UNI VERSI DADE ESTADUAL PAULI STA “ JÚLI O DE MESQUI TA FI LHO” FACULDADE DE ODONTOLOGI A DE ARAÇATUBA – FOA
DEPARTAMENTO DE CI ÊNCI AS BÁSI CAS - DCB
GEAN DOMI NGOS DA SI LVA SOUZA
EFEI TOS CARD I OV ASCU LARES E N A I N GESTÃO D E N a Cl H I PERTÔN I CO E ÁGU A I N D UZI D A PELA I N JEÇÃO D E TRAN S 4
-AM I N OCROTON I C ACI D ( TACA) N O N Ú CLEO PARABRAQU I AL LATERAL ( N PBL) D E RATOS
GEAN DOMI NGOS DA SI LVA SOUZA
EFEI TOS CARD I OV ASCU LARES E N A I N GESTÃO D E N a Cl H I PERTÔN I CO E ÁGU A I N D UZ I D A PELA I N JEÇÃO D E TRAN S 4
-AM I N OCROTON I C ACI D ( TACA) N O N Ú CLEO PARABRAQU I AL LATERAL ( N PBL) D E RATOS
Araçat uba 2011
Dissert ação apr esent ada ao Pr ogr am a Mult icênt rico de Pós- Gr aduação em Ciências Fisiológicas da Faculdade de Odont ologia de Ar açat uba/ Univ ersidade Est adual Paulist a “ Júlio de Mesquit a Filho” , com o par t e dos r equisit os par a obt enção do Tít ulo de Mest r e em Ciências, ár ea de concent r ação: Fisiologia
Or ient ador : Pr of. Dr . João Car los Caller a
D
A o soberano D eus primeiramente, pela oportunidade me dada
para cumprir com êxito esta etapa da minha vida gozando de plena
saúde, vigor físico, mental e espiritual. A minha família com especial
reconhecimento á minha M ãe
L eonice
, com amor, admiração e gratidão
por sua compreensão, carinho, presença e incansável apoio ao longo do
período de elaboração deste trabalho, o qual se tornou indispensável e
fundamental para superar todos os obstáculos durante o percurso.
AGRAD ECI M EN T OS
A am iga e com panheira de laborat ório Ta lit a de M e lo e Silv a pelo v alor inest im áv el da am izade cult ivada durant e o árduo desenv olvido de nosso t rabalho e ao im enso com panheirism o, colaboração e incent iv o para a realização do m esm o, sem ex cluir Gabi, Rit a, Cam ila Tam i, Lucilene, Bruna Biffe, Taís, Nat ália Manrique, Sim one, Rafael Ast olphi, Felipe Munhoz, Vilm a, Aline, Lígia, Fabiano, Sam uel, Wagner, César, Ariane e a t odos os dem ais com panheiros do Depart am ent o e do Program a Mult icênt rico de Pós- gradu ação em Ciências Fisiológicas – UNESP/ SBFI S.
Ao Dr. Joã o Ca r los Ca lle r a , que nos anos de convivência, m uit o m e ensinou, cont ribuindo para m eu crescim ent o cient ífico e int elect ual , t am bém por sua at enção e apoio durant e o processo de definição e orient ação.
À Univ ersidade Est adual Paulist a “ Júlio de Mesquit a Filho” U N ESP, Faculdade de Odont ologia de Araçat uba – FOA, pela oport unidade
de realização do curso de m est rado.
À Fundação de Am paro à Pesquisa do Est ado de São Paulo – FAPESP ( 2 0 0 9 / 0 3 0 0 6 - 4 ) , pela concessão da bolsa de m est rado e pelo
apoio financeiro para a realização dest a pesquisa.
Ao D e pa r t a m e n t o de Ciê n cia s Bá sica s - DCB, por colocar à disposição a área ex perim ent al e o laborat ório para obt enção dos result ados ex perim ent ais e a t odos os Professores Dout ores do DCB pela at enção e respeit o. Ao professor Wilson Galhego e Crist ina Ant oniali por sem pre m e incent iv ar a enfrent ar os desafios im post os pela pós-graduação.
t orcendo e orando por m im . São eles: Denise, Deiv a e Maria Clara
Gonçalv es, Eunice Dem ét rio, Aparecida e Edna Cardoso, Maria dos Anj os
por seu am or incondicional, m inha Tia Glady s e m eus prim os Diego,
Cy nt hia, Carla e seus herdeiros Heit or e Júlia, respect iv am ent e, sem m e
esquecer de I rene Barbosa, sendo part e da m inha fam ília, por est ar present e em t odos os m om ent os. A Maria Clarice ( t ia Lei) a qual ofereço t odo m eu carinho e adm iração. Não posso deix ar de lem brar- m e de am izades im port ant es com o Silvia Aparecida da Silv a ( in m em orian) e Ana Crist ina, pois, sem pre t orceram por m im . A am iga Am anda Baldoíno,
Gabriela e Nat ália Mot t a, Ângela Pat rícia e Gabriela Belizário por sem pre
est arem present es em m inhas conquist as e t orcendo pelo m eu crescim ent o pessoal e profissional.
Não poderia m e esquecer da m inha prim eira professora do j ardim de infância Terezinha de Fát im a Sândalo e a do ensino fundam ent al
Neide Cerv ant es Gorgone Arruda.
“S e um homem tem um talento e não tem capacidade de usá
-lo,
ele fracassou. S e ele tem um talento e usa somente a metade deste, ele
fracassou parcialmente. S e ele tem um talento e de certa forma aprende
a usá-lo em sua totalidade, ele triunfou gloriosamente e obteve uma
satisfação e um triunfo que poucos homens conhecerão.
”
RESU M O
SOUZA, GDS. Efeit os cardiov asculares e na ingest ão de NaCl 1,8% e água induzida pela inj eção de t rans- 4- am inocrot onic acid ( TACA) no núcleo parabraquial lat eral ( NPBL) de rat os [ Disser t ação de Mest rado] . Pr ogram a Mult icênt rico de Pós- Graduação em Ciências Fisiológicas da Universidade Est adual Paulist a ( UNESP, Araçat uba) e Sociedade Brasileira de Fisiologia ( SBFis) ; 2011.
A at iv ação de recept ores GABAA e GABAB no núcleo parabraquial lat eral
( NPBL) com m uscim ol e baclofen, respect iv am ent e, induz a ingest ão de água e NaCl hipert ônico em rat os. No present e est udo, inv est igam os os efeit os da inj eção no NPBL bilat eral de t rans- 4- am inocrot ónic acid ( TACA) , um agonist a não selet iv o dos recept ores GABAA e GABAC na ingest ão de
água e NaCl 1,8% induzida por depleção aguda de água e sódio. Foram ut ilizados r at os Wist ar com cânulas de aço inoxidáv el im plant adas bilat eralm ent e no NPBL. Est es anim ais foram deplet ados de água e sódio com inj eções do diurét ico furosem ida ( FURO 10 m g/ k g de peso corporal) com binado com baix a dose do inibidor da enzim a conversora de angiot ensina capt opril ( CAP 5 m g/ k g de peso corporal) . I nj eções bilat erais de um agonist a selet iv o do recept or GABAA, m uscim ol ( 0,5 nm ol/ 0.2 μl)
no NPBL aum ent ou a ingest ão de NaCl 1,8% e água ( 34.6± 6.9 e 29.2± 2.8 v s. salina: 4.4± 2.4 e 9.4± 2.5 m l/ 210 m in, respect iv am ent e) em rat os t rat ados com FURO+ CAP. I nj eções bilat erais de TACA ( 0,5 e 2,0 nm ol/ 0.2 μl) no NPBL não alt erou a ingest ão de NaCl 1 ,8% induzida pela depleção de sódio ( 6.1± 2.2 e 5.2± 1.4 m l/ 210 m in v s salina: 3.8± 1.0 e 4.6± 1.3 m l/ 210 m in, respect iv am ent e) . A com binação de um ant agonist a GABAC,
( 6,8± 1.7 m l/ 180 m in) . I nj eções bilat erais isoladas de ZAPA sulphat e no NPBL não m udou a ingest ão de NaCl 1,8% e água. A Pressão Art erial e a Freqüência Cardíaca não foram alt eradas por inj eções de TACA no NPBL. O result ados do present e est udo m ost ram que inj eções bilat erais de TACA não inibiram ou facilit aram a ingest ão de água e o apet it e ao sódio durant e a depleção aguda de água e sódio prom ovida por FURO+ CAP.
Pa la v r a s- ch a v e : apet it e ao sódio, ingest ão de água, núcleo parabraquial
ABST RACT
SOUZA, GDS. Cardiov ascular effect s and on 1,8% NaCl and w at er int ak e induced for t rans- 4- am inocrot onic acid inj ect ed int o t he lat eral parabrachial nucleus ( LPBN) of rat s [ Mast er degree] . Mult icent ric Graduat ed Program in Phy siological Sciences at t he Univ ersidade Est adual Paulist a ( UNESP, Araçat uba, Brazil) and Brazilian Societ y of Phy siology ( SBFis) ; 2011.
