célula. Além disso, muitos processos celulares como a progressão do ciclo celular,

a transcrição gênica e as vias metabólicas são controlados pela degradação rápida

de moléculas regulatórias chave (ROCK & GOLDBERG, 1999).

Diversas são as vias envolvidas na proteólise. Proteínas extracelulares

internalizadas por endocitose, como antígenos externos ou polipeptídeos

circulantes, assim como algumas proteínas celulares, como receptores de

membrana, são degradas nos lisossomos por proteases dependentes de pH (DI CE,

1987). A degradação lisossomal responde por uma pequena fração (< 10-20% ) do

turnover normal das proteínas. Por outro lado, a maior parte das proteínas celulares é degradada no citoplasma e no núcleo por um sistema proteolítico

(ROCK et al., 1994). Os primeiros trabalhos mostraram que este sistema requeria ATP (GRONOSTAJSKI et al., 1985), o que surpreendeu pelo fato da hidrólise dos peptídeos ser uma reação termodinamicamente favorável, e pelo fato de não se

conhecer proteases dependentes de ATP. Um sistema de degradação não

lisossomal foi então demonstrado na fração solúvel de extratos celulares

(ETLI NGER & GOLDBERG, 1977). A análise da dependência do ATP levou à

elucidação da via ubiquitina-proteassomo, na qual o ATP é essencial para a

marcação covalente dos substratos a serem degradados e para o funcionamento

do grande complexo proteolítico, o proteassomo 26S (HERSHKO & CI ECHANOVER,

1992).

A via da ubiquitina-proteassomo consiste nas ações orquestradas de

(28)

Introdução

degradação pelo proteassomo 26S. Este grande complexo multicatalítico degrada

proteínas poli-ubiquitinadas em pequenos peptídeos de 3 a 24 resíduos de

aminoácidos (SARI C et al., 2004), e está envolvido não só na degradação de proteínas velhas ou danificadas, mas também na regulação da transcrição gênica

(MURATANI & TANSEY, 2003), no controle de qualidade das proteínas recém

sintetizadas (LECKER et al., 2006), na disponibilização de aminoácidos para geração de energia (LECKER et al., 2006) além do funcionamento do sistema imune (LECKER & GOLDBERG, 2002). No citoplasma, núcleo e mitocôndrias há

geração constante de peptídeos pela ação do proteassomo. Foi demonstrado que

em eucariotos, 30% a 90% das proteínas recém-sintetizadas podem ser

degradadas pelos proteassomos minutos após sua síntese (LECKER & GOLDBERG,

2002; LI PPI NCOTT-SCHWARTZ et al., 1988). Desta forma, a ação do proteassomo gera e libera continuamente peptídeos livres nas células (GOLDBERG, 2003;

PI CKART, 2004).

Evidências sugerem que os peptídeos gerados pelo proteassomo no

citoplasma, mitocôndrias e núcleo (WOJCI K & DEMARTI NO, 2003) são

rapidamente hidrolisados em aminoácidos que são então utilizados na síntese de

(29)

Introdução

este mesmo estudo sugeriu que as principais enzimas envolvidas na degradação

destes peptídeos eram as aminopeptidases, uma vez que a proteção da porção

N-terminal destes mesmos peptídeos com o grupamento F-moc impediu o

aparecimento de fluorescência e logo, de hidrólise (REI TS et al., 2003). Embora este e outros trabalhos afirmem que peptídeos são rapidamente degradados em

células de mamíferos (REITS et al., 2003; ORLOWSKI et al., 1983; SARI C et al., 2004), é sabido que alguns peptídeos intracelulares gerados pelo proteassomo,

escapam da degradação completa e são apresentados na superfície celular ao

sistema imune, complexados a moléculas do complexo maior de

histocompatibilidade de classe I (MHC-I ; ROCK et al., 2002; GOLDBERG et al., 2002). De fato, estima-se que 10.000 peptídeos representantes do leque de

proteínas sintetizadas cubram a membrana celular de cada célula do organismo

humano (RAMMENSEE et al., 2002). Diversas peptidases estão envolvidas com o processamento de peptídeos antigênicos gerados pelo proteassomo (ROCK et al., 2004), dentre elas a endo-oligopeptidase EC 3.4.24.15.

1.5 Endo-oligopeptidase EC 3.4.24.15

A endopeptidase 24.15, também conhecida como timet-oligopeptidase (EC

3.4.24.15; EP24.15 ) é uma metaloendopeptidase exibindo o motivo característico

de ligação com zinco HEXXH, pertencente à família M3 de metalopeptidases (RAWLI NGS & BARRETT, 1995). A EP24.15 é amplamente distribuída em

(30)

Introdução

testículo, cérebro e hipófise (CHU & ORLOWSKI , 1985). A EP24.15 possui uma

especificidade restrita a oligopeptídeos de 6 a 17 resíduos de aminoácidos, tendo

preferência por ligações peptídicas no C-terminal de aminoácidos hidrofóbicos, não

sendo capaz de hidrolisar proteínas (OLIVEI RA et al., 2001). A EP24.15 foi originalmente isolada da fração citosólica do homogenato do cérebro de ratos por

Orlowski et al. (1983), como sendo uma metalopeptidase ativa em pH neutro e inibida por quelantes de cátions divalentes. A inibição provocada pela remoção do

metal do sítio catalítico com quelantes é revertida pela adição de zinco, mesmo em

baixas concentrações (TI SLJAR & BARRETT, 1990). A presença de Zn+ 2 em seu

sítio catalítico foi determinada por espectroscopia de absorção atômica (TI SLJAR &

BARRETT, 1990).

Através de mutações sítio dirigidas, Cummins et al. (1999) elucidaram quais eram os resíduos responsáveis pela coordenação do zinco no sítio ativo

(473HEXXH477), mostrando ainda que, além das histidinas, há um terceiro ligante

do zinco, o ácido glutâmico 502. A observação deste terceiro ligante a

aproximadamente 25 resíduos de aminoácido de distância é uma característica

(31)

Introdução

possibilitando o livre acesso do substrato ao centro catalítico (SHRI MPTON et al., 1997). Uma vez que inibidores naturais da enzima não foram descobertos, a

diferença entre o potencial redox do meio extracelular e intracelular foi proposta

como o modo pelo qual a atividade da EP24.15 é regulada (SHRI MPTON et al., 2002). Mais recentemente, Demasi et al. (2008) mostraram que dentro das células, a EP24.15 encontra-se naturalmente S-glutationilada em resíduos de

cisteína e que isto tem um profundo impacto sobre a atividade enzimática. Pelo

fato da enzima possuir vários resíduos de cisteína expostos, a quantidade de

glutationilação é variável. Assim quanto maior o grau de glutationilação, maior é a

quantidade de oligômeros da enzima e conseqüentemente menor a atividade

peptidásica (DEMASI et al., 2008 – Fig 4).

Figura 4. Mecanismo de troca tiol-dissulfeto proposta para a multimerização da EP24.15 através da S-glutationilação. Ânions tiolatos específicos de EP24.15 (Ep reduzida) são S-glutatiolados pelo GSSG (a). Os resíduos remanescentes de cisteína reduzida atacam a ponte dissulfeto da EP24.15 S-glutationilada (b), deslocando o GSH e formando uma ponte sulfúrica interprotéica (3). O processo avança dependendo da disponibilidade dos grupos reativos EP24.15-Cis-SH (1 e 2) ou se a concentração de GSSG for baixa, gerando formas multiméricas de EP24.15 (3, 4 ou mesmo multímeros maiores). Por outro lado, quando a concentração de GSSG é alta ou quando os ânions

EP reduzida ( 1)

( 1 ou 2) Troca tiol-dissulfeto

Trímero ( 1 ou 2)

(32)

Introdução

glutationilação da EP24.15 prevalesce sobre a oligomerização inibindo a troca tiol-dissulfeto. Nesta

condição, a forma monomérica altamente S-glutationilada seria a mais abundante (DEMASI et al.,

2008).

Desde que a EP24.15 foi isolada por Orlowski et al. (1983), acredita-se que ela participe do metabolismo e/ ou processamento de uma série de

neuropeptídeos. Entre os neuropeptídeos clivados por esta enzima estão a

bradicinina, a neurotensina, o hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH), a

somatostatina, a substância P, assim como as angiotensinas I e I I (SHRI MPTON et al., 2002). Foi demonstrado ainda que a EP24.15 é capaz de gerar as respectivas encefalinas a partir de precursores opióides intermediários (CHU & ORLOWSKI ,

1985). Por esta razão a EP24.15 foi envolvida em diversos processos fisiológicos

como a percepção de dor (MOLI NEAUX & AYALLA, 1990; KEST et al., 1991; KEST

et al., 1992), a homeostase cardiovascular e renal (ORLOWSKI et al., 1983; CARDOZO & ORLOWSKI , 1993; TELFORD et al., 1995) e a reprodução (PI EROTTI

et al., 1991; LEW et al., 1997; WU et al., 1997; SMI TH et al., 2000).