Act iv at ion of GABAA and GABAB recept ors in t he lat eral parabrachial
nucleus ( LPBN) , wit h m uscim ol and baclofen, respect iv ely , induces w at er and hy pert onic NaCl int ak e in rat s. I n t he present st udy w e inv est igat ed t he effect s of bilat eral inj ect ion of t rans- 4- am inocrot onic acid ( TACA) , an agonist of GABAA and GABAC recept ors int o t he LPBN on w at er and 1.8% NaCl int ake induced by acut e fluid deplet ion. Male Wist ar rat s wit h st ainless st eel cannulas im plant ed bilat erally in t he LPBN w ere used. They w ere acut ely deplet ed of w at er and sodium by inj ect ions of t he diure t ic furosem ide ( FURO 10 m g/ k g, bw ) com bined wit h low dose of t he angiot ensin conv ert ing enzy m e inhibit or capt opril ( CAP 5 m g/ k g, bw ) . Bilat eral inj ect ions of a select ive GABAA recept or agonist , m uscim ol ( 0.5
nm ol/ 0.2 μl) int o t he LPBN st rongly increased NaCl 1.8% and w at er int ake ( 34.6± 6.9 e 29.2± 2.8 v s saline: 4.4± 2.4 e 9.4± 2.5 m l/ 210 m in) in FURO+ CAP t reat ed rat s. Bilat eral inj ect ions of TACA (0.5 and 2.0 nm ol/ 0.2 μl) int o t he LPBN did not change sodium deplet ion- induced 1.8% NaCl int ake ( 6.1± 2.2 and 5.2± 1.4 m l/ 210 m in , respect iv ely , v s saline: 3.8± 1.0 and 4.6± 1.3 m l/ 210 m in) . The com binat ion of a GABAC ant agonist , ZAPA
not alt ered by TACA inj ect ed int o t he LPBN. We concluded t hat bilat eral inj ect ion of TACA not inhibit or facilit at e sodium appet it e during acut e fluid deplet ion.
Ke y W or ds: sodium appet it e, w at er int ak e, t hirst , lat eral parabrachial
LI STA D E FI GU RAS
Figu r a 1 - Fot om icrografia, m ost rando o local de inj eção bilat eral no núcleo parabraquial lat eral ( NPBL) do corant e Azul de Ev ans 2% ( set as) ... ... ... ... ... ... ... . ... ... ... ... ... ... ... ....39
Figu r a 2 – I ngest ão cum ulat iv a de água e NaCl 1.8% em rat os t rat ados com FURO+ CAP que receberam inj eções bilat erais de TACA ( 0.5 nm ol/ 0.2 μl, n= 6) ou salina no NPBL ... ... . ... ... ... ... ... ... ... ....41
Figu r a 3 – I ngest ão cum ulat iv a de água e NaCl 1.8% em rat os t rat ados com FURO+ CAP que receberam inj eções bilat erais de TACA ( 2 nm ol/ 0.2 μl) e salina no NPBL ... ... . ... ... ... ... ... ... ... ... ... .... 43
Figu r a 4 – I ngest ão cum ulat iv a de água e NaCl 1.8% em rat os t rat ados com FURO+ CAP que receberam inj eções bilat erais de TACA ( 160 nm ol/ 0.2 μl) e salina ( v eículo) no NPBL ... ... . ... ... ... ... ... ... ....45
Figu r a 5 – Efeit o da inj eção de ZAPA sulphat e ( 10 nm ol/ 0,2 μl) ou salina com binado com TACA ( 160 nm ol/ 0.2 μl) ou salina inj et ados no NPBL bilat eral na ingest ão cum ulat iv a de água e NaCl 1.8% em rat os deplet ados de sódio com furosem ida + capt opril ... ... ... ... ... ... .... . ....46
Figu r a 6 – I ngest ão cum ulat iv a de água e NaCl 1.8% em rat os t rat ados com FURO+ CAP que receberam i nj eções bilat erais de m uscim ol ( 0.5 nm ol/ 0,2 μl) e salina no NPBL ... ... .. ... ... ... ... ... ... ... ...48
Figu r a 7 – Alt erações na Pressão Art erial Média ( m m Hg) e Freqüência Cardíaca ( bpm ) de rat os t rat ados com FURO+ CAP que receberam inj eções bilat erais de TACA 2 nm ol/ 0.2 μl e salina no NPBL ... ... ... ... .50
LI STA D E ABREV I AT URAS
AN G I I - angiot ensina I I
AP - área post rem a
bpm – bat im ent os por m inut o
Cl- cloret o
CAP - Capt opril
CSN – sist em a nerv oso cent ral
D OI - 2,5- Dim et hoxy -
4-iodoam phet am ine FU RO – furosem ida
GABA – ácido gam
a-am inobut írico
FC – Freqüência cardíaca
ip – int raperit oneal
icv - int racerebrov ent ricular
K+ - pot ássio
LPBN – núcleo parabraquial
lat eral
m in - m inut os
m m – m ilím et ros
M 2 – recept or m uscarínico da
acet ilcolina
m m H g – m ilím et ros de m ercúrio
m N TS – núcleo do t rat o solit ário
m edial N a+ - sódio
N a Cl – cloret o de sódio
PAM – pressão art erial m édia
sc – subcut âneo
TACA – ácido t rans-
4-am inocrot ônico
ZAPA – zapa sulhphat e
sc – subcut ânea
α – alfa
PPl – m icrolit ro
E - bet a
U - Rô
J - gam a
G - delt a
≤ - m enor ou igual
SUM ÁRI O
1 I N TROD U ÇÃO ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ....23
2 OBJETI V OS ... ... ... ... .... ... ... ... ... ... ... ... ....30
3 M ATERI AI S E M ÉTOD OS ... ... ... ... ... ... ... ... ....31
3.1 Anim ais ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...31
3.2 I m plant e de cânulas de aço inoxidável no NPBL ... ... ... ...31
3.3 I nj eção das drogas no NPBL ... ... ... ... ... ... ... ... ....32
3.4 Drogas ... ... ... ... ... ... .. ... ... ... ... ... ... ... .. ..33
3.5 Depleção de sódio e água ( m odelo FURO+ CAP) ... ... ... ...33
3.6 Regist ro de Pressão Art erial Média e Freqüência Cardíaca ... .34
3.7 Análise hist ológica... ... ... .... ... ... ... ... ... ... ... ....34
3.8 Análise est at íst ica ... ... .... ... ... ... ... ... ... ... ....35
3.9 Prot ocolos ex perim ent ais ... ... ... ... ... ... ... ... ....35
3.9.1 I nj eções no NPBL bilat eral de TACA ou m uscim ol na ingest ão de água e NaCl 1.8% em rat os deplet ados com FURO+ CAP... ... ...36
3.9.2 Regist ro da PAM e FC em rat os deplet ados com FURO+ CAP...36
4 RESU LTAD OS 4.1 Hist ologia do NPBL ... ... ... .. ... ... ... ... ... ... ... ....39
4.2 Efeit o de inj eções no NPBL bilat eral de TACA na ingest ão de água e NaCl 1.8% em rat os deplet ados com FURO+ CAP ... ... ... ... ... . .40
4.3 Efeit o de inj eções no NPBL bilat eral de m uscim ol na ingest ão de água e NaCl 1.8% em rat os deplet ados com FURO+ CAP... ... ... ... ...47
5 D I SCUSSÃO ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ....54
6 CON CLU SÃO ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ....63
REFERÊN CI AS ... ... ... ... ... ... . .... .... ... ... ... ... ... ... ....65
AN EX O ... ... ... ... ... ... ... .... ... ... ... ... ... ... ... ....73
23
1 . I N TROD U ÇÃO
A osm olaridade plasm át ica é regulada por um a adequada ingest ão e ex creção de água e sódio. O com port am ent o de ingest ão de água e sódio é im port ant e para o cont role do v olum e dos líquidos do organism o, que por sua v ez é fu ndam ent al para a m anut enção da Pressão Art erial ( DE LUCA et al., 2003) .
As duas principais causas de ingest ão de água e sódio são: a desidrat ação celular decorrent e de um aum ent o da pressão osm ót ica do plasm a e a hipov olem ia causada por hem orragia e hipot ensão ( DENTON,
et al., 1984) . Nest as sit uações, recept ores e horm ônios produzidos,
sinalizam para o Sist em a Nerv oso Cent ral ( SNC) para desencadear respost as renais e/ ou com port am ent ais de busca de água e sódio ( THUNHORST et al., 1994) . Além disso, a ingest ão ou apet it e ao sódio é um com port am ent o que pode ocor rer em anim ais com necessidade de sódio pelo corpo ( ingest ão induzida) ou em anim ais que não precisam de sódio ( ingest ão liv re) ( FI TZSI MONS, 1999) .
24
Ent re as áreas post eriores do SNC env olvidas na regulação hidroelet rolít ica, o Núcleo Parabraqu ial Lat eral ( NPBL) localizada na pont e, dorsal ao pedúnculo cer ebelar superior t em recebido bast ant e at enção ( ANDRADE et al., 2006; CALLERA et al., 2005; DE OLI VEI RA et al., 2007; MENANI et al., 2002; MENANI et al., 1995; MENANI et al., 1998a,b,c; KI MURA et al., 2008; OHMAN et al., 1986) . O NPBL recebe fibras prov enient es de áreas post eriores do encéfalo env olvidas com o cont role hidroelet rolít ico, com o a área post rem a e a porção m edial do núcleo do t rat o solit ário ( NTSm ) ( NORGREN, 1978; SHAPI RO et al., 1985) e envia proj eções para áreas m ais ant eriores, com o para o núcleo paravent ricular do hipot álam o ( PVN) e o núcleo cent ral da am ígdala ( CI RI ELLO et al., 1984; HERBERT et al., 1990) .