Embora a EP24.15 seja secretada, sua presença em vesículas secretórias

contendo o marcador ß-endorfina não foi observada, e seu time-course de secreção é distinto daquele descrito para os neuropeptídeos. Mostrou-se então que

(33)

Introdução

anos mostram que a maior quantidade de EP24.15 concentra-se no meio

intracelular (FONTENELE-NETO et al., 2001), mais especificamente no citoplasma e no núcleo das células. Assim, é muito provável que além das funções já descritas,

a EP24.15 participe de processos intracelulares. De fato, diversos trabalhos

associam a peptidase em questão à apresentação de antígenos pelas moléculas de

MHC-I (SI LVA et al., 1999, PORTARO et al., 1999; YORK et al., 2003; KIM et al., 2003). Como anteriormente mencionado, os peptídeos apresentados na superfície

celular compartilham a característica de possuir nove a doze resíduos de

aminoácidos e, portanto, têm o tamanho ótimo dos substratos da EP24.15. A

manipulação da atividade intracelular da EP24.15 seguida da análise de antígenos

apresentados via MHC-I levou à primeira sugestão de sua função intracelular: o

metabolismo de peptídeos apresentados como antígenos ligados a MHC-I (SI LVA

et al., 1999; PORTARO et al., 1999). Em macrófagos, o inibidor da EP24.15 CFP-AAF-pAB reduz, enquanto a adição da enzima recombinante ativa aumenta a

apresentação de antígenos derivados da heat shock protein 65 (HSP65) do bacilo da tuberculose através do MHC-I . A degradação de vários peptídeos apresentados

como antígenos pelo MHC-I foi analisada, levando a sugestão de que in vitro a EP24.15 não seria capaz de clivar eficientemente peptídeos antigênicos (PORTARO

et al., 1999). Em conjunto, esses dois trabalhos sugeriam que a EP24.15 poderia degradar de forma mais eficiente aqueles peptídeos gerados pelo proteassomo não

destinados à apresentação pelo MHC-I , permitindo o acúmulo e o transporte

(34)

Introdução

retículo endoplasmático rugoso. Trabalhos posteriores, utilizando proteínas outras

que não a HSP65 como antígeno, demonstraram que a redução na atividade da

EP24.15 levava a um aumento na apresentação de peptídeos antigênicos pelo

MHC-I (YORK et al., 2003; KI M et al., 2003). Dessa forma, parece que a função da EP24.15 pode ser tanto a de prevenir quanto destruir peptídeos antigênicos

apresentados pelo MHC-I . Embora controversos, esses dados demonstram a

participação irrefutável da EP24.15 neste processo intracelular.

Com o intuito de aumentar o conhecimento acerca das funções

intracelulares da EP24.15, uma série de estudos cujo o objetivo de identificar

novos substratos ou inibidores competitivos intracelulares para a EP24.15 foi

realizada. Para tal, mutações pontuais que levavam à inativação catalítica da

EP24.15 foram geradas (RI OLI et al., 2003). O uso da forma inativa da EP24.15 permitiu o isolamento e identificação de vários peptídeos naturais anteriormente

desconhecidos, sendo que a maior parte deles era constituída por fragmentos de

proteínas intracelulares e apresentavam sítios de modificação pós-traducional,

(35)

Introdução

Figura 5. Distribuição dos sítios encontrados em 39 peptídeos isolados com a EP24.15 inativa. Todos os peptídeos correspondem a fragmentos de proteínas intracelulares. Em parênteses encontra-se o número de peptídeos identificados contendo o sítio indicado. PKC – proteína quinase C, CKII – caseína quinase I I, CK I – caseína quinase I, p38 MAPK – quinase ativada por mitógeno

proteína 38, no hit – nenhum sítio previsto (MACHADO et al., 2006).

Uma observação bastante interessante do trabalho de Machado et al.

(2006) é a de que a fosforilação de peptídeos substratos da EP24.15 altera

significativamente sua cinética de degradação, sugerindo que esta modificação

pós-traducional possa regular, pelo menos em parte, o metabolismo e a função

celular de peptídeos.