Est udos ant eriores m ost raram que a lesão elet rolít ica do NPBL de rat os pr om ov eu um aum ent o na ingest ão de água induzida pela adm inist ração periférica ou cent ral de angiot ensina I I ou inj eção periférica de isoprot erenol ( OHMAN et al., 1986, 1989 ; JOHNSON et al., 1990) , m as não alt erou a ingest ão de água induzida pela inj eção int racer ebrov ent ricular ( i .c.v .) de carbacol ( agonist a colinérgico) ( MENANI
et al., 1999) , sugerindo o env olvim ent o de m ecanism os específicos para a
ingest ão de água induzida pela angiot ensina.
O NPBL t em um papel inibit ório no cont role da ingest ão de água e sódio ( DE LUCA et al., 2003; CALLERA et al., 2005; DE OLI VEI RA et al., 2007; KI MURA et al., 2008; MENANI et al., 1995) . I nj eção no NPBL de m et isergida ( ant agonist a serot oninérgico) ou proglum ide ( ant agonist a da colecist ocinina) prom ov eu aum ent o na ingest ão de água e sódio induzida pela angiot ensina I I int racerebrov ent ricular, pelo t rat am ent o com binado furosem ida ( FURO) + capt opril ( CAP) ( MENANI et al., 1996; DE GOBBI et
al., 2001) e pelo t rat am ent o com FURO seguido de m anut enção dos rat os
25
O am inoácido inibit ório GABA ( ácido J–am inobut írico) é o m ais im port ant e neurot ransm issor inibit ório nas porções gust at órias e viscer ais do NPBL ( KOBASHI et al., 1998a,b) . Dois diferent es subt ipos de recept ores que o neurot ransm issor GABA pode at iv ar são: recept ores ionot rópicos GABAA que são at iv ados pelo agonist a m uscim ol e bloqueados
pelo ant agonist a bicuculina ( AKAI KE et al., 1985) e recept ores m et abot rópicos GABAB que são at iv ados pelo agonist a baclofen ( BOWERY,
1989) . No ent ant o, est udos t êm m ost rado a ex ist ência de um t erceiro subt ipo de recept or GABAérgico que é farm acologicam ent e diferent e dos recept ores GABAérgicos j á descrit os ( ENZ et al., 1998) .
Os recept ores GABAA possuem diferent es subunidades, que são:
subunidades D, subunidades E e subunidades J além de um a subunidade G. ( GARRETT et al., 2000; WHI TI NG, 1999) . Est udos de Frit schy et al. ( 1999) ut ilizando West ern blot e im unohist oquím ica m ost raram que há t am bém diferent es isoform as e subt ipos de recept ores GABAB,
denom inados GABAB1a e GABAB1b. Est e est udo m ost rou a presença dest es
subt ipos de recept ores em células do hipocam po e dendrit os das células de Purkinj e. Esses recept ores são dist ribuídos por t odo o sist em a nerv oso de roedores com diferent es padrões de ex pressão. O predom ínio do subt ipo GABAB1a est á m aj orit ariam ent e no núcleo est riado, hipocam po,
giro dent eado, a área pré- ópt ica, hipot álam o, o t et o, cam ada de cél ulas granulares do cer ebelo e o t ronco encefálico. Enquant o os recept ores GABAB1b são alt am ent e ex pressos nas cam adas superficiais, habenula
m edial, núcleo int erpeduncular, cam ada m olecular do cer ebelo e da m edula espinal ( FRI TSCHY et al., 1999; MARGETA- MI TROVI C et al., 1999) . Exist e out ro subt ipo de recept or denom inado GABAB2. Est a
26
cort icais, núcleo caudado e put âm en, hipocam po e em t odas as regiões do t álam o, cerebelo e pont e ( BI LLI NTON et al., 2000) .
Os recept ores GABAC foram descrit os prim eiram ent e na lit erat ura
com ex perim ent os realizados com células da ret ina, descrevendo assim os prim eiros neurônios com recept ores para GABAC ( WOODWARD et al.,
1993) . Est es recept ores possuem um a elet rofisiologia diferenciada dos recept ores GABAA e GABAB. As células neuronais dopam inérgicas da ret ina
que ex pressam recept ores GABAC t am bém ex pressam conj unt am ent e
recept ores para GABAA e essas células são capazes de fazer at iv ação dos
canais de cloret o int racelular ( GUSTI NCI CH et al., 1999) .
Exist em diferent es subunidades de recept ores para GABAC, e
essas subunidades foram divididas em t rês cat egorias denom inadas ρ1 , ρ2 e ρ3. Est es recept ores GABAC est ão present es em regiões do Sist em a
Nerv oso Cent ral com o no hipocam po ( ENZ et al., 1995; WEGELI US et al., 1998; KI RI SCHUK et al., 2003) , am ígdala ( DELANEY et al., 1999) e t ronco cer ebral ( MI LLI GAN et al., 2004) . Os recept ores GABAC são at iv ados pelos
agonist as CACA ( cis- 4- am inocrot onic - agonist a selet iv o) ou TACA ( t rans-4- am inocrot onic acid – agonist a não- selet iv o) sendo bloqueados pelo ZAPA sulphat e ( ant agonist a GABAC) ( WOODWARD et al., 1992, 1993) .
Vale ressalt ar, que os recept ores GABAC são insensív eis ao bloqueio com
bicuculina ( ant agonist a GABAA) ou at iv ação com o baclofen ( agonist a
GABAB) ( BORMANN et al., 1996) .
O TACA t am bém pode agir com o um agonist a de algum as subunidades de recept ores GABAA. No ent ant o, ele t am bém é classificado
com o um ant agonist a com pet it iv o dos r ecept ores ρ1 e um agonist a parcial sobre os recept ores ρ2 no encéfalo hum ano ( VI EN et al., 2002) . No ent ant o, a m aioria dos est udos que ut ilizaram TACA at é o m om ent o foram realizados in vit ro. At rav és de t écnicas de PCR em t em po real ( RT- PCR) , a subunidade ρ1 de recept ores GABAC foi ident ificada principalm ent e na
27
( VI EN et al., 2002) . A hibridização in sit u rev elou a ex pressão de ρ2 na ret ina de rat os adult os e algum as out ras part es das vias visuais ( JOHNSTON et al., 2003) . Um a elev ada ex pressão da subunidade ρ2 foi obser v ada na superfície da subst ância cinzent a, colículo superior e núcleo geniculado lat eral dorsal. Tam bém foi det ect ada ex pressão dessa subunidade na sext a cam ada do córt ex v isual e em células piram idais do hipocam po. Ex pressões de m RNA da subunidade ρ3 foi claram ent e diferent e da out ras das subunidades ρ1 e ρ2, sendo ex pressas m aj orit ariam ent e no hipocam po e m inorit ariam ent e na ret ina, nos gânglios da raiz dorsal e no córt ex ( JOHNSTON et al., 2003) .
Est udos ant eriores ( DE LUCA et al., 2003; CALLERA et al., 2005; DE OLI VEI RA et al., 2007; KI MURA et al., 2008) , foram realizados com o obj et iv o de av aliar o env olvim ent o dos m ecanism os GABAérgicos no NPBL na ingest ão de água e NaCl 1.8% em rat os. Est es est udos m ost raram que a at iv ação no NPBL de recept ores GABAA com m uscim ol prom ov eu
aum ent o de pressão art erial e induziu ingest ão de NaCl 1.8% e água em rat os saciados e t rat ados com FURO+ CAP ( CALLERA et al., 2005) . Além disso, m uscim ol inj et ado bilat eralm ent e no NPBL induziu ingest ão de NaCl 1,8% e água em rat os hiperosm ót icos ( t rat ados com sobrecarga int ragást rica de NaCl 0.2 M) ( KI MURA et al., 2008) , t rat am ent o que induz hipernat rem ia, hiperosm olaridade e redução da renina plasm át ica, sem redução da v olem ia ( PEREI RA et al., 2002) . Além do agonist a GABAA
inj et ado bilat eralm ent e no NPBL prom ov er aum ent o na ingest ão de água e NaCl 1,8% , um est udo recent em ent e publicado por De Oliveira et al. ( 2011) , m ost rou que inj eções no NPBL de baclofen ( agonist a GABAB)
t am bém prom ov eram aum ent o na ingest ão de água e NaCl 1,8% em rat os saciados, porém não alt erou os parâm et ros cardiov asculares de Pressão Art erial Média ( PAM) e Freqüência Cardíaca ( FC) .