1.6 Peptídeos intracelulares e sinalização

Uma ampla gama de dados mostra que seqüências peptídicas curtas são

capazes de alterar significativamente as interações entre proteínas e,

conseqüentemente, a resposta celular a determinado sinal. Entretanto, na maior

parte dos estudos, os peptídeos foram racionalmente desenhados para a

modulação da interação proteína-proteína de interesse. Por outro lado, dentro das

células, muitos intermediários peptídicos são continuamente gerados. Embora

muito pouco se saiba a respeito destes intermediários, um estudo mostrou

(36)

pós-Introdução

traducional (MACHADO et al., 2006). Estes e outros fatos levaram nosso grupo a formular a hipótese de que peptídeos intracelulares gerados pelo proteassomo 26S

durante o turnover protéico, poderiam fisiologicamente regular interações entre proteínas dentro das células, além de estimular ou inibir enzimas proteolíticas e

não proteolíticas, modulando cascatas de sinalização a exemplo dos peptídeos

(37)

Objetivo

2 OBJETI VO

(38)

Materiais e Métodos

3 MATERI AI S E MÉTODOS

3.1 I solamento de peptídeos de cérebro de rato - O isolamento dos

peptídeos de cérebro de ratos Wistar machos adultos (250-300 g) foi realizado

conforme descrito anteriormente, com algumas alterações (RIOLI

et al.

, 2003).

Com o intuito de inativar instantaneamente a proteólise inespecífica observada

logo após o sacrifício, o cérebro dos animais foi submetido a uma sessão de 10s de

microondas, logo após sua decapitação, sendo a temperatura no interior no

cérebro monitorada com um

probe

. A seguir, o cérebro foi homogeneizado em

solução de HCl 50 mM com o auxílio de um homogeneizador de tecidos (Tissue

Tearor, Biospec Products, Inc.) e aquecido a 70ºC por 15 min em banho-maria. Os

homogenatos foram centrifugados a 1500 x g a 4ºC e o sobrenandante foi

transferido para tubos de ultracentrífuga, sendo centrifugado a 100000 x g por 30

min a 4ºC. O sobrenadante foi filtrado em membrana Millipore que permite a

passagem de moléculas com peso molecular inferior a 5 kDa (

Centrifugal

Filter

Unit

, MILLIPORE, 5,000 NMCO) e o material não retido pela membrana (eluato -

(39)

Materiais e Métodos

2003) por 1 h. Após este tempo, a enzima ligada aos peptídeos foi separada do

resto da solução por gelfiltração a seco (1000 x g, 2 min) em resina Sephadex

G-25. Novamente, as amostras resultantes foram secas em Speed Vac e estocadas

em freezer a -80ºC até o seqüenciamento.

3.2 Quantificação de peptídeos endógenos intracelulares– A

quantificação dos peptídeos endógenos presentes nos extratos intracelulares de

cérebro de ratos assim como de células CHO-S e HEK293 foi realizada utilizando a

fluorescamina (UDENFRIEND

et al.

, 1972). A reação ocorreu em pH 6.8 para que

somente os grupamentos amino terminais dos peptídeos e não dos resíduos de

aminoácidos, reagissem com a fluorescamina. Uma quantidade de 2,5 µL de

amostra foi misturada a 25 µL de tampão fosfato (0,2 M, pH 6.8) e 12,5 µL de

uma solução de fluorescamina 0,3 mg/mL em acetona. Após agitação vigorosa por

1 min, 110 µL de água foram adicionados, e a fluorescência emitida pela

fluorescamina ligada aos peptídeos foi mensurada em um fluorímetro SpectraMax

M2e (Molecular Devices, USA) nos comprimentos de onda de excitação de 370 ηm

e emissão de 480 ηm. Uma mistura de peptídeos de composição e concentração

conhecidas foi usada como padrão para determinação da concentração peptídica.

3.3 Seqüenciamento de peptídeos por LC-MS/ MS - Os

seqüenciamentos de peptídeos por LC-MS/MS foram realizados em um aparelho

(40)

Materiais e Métodos

(CapLC, Waters). A mistura peptídica obtida conforme descrito acima foi separada

por gradiente de eluição (0-85%) utilizando mistura água/acetonitrila contendo

0.1% ácido fórmico em coluna capilar de 75 µm empacotada com sílica C18. Os

dados foram adquiridos automaticamente em modo dependente (DDA) após

geração de múltiplos peptídeos protonados por ionização em eletron spray (ESI),

seguido de dissociação em MS/MS por colisão com argônio em intensidade de 10 a

30 eV. O spectro de massa do íon produzido foi processado usando MaxEnt3 e o

seqüenciamento dos peptídeos foi realizado manualmente com a ajuda do

programa PepSeq (Micromass). Condições típicas de LC e ESI foram: fluxo de 10

ηL/min, voltagem no capilar do nanofluxo de 3.5 kV, temperatura do bloco de

80oC, e voltagem do cone de 100 V.