Port ant o, qual seria o efeit o da at iv ação dos recept ores GABAC
28
Considerando que não exist em inform ações na lit erat ura m ost rando o env olvim ent o dos recept ores GABAC no NPBL no cont role
cardiov ascular e na ingest ão de água e NaCl 1, 8% , est udam os nest e t rabalho os efeit os da inj eção no NPBL do agonist a não selet iv o GABAA/ GABAC ( TACA) nos v alores basais de PAM e FC e na ingest ão de
O
30
2 . OBJETI V OS
2 .1 I nvest igar os efeit os da at iv ação ou bloqueio dos recept ores GABAC
com inj eções no NPBL bilat eral de agonist a e ant agonist a, TACA e ZAPA sulphat e, respect iv am ent e, na ingest ão de água e NaCl 1.8% em rat os deplet ados de sódio com inj eções subcut âneas de furosem ide e capt opril.
2 .2 I nv est igar os efeit os da at iv ação dos recept ores GABAC com inj eções
31
3 M ATERI AI S E M ÉTOD OS
3 .1 AN I M AI S
Nest e est udo, foram ut ilizados rat os Wist ar com peso padronizado ent re 290 e 320 gram as no início dos ex perim ent os. Esses anim ais foram fornecidos pelo Biot ério Cent ral do Cam pus da Faculdade de Odont ologia da UNESP de Araçat uba ( FOA) . Os anim ais foram m ant idos em gaiolas individuais no laborat ório sob condições adequadas de um idade ( 55± 10% ) e t em perat ura ( 220C) e com ciclo claro- escuro de 12 horas com eçando às 7 horas da m anhã. Água, NaCl 1.8% e ração granulada est av am liv rem ent e disponív el nas gaiolas. Est udo aprov ado em 12/ 02/ 2009, pelo Com it ê de Ét ica na Ex perim ent ação Anim al da FOA ( Prot ocolo núm ero 2008- 001332) .
3 .2 I M PLAN TE D E CÂN ULAS D E AÇO I N OX I D ÁV EL
N O N PBL
32
pont os de int rodução das cânulas de aço inoxidáv el, segundo as coordenadas obt idas do At las Hist ológico de Paxinos e Wat son ( 1986) : 9,4 m m caudal ao bregm a; 2,2 m m lat eral a linha m édia e 3,9 m m abaix o da dura- m át er. Nest es pont os foi feit a um a t repanação do osso do crânio com um a broca odon t ológica esférica acoplada a um m ot or de baix a rot ação, abrindo um orifício de aproxim adam ent e 1,5 m m de diâm et ro. Cânulas de aço inoxidável ( 12 m m ) confeccionadas à part ir de agulhas hipodérm icas ( 25x 0,6 m m ) foram posicionadas bilat eralm ent e 2 m m acim a do NPBL. Essas cânulas foram fixadas ao crânio do rat o com resina acrílica de uso odont ológico e ancorada por pequenos parafusos de aço inoxidáv el, previam ent e int roduzidos no osso. Após a com plet a fix ação da cânula, a t orre do est ereot áxico foi rem ovida e p ara im pedir a obst rução da cânula guia at é a realização dos ex perim ent os foi int roduzida na m esm a um m andril ( 12 m m ) t am bém de aço inoxidáv el. O rat o foi ret irado do aparelho est ereot áxico e com o m edida profilát ica após a cirurgia, foi inj et ado 0.2 m l de u m ant ibiót ico v et erinário ( associação de penicilina com est rept om icina 1.200.000 UI ) por via int ram uscular. Term inada a cirurgia cerebral, os rat os foram dev olvidos em suas gaiolas individuais com ração, água e NaCl 1, 8% por um período de pelo m enos 5 dias ant es do início dos ex perim ent os.
3 .3 I N JEÇÃO D AS D ROGAS N O N PBL
As drogas TACA e ZAPA sulphat e ( agonist a e ant agonist a dos recept ores GABAC, respect iv am ent e) , além de m uscim ol ( agonist a GABAA)
33
que foi int roduzida at ravés da cânula guia previam ent e fix ada no m esm o. A cânula inj et ora foi 2 m m m ais l onga do que a cânula guia. O v olum e da inj eção foi de 0.2 μl.
3 .4 D ROGAS
As drogas ut ilizadas foram : m uscim ol Hy drobrom ide ( Sigm a-Aldrich, Saint Louis, MO, USA) na dose de 0.5 nm ol/ 0.2 μL, TACA ( Trans-4- am inocrot onic acid – Tocris, Ellisville, MO, USA) em doses de 0.5, 2.0 , 80 e 160 nm ol/ 0.2 μL, ZAPA Sulphat e ( Tocris, Ellisville, MO, USA) na dose de 10 nm ol/ 0.2 μL, Furosem ida ( Sigm a- Aldrich, Saint Louis, MO, USA) na dose de 10 m g/ k g e Capt opril ( Sigm a- Aldrich, Saint Louis, MO, USA) na dose de 5 m g/ k g.
3 .5 D EPLEÇÃO AGU D A D E SÓD I O E ÁGU A
( M OD ELO FURO+ CAP)
Depleção aguda de sódio e água foi induzida por inj eções subcut âneas ( sc) de furosem ida ( FURO, 10 m g/ k g de peso corporal) associado com capt opril ( CAP, 5 m g/ k g de peso cor poral) , com o descrit o prev iam ent e em est udos ant eriores ( MENANI et al., 1996; DE GOBBI et
al., 2001; CALLERA et al., 2005) . Os rat os foram rem ovidos das gaiolas
34
m inut os de ex perim ent o. Os ex perim ent os t iv eram o int erv alo de 48 horas.
3 .6 REGI STRO D E PRESSÃO ARTERI AL M ÉD I A E
FREQÜÊN CI A CARD Í ACA
Os rat os foram anest esiados com Ket am ina sc ( 80 m g/ k g de peso) + xilazina ( 7 m g/ k g de peso corporal) . Após est e procedim ent o, t ubo de poliet ileno ( PE 10 conect ada a um PE 50) foi inserido na art éria aort a abdom inal at ravés da art éria fem oral. A cânula foi guiada por via subcut ânea e ex t eriorizada na região cervical do anim al. No dia seguint e, a cânula foi conect ada a um t ransdut or de pressão P23 Db ( St at ham Gould) , acoplado a um pré- am plificador ( m odelo ETH- 200 Bridge Bio Am plifier, CB Sciences) conect ado a um sist em a de aquisição de sinais por com put ador Pow erlab ( Pow erlab 8SP, ADI nst rum ent s) para regist ro de Pressão Art erial Média ( PAM) e Freqüência Cardíaca ( FC) em rat os não anest esiados. Depois do regist ro dos parâm et ros cardiov asculares durant e ≥ 20 m in ( regist ro cont role) , os rat os foram deplet ados com FURO+ CAP. Após 45 m inut os, os rat os receberam inj eções bilat erais de salina ou TACA ( 2 ou 80 nm ol/ 0.2 Pl) no NPBL. Os v alores de PAM e FC foram regist radas durant e 90 m inut os após a inj eção no NPBL e os v alores regist rados a cada 30 m in. Durant e as grav ações de PAM e FC, água, NaCl 1,8% e ração não est av am disponíveis aos anim ais.
35
Term inados os ex perim ent os, os rat os receberam um a inj eção no NPBL bilat eral do corant e Azul de Evans 2% ( v olum e de 0.2 μl) para det erm inar o local específico das inj eções. A seguir, os rat os foram anest esiados com pent obarbit al sódico ( 8 0 m g/ k g i.p.) e subm et idos a abert ura da região t oráxica para ex posição do coração para perfusão cer ebral com salina t am ponada ( 30 m l) seguida d e perfusão com solução de form alina 10% ( 30 m l) . Para facilit ar a perfusão cerebral, a art éria aort a descendent e foi bloqueada com pinça hem ost át ica e a cav a superior seccionada. A seguir, os cér ebros foram ret irados e fix ados em form ol 10% por alguns dias. Cort es t ransv ersais ( 60 μm de espessura) foram feit os nos pont os de inj eções das drogas no NPBL com aux ílio de um m icrót om o de congelam ent o ( Leica) . Os cort es hist ológicos, m ont ados em lâm ina, foram analisados a fresco para se localizar os pont os das inj eções. Som ent e os rat os que apresent aram m arcações no NPBL bilat eral foram considerados na análise est at íst ica dos result ados.
3 .8 AN ÁLI SE ESTATÍ STI CA
Os result ados foram apresent ados com o m édia ± erro padrão da m édia ( E.P.M.) . A análise de v ariância ( ANOVA) seguido pelo t est e de New m an- Keuls foram ut ilizados para as com parações ent re os diferent es t rat am ent os. As diferenças est at íst icas foram aceit as com o significat iv as para p< 0.05.