3.4 Análise das seqüências peptídicas - Para identificar os prováveis

precursores protéicos dos peptídeos seqüenciados, toda a aquisição de dados foi

processada em formato de texto (.pkl) pelo programa ProteinLynx 2.0 e uma busca

no banco de dados do NCBI, foi realizada através do programa Mascot. A busca de

possíveis sítios de modificação pós-traducional foi realizada no site

(41)

Materiais e Métodos

produzida em bactérias foi determinada em um ensaio contínuo utilizando-se o

substrato com fluorescência dependente de clivagem (QFS –

7-metoxicoumarina-4-acetil-Pro-Leu-Gly-Pro-dLys-(2,4-dinitrofenil). Em cada poço de uma placa de 96

poços foram misturados: 50 ηg de EP24.15 recombinante, 2 µM de QFS e cada um

dos peptídeos (0 a 50 µM). Os ensaios foram realizados em triplicata e o aumento

da fluorescência derivada da hidrólise do QFS pela EP24.15 foi monitorada por 2 h

com a freqüência de uma leitura por minuto (SHRIMPTON

et al.

, 1997; TULLAI

et

al.

, 2000). As constantes de inibição aparente (Kiap) dos peptídeos foram

determinadas com a equação:

Ki

=

Ki

ap/(1+[S]/

Km

), assumindo-se que

Ki

=IC50 e

onde [S] = concentração molar do substrato QFS,

Km

= constante de

Michaelis-Menten (RIOLI

et al.

, 2003). Os valores de IC50 para os peptídeos foram

determinados por regressão linear de uma plotagem do tipo XY onde X =

concentração logarítmica do peptídeo e Y = percentual de inibição obtido

experimentalmente na presença de cada peptídeo.

Para determinar o percentual de hidrólise de cada peptídeo, uma solução 100 µM

de peptídeo foi incubada com 0,16 ηg/µL de EP24.15 recombinante em uma

reação com cinética de ordem zero, após 15 min de incubação a temperatura

ambiente, as amostras foram analisadas por HPLC. A área dos picos dos peptídeos

antes e após a incubação com EP24.15 foi determinada e usada para o cálculo da

quantidade de peptídeo hidrolisado. O percentual de hidrólise obtido para cada

peptídeo de tempo foi normalizado ao da bradicinina, sendo os resultados

(42)

Materiais e Métodos

subseqüentemente analisado por HPLC para detecção da hidrólise dos peptídeos.

Nos casos em que a clivagem do peptídeo foi detectada, nova amostra foi

preparada incubando-se 100 µM de peptídeo com EP24.15 recombinante (0,16

ηg/µL), agora por 4 h a temperatura ambiente. As ligações peptídicas hidrolisadas

pela EP24.15 foram determinadas nestas amostras por espectrometria de massa

em um aparelho de MALDI-TOF (GE HealthCare, Uppsala, Sweden). As condições

de MALDI utilizadas nas análises foram: modo scan, 50 V de voltagem do cone e

uma janela de análise de 200 – 2000 m/z.

3.6 Síntese dos peptídeos escolhidos acoplados ao TAT por pontes

dissulfeto - Soughayer

et al.

(2004) demonstraram que substratos de quinase

ligados ao TAT por pontes dissulfeto entram em células, separam-se do TAT pela

redução das pontes e tornam-se biodisponíveis no citoplasma. Mais ainda os

autores mostraram que os substratos eram fosforilados mediante a estimulação

das quinases com ferramentas farmacológicas. Com base neste artigo, os

peptídeos escolhidos para estudo foram encomendados para síntese.

(43)

Materiais e Métodos

3.8 Monitoramento da entrada do peptídeo na célula e do

desligamento do TAT - Células CHO-S foram semeadas em placas de 6 poços.