36
3 .9 . 1 . I n j e çõe s n o N PBL b ila t e r a l d e TACA ou
m u scim ol n a in g e st ã o d e á g u a e N a Cl 1 .8 % e m r a t o s
d e p le t a d os com FU RO+ CAP
Um a hora ant es da realização dos ex perim ent os os anim ais foram t rat ados com inj eções subcut âneas de FURO+ CAP para depleção aguda de água e sódio e im ediat am ent e após est e t rat am ent o, os anim ais foram m ant idos sem água, ração e NaCl 1,8% durant e a ex ecução do prot ocolos ex perim ent ais. Após 30 m inut os do t rat am ent o com FURO+ CAP os anim ais receberam inj eções do ant agonist a GABAc ZAPA sulphat e ( 10
nm ol/ 0.2 Pl) . As inj eções no NPBL de TACA ( agonist a GABAA/ GABAC – em
doses de 0.5, 2.0, e 160 nm ol/ 0.2 Pl) ou m uscim ol ( agonist a GABAA – na
dose de 0.5 nm ol/ 0.2 Pl) foram feit as 15 m in ut os ant es do início das m edidas de ingest ão cum ulat iv a de água e NaCl 1.8% . Os rat os foram dev olvidos nas gaiolas sem ração, água e NaCl 1.8% e após m ais quinze m inut os foram ofert adas aos anim ais, as buret as graduadas cont endo solução de NaCl 1,8% e água. As m edidas de ingest ão foram realizadas de form a cum ulat iv a aos 30, 60, 90, 120, 150, 180 e 210 m inut os.
37
39
4 RESULTAD OS
4 .1 H ist olog ia d o N PBL
A Figura 1 m ost ra um cort e hist ológico do núcleo parabraquial lat eral ( NPBL) de um rat o represent at iv o dos grupos est udados que recebeu as inj eções do corant e azul de Ev ans 2% no NPBL bilat eral.
40
4 .2 Efe it o d e in j e çõe s n o N PBL b ila t e r a l d e TACA
n a in g e st ã o d e á g u a e N a Cl 1 .8 % e m r a t os d e p le t a d os
com FU RO+ CAP
41
Figu r a 2 – I ngest ão cum ulat iv a de água e NaCl 1.8% em r at os t r at ados com FURO+ CAP que r eceber am inj eções bilat er ais de TACA ( 0.5 nm ol/ 0.2 μl, n= 6) e salina no NPBL. O prim eiro gráfico represent a ingest ão de sódio, o segundo r epresent a a ingest ão de água. Os r esult ados for am expr essos pela m édia ± EPM ( n = núm er o de r at os) .
Time (min)
0
30
60
90
120
150
180
210
Cumulative
1.8%
NaCl intake (ml)
0
2
4
6
8
10
FURO-CAP + TACA 0.5 nmol
FURO-CAP + saline
(n=6)
Time (min)
0
30
60
90
120
150
180
210
Cumulative
w
ater intake (ml)
42
43
Figu r a 3 – I ngest ão cum ulat iv a de água e NaCl 1.8% em r at os t r at ados com FURO+ CAP que r eceber am inj eções bilat er ais de TACA ( 2 nm ol/ 0.2 μl) e salina no NPBL. O pr im eir o gráfico represent a ingest ão de sódio, o segundo represent a a ingest ão de água. Os r esult ados for am ex pr essos pela m édia ± EPM ( n = núm er o de r at os) .
Time (min)
0
30
60
90
120
150
180
210
Cumulative
1.8%
NaCl in
take (ml)
0
2
4
6
8
10
FURO-CAP + TACA 2 nmol
FURO-CAP + saline
(n=11)
Time (min)
0
30
60
90
120
150
180
210
Cumulative
w
a
ter intake (ml)
44
45
Time (min)
0 30 60 90 120 150
Cu
mu
lative
1.8%
NaCl intake (ml)
0 5 10 15 20 25
FURO-CAP + TACA 160 nmol
FURO-CAP + saline
(n=10)
Time (min)
0 30 60 90 120 150
Cu
mu
lative
w
a
ter intake (ml)
0 5 10 15 20
46
Time (min)
0 30 60 90 120 150 180 210
Cumulative
1.8%
NaCl intake (ml)
0 5 10 15 20 25
vehicle + TACA (160 nmol) ZAPA (10 nmol) + TACA vehicle + saline
ZAPA + saline
(n = 10)
Time (min)
0 30 60 90 120 150 180 210
Cumulative
water intake (ml)
0 5 10 15 20
47
4 .3 Efe it o de in j e çõe s n o N PBL bila t e r a l de m u scim ol n a in ge st ã o de á gu a e N a Cl 1 .8 % e m r a t os de ple t a dos com FU RO+ CAP
Est udo ant erior ( Callera et al., 2005) , m ost rou que inj eções no NPBL bilat eral de m uscim ol ( 0.5 nm ol/ 0.2 μl) , um agonist a selet iv o de recept ores GABAA, prom ov eu aum ent o da ingest ão de NaCl 1.8% em rat os
t rat ados com FURO+ CAP. Nest e prot ocolo ex perim ent al, procuram os av aliar se inj eções de m u scim ol, na m esm a região do NPBL onde foi feit a a inj eção de TACA, obser v aríam os alt erações na ingest ão de NaCl 1.8% e água. A figura 6, m ost ra os r esult ados de inj eções no NPBL do m uscim ol ( 0.5 nm ol/ 0.2 μl, n= 6 ) na ingest ão de NaCl 1.8% e água no m odelo de depleção de sódio prom ovido pela adm inist ração sim ult ânea do diurét ico furosem ida ( 10 m g/ k g sc) e baix as doses do inibidor da enzim a conv ersora de angiot ensina capt opril ( 5 m g/ k g sc) .
I nj eções de m uscim ol no NPBL prom oveu aum ent o significat iv o da ingest ão de NaCl 1.8% e água induzido pelo t rat am ent o prévio com FURO+ CAP ( 34.6± 6.9 e 29.2± 2.8 v s salina: 4.4± 2.4 e 9.4± 2.5 m l/ 210 m in, p< 0.05) .
Os result ados apresent ados, sugerem que a adm inist ração no NPBL bilat eral de TACA ( um agonist a não selet iv o dos recept ores GABAC) ,
diferent em ent e da adm inist ração no NPBL de m uscim ol ( um agonist a dos recept ores GABAA) , não ex erce efeit o ex cit at ório ou inibit ório sobre a
48
Figu r a 6 – I ngest ão cum ulat iv a de água e NaCl 1.8% em r at os t r at ados com FURO+ CAP que receberam inj eções bilat erais de m uscim ol ( 0.5 nm ol/ 0,2 μl) e salina no NPBL. O prim eiro gráfico represent a ingest ão de sódio, o segundo r epresent a a ingest ão de água. Os r esult ados for am expr essos pela m édia ± EPM ( n = núm er o de r at os) .
Time (min)
0
30
60
90
120
150
180
210
Cumulativ
e
1.8%
NaCl intake (ml)
0
10
20
30
40
FURO-CAP + muscimol 0.5 nmol
FURO-CAP + saline
(n=6)
Time (min)
0
30
60
90
120
150
180
210
49
4 .4 Efe it o de in j e çõe s n o N PBL bila t e r a l de TACA n a Pr e ssã o Ar t e r ia l M é dia e Fr e qü ê n cia Ca r día ca e m r a t os de ple t a dos com FU RO+ CAP
A figura 7, m ost ra os result ados de inj eções no NPBL de TACA ( 2 nm ol/ 0.2 μl, n= 6) na Pressão Art erial Média ( PAM, m m Hg) e Freqüência Cardíaca ( FC, bpm ) em rat os deplet ados com FURO+ CAP.
50
Changes in MAP (mmHg)
-5
0
5
10
15
saline
TACA 2 nmol
60 30
Changes in HR (bpm)
-40
-30
-20
-10
0
10
20
(n = 6)
90 min
Figu r a 7 – Alt er ações na Pr essão Ar t er ial Média ( m m Hg) e Fr eqüência Car díaca ( bpm ) de r at os t r at ados com FURO+ CAP que r eceber am inj eções bilat er ais de TACA 2 nm ol/ 0.2
51
52
Changes in MAP (mmHg)
-15
-10
-5
0
5
10
saline
TACA 80 nmol
60
30
Changes in HR
(bpm)
-40
-20
0
20
40
60
(n = 4)
90 min
D
54
5 D I SCUSSÃO
De acordo com est udos ant eriores ( Callera et al., 2005) , inj eções no Núcleo Parabraquial Lat eral ( NPBL) de m uscim ol, um agonist a dos recept ores GABAA, prom ov eram aum ent o na ingest ão de NaCl 1,8% e
água em anim ais deplet ados de sódio com inj eções subcut âneas ( sc) de FURO+ CAP. Em nossos result ados, inj eções no NPBL bilat eral de m uscim ol, t am bém prom ov eu aum ent o na ingest ão de água e sódio 1,8% em anim ais prev iam ent e t rat ados com FURO+ CAP. O env olvim ent o dos recept ores GABAA do NPBL no cont role da ingest ão de água e NaCl pode
ser obser v ado com inj eções no NPBL bilat eral do ant agonist a do recept or GABAA bicuculina que dim inui a ingest ão de água e NaCl hipert ônico
induzida por inj eções de m uscim ol , o que sugere que o m uscim ol at iv a os recept ores GABAA para aum ent ar a ingest ão de sódio em rat os saciados e
deplet ados de sódio ( CALLERA et al., 2005; DE OLI VEI RA et al., 2007) . Os result ados obt idos nest e est udo, m ost ram que inj eções no NPBL bilat eral de TACA ( ácido t rans- 4- am inocrot ônico) , um agonist a não selet iv o do recept or GABAC ( WOODWARD et al., 1992, 1993; FEI GENSPAN
et al., 1998) em diferent es doses ( 0,5, 2,0 e 160 nm ol/ 0.2 μl) não alt era a ingest ão de água e NaCl 1,8% em rat os t rat ados com FURO+ CAP. Nenhum a alt eração ocorreu com os parâm et ros cardiov asculares, com o Pressão Art erial Média ( PAM) e Freqüência Cardíaca ( FC) após inj eções no NPBL de TACA. Diferent em ent e, Callera et al., ( 2005) , m ost raram que inj eções no NPBL de m uscim ol produziu aum ent o na Pressão Art erial Média. O present e est udo m ost ra t am bém que o pré- t rat am ent o com inj eções bilat erais do ant agonist a do recept or GABAC ZAPA sulphat e no
55
I m port ant es m ecanism os para o cont role da ingest ão de sódio e água est ão present es no NPBL, um a est rut ura pont ina localizada dorsolat eralm ent e ao pedúnculo cerebelar superior ( ANDRADE et al., 2006; DE LUCA et al., 2003; DE OLI VEI RA et al., 2007; MENANI et al., 1995; MENANI et al., 1998a,b,c; MENANI et al., 2002; ) . I nj eções bilat erais de m et isergida no NPBL, um ant agonist a dos recept ores serot oninérgicos aum ent ou a ingest ão de NaCl hipert ônico induzida pela angiot ensina I I ( ANG I I ) , adm inist rada int racer ebrov ent ricu lar ou no órgão subfornical ( OSF) ( COLOMBARI et al., 1996; MENANI al., 1996) ou por 24 horas de priv ação de água ou por 24 h de depleção de sódio ou por inj eções subcut âneas ( sc) de acet at o deox icort icost erona - DOCA ( MENANI et al., 1995; MENANI et al., 1996; MENANI et al., 1998a,b; DE GOBBI et al., 2000) . O bloqueio de recept ores colecist ocinérgicos ou a at iv ação de recept ores alfa- 2 adrenérgicos no NPBL aum ent a a ingest ão de NaCl em rat os t rat ados com FURO+ CAP ( ANDRADE et al., 2006; DE GOBBI et al., 2001) .