Os peptídeos ligados ao TAT por pontes dissulfeto foram incubados em uma

concentração de 20 µM por 30 min. Após este tempo, as células foram coletadas

em PBS gelado, centrifugadas por 800 x g, 4°C por 10 min e ressuspendidas em

água milli-Q (130 µL). Procedeu-se a três ciclos de

congelamento/descongelamento para lise celular, sendo o lisado centrifugado a

20000 x g por 30 min a 4°C. Cinqüenta microlitros do sobrenadante foram

injetados em um aparelho de HPLC (Shimadzu) consistindo de um controlador

(SCL-10A VP), duas bombas de pistão (LC-10 AD VP), um detector de UV (SPD-10

AV VP) e um detector de fluorescência (RF-10A XL). Para possibilitar a detecção de

fluorescência da fluoresceína apesar do baixo pH no qual a separação

cromatográfica normalmente ocorre, foi acoplada uma terceira bomba ao sistema,

para bombeamento de uma solução de NH4OH/água 2.5:100 (v/v), que se junta

ao fluxo que sai do detector de UV em direção ao detector de fluorescência,

elevando o pH da solução para 11 (BAECHLE

et al.

, 2005). As separações

cromatográficas foram feitas em uma coluna XTerra® RP18 (Waters) corridas em

um gradiente binário linear (25% a 75% de B em 20 min, onde A=TFA 0.08% em

água e B= acetonitrila 90% em água e TFA 0.08%), na velocidade de 1mL/min.

A eluição dos peptídeos das amostras foi monitorada por fluorescência

utilizando os comprimentos de onda de excitação e emissão de 490 e 520 nm,

(44)

Materiais e Métodos

3.9 Ensaio microfisiométrico - Células CHO-S (Invitrogen) estavelmente

transfectadas com o receptor AT1 para angiotensina II (ang II) e gentilmente

cedidas pela Dr. Graciela C. Pignatari (PIGNATARI

et al.

, 2006) foram semeadas

em

transwells

(Costar Corning) em uma densidade de 2x105 células/

transwell

e

acondicionadas por 20 h em incubadora de células. No dia dos experimentos, os

transwells

foram colocados nas câmaras sensoras do microfisiômetro

Cytosensor™

(Molecular Devices, USA), que possuem um sistema biossensor de silicone,

responsável pelo monitoramento contínuo do pH do meio extracelular, sendo que a

ativação de receptores/vias de transdução de sinal é detectada pelo aumento da

velocidade de acidificação do meio extracelular. O pH do meio a ser usado nos

experimentos foi cuidadosamente acertado para 7.4. A ang II usada para estimular

as células e as soluções de peptídeos foram diluídas no mesmo meio citado acima

tendo também seu pH monitorado e mantido em 7.4. As câmaras foram

perfundidas com meio DMEM sem bicarbonato, suplementado com NaCl 44 mM,

num fluxo de 100 µL/min. Cada ciclo de medição de pH consistiu em um período

de 1 min, onde a bomba de perfusão permaneceu ligada por 40 s e desligada nos

(45)

Materiais e Métodos

células. Após 30 min de contato com o(s) peptídeo(s), foi feito um segundo

estímulo com ang II nas mesmas concentrações (Fig. 6).

Figura 6. Esquema temporal do ensaio de microfisiometria. As células foram deixadas no aparelho por 60 min para estabilização da resposta de acidificação basal. A ang II foi incubada por 15 s

sendo posteriormente lavada dos transwells e o aumento da taxa de acidificação do meio

extracelular (ECAR) foi monitorado por 10 min. A incubação subseqüente com o(s) peptídeo(s) foi realizada por 30 min, tempo após o qual foi feito um novo estímulo com ang II.

3.10 Ensaio de gene repórter: Ensaio da luciferase - A ativação de

receptores de membrana acoplados a proteína G desencadeia a ativação de

cascatas de sinalização intracelular, levando à modulação da taxa transcricional de

genes específicos. Desta forma, ensaios de atividade farmacológica baseados em

genes repórteres são úteis no monitoramento das respostas induzidas via ativação

de GPCR, assim como também pode ser usado na identificação de agentes que

interfiram nestas cascatas, alterando-as de alguma forma. Fitzgerald

et al.

(1999)

desenvolveram uma estratégia que permite a realização de ensaios funcionais em

larga escala para acompanhamento da ativação de vias transducionais. Este

sistema utiliza a expressão de um gene repórter (luciferase) controlado

simultaneamente por diferentes regiões promotoras (responsivas a AMPc, Ca2+ e

IP3, dentre outros) ligadas

in tanden

(FITZGERALD