O NPBL m ant ém conex ões com áreas do prosencéfalo, t ais com o o núcleo parav ent ricular do hipot álam o, o núcleo cent ral da am ígdala, núcleo pré- ópt ico m ediano, regiões bulbares, área post rem a ( AP) e a porção m edial do núcleo do t rat o solit ário ( m NTS) . Port ant o, t ais conex ões perm it em que o NPBL possa m ediar respost as que v ão da AP e m NTS para as áreas m ais ant eriores do cér ebr o que são capazes de regular com port am ent os com o os relacionados com ingest ão de água e sódio. ( NORGREN, 1978; CI RI ELLO et al., 1984; FULWI LER et al., 1984; HERBERT et al., 1990; JHAMANDAS et al., 1996) .
O processam ent o neural no núcleo parabraquial est á sob um a fort e inibição GABAérgica m ediada por diferent es t ipos de recept ores GABA ( GUTHMANN et al., 1998) . Além de ex pressar diferent es t ipos de recept ores GABA com o por ex em plo, GABAA e GABAB, o NPBL t am bém
56
pot ássio prom ov endo um a hiperpolarização celular ocasionando inibição neuronal ( CHRI STI E et al., 1988) .
Tem sido relat ado que a at iv ação de recept ores GABAA com
m uscim ol no NPBL produz aum ent o da Pressão Art erial Média em rat os saciados e aum ent a a ingest ão de NaCl 1,8% e água em rat os deplet ados de sódio t rat ados com FURO+ CAP subcut âneo ( sc) ( CALLERA et al., 2005; DE OLI VEI RA et al., 2007) . Além disso, o bloqueio de m ecanism os inibit órios no NPBL por inj eções de m uscim ol produz aum ent o na ingest ão de NaCl hipert ônico em rat os com desidrat ação int racelular ( KI MURA et
al., 2008) . Um est udo recent e, m ost rou que a at iv ação de recept ores
GABAB com baclofen no NPBL t am bém in duz a ingest ão de água e NaCl
1,8% em rat os saciados ( DE OLI VEI RA et al., 2011) .
O GABA é o neurot ransm issor inibit ór io m ais abundant e present e no Sist em a Nerv oso Cent ral ( SNC) de m am íferos. Est e neurot ransm issor ex erce suas at ividades at uando em t rês t ipos de recept ores que são: GABAA, GABAB e GABAC. Est es recept ores possuem caract eríst icas
farm acológicas diferent es. Os recept ores GABAA e GABAC são canais
iônicos, ou sej a, recept ores i onot rópicos. Já os recept ores GABAB são
recept ores m et abot rópicos clássicos que at uam at rav és de um a prot eína G ( CHEBI B et al., 1999; BORMANN, 2000) .
Os recept ores GABAA são com post os à part ir de diferent es
subunidades para form ar um a est rut ura pent am érica. Várias classes de subunidades, com m últ iplas isoform as foram ident ificadas pela seqüência de sua hom ologia. No cér ebro, esses recept ores GABA parecem ser com post os por seis diferent es D- subunidades (D1-D6) , t rês E- subunidades (E1-E3) , t rês J- subunidades (J1-J3) e um a subunidade G. As subunidades de recept ores GABAA m ais encont radas no SNC que ex ercem at ividades
inibit órias são com post as de 2 subunidades D, 2 subunidades E e um a subunidade J ( GARRETT et al., 2000; WHI TI NG, 1999) .
57
diferent es propriedades fisiológicas e farm acológicas dos canais iônicos operados por ligant es ( SI EGHART, 1995; RUDOLPH et al., 2001) . Um a análise da dist ribuição im unohist oquím ica de subunidades dos recept ores GABAA evidenciou a presença das subunidades D1, E1, E2 e J3 no NPBL
( PI RKER et al., 2000) . Port ant o, baseados nest as evidências, podem os sugerir que o aum ent o na ingest ão de NaCl hipert ônico e água após inj eção no NPBL de m uscim ol em rat os saciados ou t rat ados com FURO+ CAP sej a por at iv ação de subunidades D1, E1, E2 e J3 dos recept ores GABAA.
Est udos realizados por Rudolph et al. ( 1999) , m ost raram que um a única m ut ação da subunidade D1 prej udica a sensibilidade dos recept ores GABAA para benzodiazepínicos, sem alt erar a afinidade ao
GABA, prov ocando um a perda do efeit o sedat iv o, am nésico e ant iconvulsiv ant e dos recept ores GABAérgicos. Est es dados indicam que as ações sedat iv a, am nésica e ant iconvulsiv ant e são m ediadas principalm ent e por recept ores cont endo um a subunidade D em funcionam ent o. Port ant o, os dados do present e est udo, t am bém podem sugerir que o efeit o do m uscim ol no NPBL em relação ao apet it e ao sódio depende da subunidade D1 do recept or GABAA present e no NPBL.
Um est udo de Arak i et al. ( 1992) , invest igou a dist ribuição de diferent es subunidades dos recept or es GABAA no SNC at rav és de
hibridização in sit u e m ost rou que há diferent es padrões de ex pressão de subunidades D3 e D4 dos recept ores GABAA em algum as regiões do SNC.
No córt ex cer ebral, núcleo olfat ório ant erior, sept o lat eral, núcleos lat eral e m edial do com plex o am igdalóide, núcleos ant eriores do t álam o, sensoriais do t rigêm eo e núcleo coclear foram algum as das áreas est udadas para ident ificar a ex pressão m RNA das subunidades D3 e D4 de recept ores GABAA. Os result ados dest e est udo m ost raram que há um a
58
subunidade D3. Em regiões com o a cam ada granular do bulbo olfat ório, caudado- put am en, núcleos dorsom edial e vent rolat eral do t álam o e núcleos pont inos, o est udo m ost r ou u m a fort e ex pressão de m RNA das subunidades D4. No NPBL foi observ ada um a fort e ex pressão de m RNA da subunidade D3 e um a m oderada ex pressão da subunidade D4 ( ARAKI et
al. 1992) .
Os recept ores GABAC são com plex os prot éicos hom ooligom éricos
form ados ex clusiv am ent e por subunidades U, das quais exist em t rês. A ex pressão de recept ores GABAC é rest rit a a algum as est rut uras, em
cont rast e com a dist ribuição dos recept ores GABAA. At rav és da ut ilização
de reação da polim erase em cadeia via t ranscript ase rev ersa ( PCR) e hibridização in sit u est udos m ost raram que em rat os ex ist em t rês subunidades de recept ores GABAC sendo elas U1, U2 e U3, est ando
localizadas predom inant em ent e na ret ina ( CHEBI B et al., 1999; BORMANN, 2000) . No ent ant o, subunidades U t am bém são ex pressas em neurônios cent rais, incluindo o hipocam po ( ENZ et al., 1995; WEGELI US
et al., 1998; KI RI SCHUK et al., 2003) , a am ígdala ( DELANEY et al., 1999)
e t ronco cer ebral ( MI LLI GAN et al., 2004) , porém , não há evidências de que as subunidades U são ex pressas em neurônios do NPBL. Hav endo ou não difer enças na densidade das subunidades ρ de recept ores GABAC
exist ent es na ret ina e em out ras est rut uras do cérebro, com o no NPBL, a ex pressão da subunidade ρ1 parece ser necessária para form ar recept ores GABAC funcionais. Essa conclusão se deu a part ir de ex perim ent os que
foram realizados em células da ret ina e, port ant o, o efeit o inibit ório m ediado pela at iv ação de recept ores GABAC foi elim inado na ausência da
ex pressão da subunidade ρ1 ( MCCALL et al., 2002) .
Um est udo realizado por Vien et al. , ( 2002) classificou o TACA com o um agonist a parcial capaz de at uar sobre as subunidades U1 e U2 dos recept ores GABAC, além de descrev ê- lo com o sendo út il para a
dist inção ent re as subunidades U1, U2 e U3 de recept ores GABAC ( VI EN et
59
as subunidades D, e de recept ores GABAA, indicando que as
ρ-subunidades não fazem part e da fam ília de ρ-subunidades dos recept ores GABAA ( RAGOZZI NO et al., 1996, CHEBI B et al., 1998, HACKAM et al.,
1998, CHEBI B et al., 1999) . A subunidade ρ3 de recept ores GABAC, com o
t am bém as subunidades ρ1 e ρ2, t êm - se m ost rado insensív eis a bicuculina e aos m oduladores de recept ores GABAA ( VI EN et al., 2002) .
Além das subunidades ρ de recept ores GABAC não fazerem
com binações, t am bém não há co- localização com as subunidades dos recept ores GABAA ( KOULEN et al., 1998) . Os recept ores GABAC se
m ost raram insensív eis ao ant agonist a de recept ores GABAA bicuculina, e
ainda possuem alt a afinidade ao seu agonist a nat ural GABA. Os recept ores GABAC possuem caract eríst icas dist int as dos recept ores GABAA e GABAB,
pois, sua cinét ica de at iv ação e inat iv ação é lent a quando com p arada aos out ros recept ores GABAérgicos ( FEI GENSPAN et al., 1994a,b) .
De acordo com os result ados apresent ados, inj eções no NPBL bilat eral de TACA não prom ov eram alt erações n a ingest ão de água e NaCl 1,8% e t am bém não foram observ adas alt erações na Pressão Art erial Média ( PAM) e Frequência Cardíaca ( FC) . Diferent em ent e, de acordo com Callera et al., ( 2005) , inj eções no NPBL do agonist a GABAA, m uscim ol,
prom ov e aum ent o significat iv o na Pressão Art erial Média ( PAM) em anim ais saciados. Port ant o, t am bém podem os supor que os subt ipos de recept ores GABAC podem não est ar present es na região do núcleo
parabraquial onde foram feit as as inj eções de TACA.
No present e est udo, ut ilizou- se o m ais pot ent e agonist a do recept or GABAC ácido t rans- 4- am inocrot ônico ( TACA) , que at iv a os
recept ores GABAC de m aneira não- selet iv a. Est udos t êm dem onst rado que
esse agonist a pode at uar com o agonist a GABAA e GABAC ( WOODWARD et
al., 1993; BORMANN et al., 1995) . Além disso, TACA t am bém é eficaz nas
60
A ausência de efeit os de inj eções bilat erais no NPBL de TACA n a ingest ão de água e sódio 1,8% , Pressão Art erial Média ( PAM) e Freqüência Cardíaca ( FC) , além de inj eções bilat erais do ant agonist a dos recept ores GABAC ( ZAPA) na ingest ão de água e sódio 1,8% , sugere a possibilidade
de que os recept ores GABAC ou as su bunidades U1, U2 e U3 podem não
est ar ex pressas em neurônios do NPBL, ou que o recept or GABAC não est á
env olvido na m odulação da sede e do apet it e ao sódio. Ao nosso conhecim ent o, não exist em dados disponív eis na lit erat ura d a ex pressão das subunidades dos recept ores GABAC no NPBL de rat os. Est udos de
Milligan et al. ( 2004) , ut ilizando a t ranscrição rev ersa - PCR e hibridização in sit u m ost raram que a subunidade U1 é alt am ent e ex pressa em neurônios do t ronco encefálico.
Est udos a part ir de preparações in vit ro de lam preias, av aliaram o papel dos ant agonist as e agonist as dos recept ores GABA na at ividade respirat ória ( BONGI ANNI et al., 2006) . Os agonist as GABAA e GABAB
prom ov eram a dim inuição da at ividade respirat ória e o agonist a do recept or GABAC não m odificou o padrão respirat ório ( BONGI ANNI et al.,
2006) . Os Result ados apresent ados nest e est udo são sem elhant es ao m ost rado acim a, um a v ez que, inj eções no NPBL de TACA e ZAPA sulphat e, agonist a não- selet iv o e ant agonist a dos recept ores GABAC,
respect iv am ent e, t am bém não prom ov eram alt erações na PAM e na ingest ão de água e sódio 1,8% em anim ais t rat ados com FURO+ CAP, diferent e de inj eções do m uscim ol .
Os result ados dest e est udo, perm it e sugerir que o TACA não est á agindo no recept or GABAA porque inj eções de diferent es doses de TACA no
NPBL não produziram alt erações na ingest ão de água e sódio, diferent em ent e do m uscim ol, um agonist a clássico do recept or GABAA,
61
no cont role da ingest ão de água e de sódio, ou ainda que a subunidade U pode represent ar um a população m uit o pequena nos neurônios do NPBL.
Port ant o, os result ados apresent ados nest e est udo e ant eriores ( Callera et al., 2005; De Oliv eira et al., 2007, 2011) , m ost ram que a at iv ação dos recept ores GABAA e GABAB, m as não GABAC no NPBL facilit a
a ingest ão de NaCl hipert ônico e água em rat os deplet ados de sódio. Nov os est udos dev em ser realizados, incluindo ex peri m ent os com a subst ância cis- 4- am inocrot onic acid ( CACA) , um agonist a do recept or GABAC, sendo m enos pot ent e, porém m ais selet iv o para os recept ores
GABAC.
63
6 CON CLU SÃO
• A at iv ação de recept ores GABAA no NPBL de rat os pr om ov e o
aum ent o na ingest ão de água e sódio hipert ônico em rat os prev iam ent e t rat ados com FURO+ CAP.
• I nj eções bilat erais de agonist a e ant agonist a GABAC, TACA e ZAPA
sulphat e, respect iv am ent e, não prom ov em alt erações na ingest ão de água e NaCl hipert ônico em rat os prev iam ent e t rat ados com FURO+ CAP.
65
REFERÊN CI AS BI BLI OGRÁFI CAS
AKAI KE N, HATTORI K, OOMURA Y, CARPENTER DO. Bicuculline and picrot oxin block gam m a- am inobut ryic- acid gat ed cl- conduct ance by different m echanism s. Ex perient ia. 1985; 41( 1) : 7 0- 1.
ANDRADE CAF, DE LUCA Jr LA, COLOMBARI DSA, MENANI JV. Alpha( 2) -adrenergic act iv at ion in t he lat eral parabrachial nucleus induces NaCi int ake under condit ions of sy st em ic hyperosm olarit y . Neuroscience. 2006 Sep; 142( 1) : 21- 8
ARAKI T, TOHYAMA M. Region- specific ex pression of gaba- a recept or alpha- 3 and alpha- 4 subunit s m essenger - rnas in t he rat - brain. Molecular Brain Research. 1992; 12( 4) : 293 - 314.
BI LLI NTON A, STEAN TO, BOWERY NG, UPTON N. GABA( B( 1) ) splice v ariant m RNAs are different ially affect ed by el ect roshock induced seizure in rat s. Neuroreport . 2000; 11( 17) : 3817 - 22.
BONGI ANNI F, MUTOLO D, NARDONE F, PANTALEO T. GABAer gic and gly cinergic inhibit ory m echanism s in t he lam prey respirat ory cont rol. Brain Research. 2006; 1090: 134 - 45.
BORMANN, J. The 'ABC' of GABA recept ors. Trends in Phar m acological
Sciences, v . 21, n. 1, p. 16- 19, 2000.
BORMANN J, FEI GENSPAN, A. GABA( C) RECEPTORS. Trends in
Neurosciences, v . 18, n. 12, p. 515 - 519, 1995.
BORMANN J, FEI GENSPAN, A. Select ive agonist s for GABA( C) recept ors - Reply . Trends in Neurosciences, v . 19, n. 5, p. 190- 190, 1996.
BOWERY N. Gabab recept ors and t heir significance in m am m alian pharm acology . Trends in Phar m acological Sciences, v . 10, n. 10, p. 401 -407, 1989.
66
nucleus induces w at er and hy pert onic NaCl int ake. Neuroscience. 2005; 134( 3) : 725 - 35.
CALVER AR, MEDHURST AD, ROBBI NS MJ, CHARLES KJ, EVANS ML, HARRI SON DC, STAMMERS M, HUGHES SA, HERVI EU G, COUVE A, MOSS SJ, MI DDLEMI SS DN, PANGALOS MN. The ex pression of GABA ( B1) and GABA ( B2) recept or subunit s in t he CNS differs from t hat in peripheral t issues. 2000; Neuroscience 100, 155- 170.
CHEBI B M. JOHNSTON GAR. The 'ABC' of GABA recept ors: A brief review .
Clinical and Ex perim ent al Pharm acology and Phy siology , v . 26, n. 11, p.
937- 940, 1999.
CHEBI B M, MEWETT KN, JOHNSTON GAR. GABA( c) recept or ant agonist s different iat e bet w een hum an p1 and p2 recept ors ex pressed in Xenopu s oocy t es. European Journal of Pharm acology . 1998; 357( 2 - 3) : 227- 34.
CHRI STI E MJ, NORTH RA. Agonist s at m u - opioid, m - 2- m uscarinic and gabab- recept ors increase t he sam e pot assium conduct ance in rat lat eral parabrachial neurons. Brit ish Journal of Pharm acology , v . 95, n. 3, p. 896 -902, 1988.
CI RI ELLO J, LAWRENCE D, PI TTMAN QJ. Elect rophy siological ident ificat ion of neurons in t he parabrachial nucleus proj ect ing direct ly t o t he hy pot halam us in t he rat . Brain Research. 1984; 322( 2) : 388 - 92.
COLOMBARI DSA, MENANI JV, JOHNSON AK. Forebrain angiot ensin t y pe 1 recept ors and parabrachial ser ot onin in t he cont rol of NaCl and w at er int ake. Am erican Journal of Phy siology - Regulat ory I nt egrat iv e and
Com parat iv e Phy siology , v . 271, n. 6, p. R1470 - R1476, 1996.
DE GOBBI JI , DE LUCA LA, MENANI JV. Serot onergic m echanism s of t he lat eral parabrachial nucleu s on DOCA- induced sodium int ak e. Brain Res, v . 880, n. 1- 2, p. 131- 8, Oct 2000.
DE GOBBI JI F, DE LUCA LA, JOHNSON AK, MENANI JV. I nt eract ion of serot onin and cholecy st okinin in t he lat eral parabrachial nucleus t o cont rol sodium int ak e. Am J Phy siol Regul I nt egr Com p Phy siol. 2001 May ; 280( 5) : R1301- 7.
67
DE OLI VEI RA LB, DE LUCA Jr LA, COLOMBARI DSA, COLOMBARI E, CALLERA JC, MENANI JV. Treat m ent wit h serot onergic 5HT( 2A/ 2C) agonist inhibit s NaCl int ak e induced by gabaergic act iv at ion of t he lat eral parabrachial nucleus. Faseb Journal. 2005; 19( 5) : A1649 - A.
DE OLI VEI RA LB, CALLERA JC, DE LUCA LA, COLOMBARI DSA, MENANI JV. GABAergic m echanism s of t he lat eral parabrachial nucleus on sodium appet it e. Brain Research Bullet in. 2007 Jul; 73( 4 - 6) : 238- 47.
DE OLI VEI RA LB, KI MURA EH, CALLERA JC, DE LUCA LA, COLOMBARI DSA, MENANI JV. Baclofen int o t he lat eral parabrachial nucleus induces hy pert onic sodium chloride and sucrose int ak e in rat s. Neuroscience, v . 183, p. 160- 170, 2011.
DELANEY AJ, SAH P. GABA recept ors inhibit ed by benzodiazepines m ediat e fast inhibit ory t ransm ission in t he cent ral am y gdala. Journal of
Neuroscience, v . 19, n. 22, p. 9698- 9704, 1999.
DENTON D. The hunger for salt : an ant hropological, phy siological and m edical analy sis, 2 nd Edit ion , Springer, Berlin. 1984
ENZ R, BRANDSTATTER JH, HARTVEI T E, WASSLE H, BORMANN J. Ex pression of gaba recept or rho- 1 and rho- 2 subunit s in t he ret ina and brain of t he rat . European Journal of Neuroscience. 1995; 7( 7) : 1495 - 501.
ENZ R, CUTTI NG, GR. Molecular com posit ion of GABA( C) recept ors. Vision
Resear ch [ S.I .] , v . 38, n. 10, p. 1431 - 1441, 1998.
FEI GENSPAN A, BORMANN J. different ial pharm acology of gaga( a) and gaba( c) recept ors on rat ret inal bipolar cells. European Journal of
Pharm acology - Molecular Pharm acology Sect ion , v . 288, n. 1, p. 97 - 104,
1994a.
FEI GENSPAN A, BORMANN J. Modulat ion of gaba( c) recept ors in rat ret inal bipolar cells by prot ein - kinase- c. Journal of Phy siology - London, v . 481, n. 2, p. 325- 330, 1994b.
FEI GENSPAN A, BORMANN J. GABA- gat ed Cl- channels in t he rat ret ina.
68
FEI GENSPAN A, WASSLE H, BORMANN J. Pharm acology of gaba recept or cl- channels in rat ret inal bipolar cells. Nat ure. 1993; 361( 6408) : 159 - 62.
FI TZSI MONS JT. Angiot ensin, t hirst , and sodium appet it e ( v ol 78, pg 583, 1998) . Phy siological Rev iew s, v . 79, n. 2, p. U4 - U4, 1999.
FRI TSCHY JM, MESKENAI TE V, WEI NMANN O, HONER M, BENKE D, MOHLER H. GABA( B) - recept or splice v ariant s GB1a and GB1b in rat brain: dev elopm ent al regulat ion, cellular dist ribut ion and ext rasy napt ic localizat ion. European Journal of Neuroscience. 1999; 11( 3) : 761 - 8.
FULWI LER CE, SAPER CB. Subnuclear organizat ion of t he efferent connect ions of t he parabrachial nucleus in t he rat . Brain Research
Rev iew s, v . 7, n. 3, p. 229 - 259, 1984.
GARRETT EM, HADI NGHAM KL, WHI TI NG PJ. Sequence and organisat ion of t he m ouse GABA- A epsilon gene. European Journal of Neuroscience. v . 12, 400- 400, 2000.
GUSTI NCI CH S, FEI GENSPAN A, SI EGHART W, RAVI OLA E. Com posit ion of t he GABA( A) recept ors of ret inal dopam inergic neurons. Journal of Neuroscience. 1999; 19( 18) : 7812 - 22.
GUTHMANN A, FRI TSCHY JM, OTTERSEN OP, TORP R, HERBERT H. GABA, GABA t ransport ers, GABA( A) recept or subunit s, and GAD m RNAs in t he rat parabrachial and Kollik er - Fuse nuclei. Journal of Com parat iv e Neurology . 1998; 400( 2) : 229 - 43.
HACKAM AS, WANG TL, GUGGI NO WB, CUTTI NG GR. Sequences in t he am ino t erm ini of GABA rho and GABA( A) subunit s specify t heir select iv e int eract ion in vit ro. Journal of Neurochem ist ry . 1998; 70( 1) : 40 - 6.
HERBERT H, MOGA MM, SAPER CB. Connect ions of t he parabrachial nucleus wit h t he nucleus of t he solit ary t ract and t he m edullary ret icular form at ion in t he rat . Journal of Com parat iv e Neurology . 1990; 293( 4) : 540 -80.
69
JOHNSON AK, EDWARDS GL. The neuroendocrinology of t hirst : afferent signaling and m echanism s of cent ral int egrat ion. I n: GANTEN, D. Current t opics in neuroendocrinology , behavioral aspect s of neuroend ocrinology . Heidelberg: Springer - Verlag, p. 149- 190, 1990.
JOHNSTON GA, CHEBI B M, HANRAHAN JR, MEWETT KN. GABA( C) recept ors as drug t arget s. Curr Drug Target s CNS Neurol Disord. 2003 Aug; 2( 4) : 260- 8.
KI MURA EH, OLI VEI RA LB, COLOMBARI DSA, DE LUCA LA, MENANI JV, CALLERA JC. Sodium int ak e by hy perosm ot ic rat s t reat ed wit h a GABA( A) recept or agonist int o t he lat eral parabrachial nucleus. Brain Research. 2008 Jan; 1190: 86 - 93.
KI RI SCHUK S, AKYELI J, I OSUB R, GRANTYN R. Pre- and post sy napt ic cont ribut ion of GABA( C) recept ors t o GABAergic sy napt ic t ransm ission in rat collicular slices and cult ures. European Journal of Neuroscience. 2003; 18( 4) : 752- 8.
KOBASHI M, BRADLEY RM. Differences in t he int rinsic m em brane charact erist ics of parabrachial nu cleus neurons processing gust at ory and visceral inform at ion. Brain Research. 781( 1 - 2) : 218- 26, 1998a.
KOBASHI M, BRADLEY RM. Effect s of GABA on neurons of t he gust at ory and visceral zones of t he parabrachial nucleus in rat s. Brain Research. 799( 2) : 323- 8, 1998b
KOULEN P, BRANDSTATTER JH, ENZ R, BORMANN J, WASSLE H. Sy napt ic clust ering of GABA( C) recept or rho- subunit s in t he rat ret ina. European Journal of Neuroscience. 1998; 10( 1) : 115 - 27.
KUSAMA T, WANG TL, GUGGI NO WB, CUTTI NG GR, UHL GR. Gaba rho- 2 recept or pharm acological profile - gaba recognit ion sit e sim ilarit ies t o rho-1. European Journal of Pharm acology - Molecular Pharm acology Sect ion. 1993; 245( 1) : 83- 4.
