Efeito antibacteriano in vitro das soluções Tetraclean, MTAD e modificações: teste de contato direto e ação sobre o biofilme

E

FEITO

A

NTIBACTERIANO

IN

VITRO

DAS

S

OLUÇÕES

T

ETRACLEAN

,

MTAD

E

M

ODIFICAÇÕES

: T

ESTE DE

C

ONTATO

D

IRETO E

A

ÇÃO SOBRE O

B

IOFILME

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Odontologia – Área de Endodontia, da Faculdade de Odontologia de Araraquara, Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", para a obtenção do título de Doutor em Endodontia.

Orientador: Prof. Dr. Mario Roberto Leonardo

Co-orientador: Prof. Dr. Markus Haapasalo

ARARAQUARA 2008

150 f. ; 30 cm.

Tese (Doutorado) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Odontologia

Orientador : Prof. Dr. Mario Roberto Leonardo Co-orientador: Prof. Dr. Markus Haapasalo

1. Irrigantes do canal radicular 2. Biofilmes 3. Produtos com ação antimicrobiana. I. Título

TETRACLEAN®, MTAD® E MODIFICAÇÕES: TESTE DE CONTATO DIRETO E AÇÃO SOBRE O BIOFILME

COMISSÃO JULGADORA

TESE PARA OBTENÇÃO DO TÍTULO DE DOUTOR EM ENDODONTIA

Presidente e Orientador: Prof. Dr. Mario Roberto Leonardo 2º Examinador: Prof. Dr. Mario Tanomaru Filho

3º Examinador: Prof. Dr Idomeo Bonetti Filho 4º Examinador: Profa_{. Dr}a_{. Izabel Yoko Ito}

5º Examinador: Prof. Dr. Antonio Carlos Pizzolitto

Fernanda Geraldes Pappen

NASCIMENTO 20 DE JUNHO DE 1978 – Pelotas/RS

FILIAÇÃO Ary Fernando Pappen

Maria Lúcia Geraldes Pappen

1997/2000 Curso de Graduação

Faculdade de Odontologia da Universidade Federal de Pelotas UFPel

2001 Curso de Especialização em Endodontia

Faculdade de Odontologia da Universidade Federal de Pelotas UFPel

2000-2001 Professora Substituta das Disciplinas de Patologia I e II da Faculdade de Odontologia da Universidade Federal de Pelotas UFPel

2002/2004 Curso de Pós-graduação em Endodontia, nível de Mestrado Faculdade de Odontologia de Araraquara – UNESP

2004-2005 Professora Substituta da Disciplina de Endodontia da Faculdade de Odontologia da Universidade Federal de Pelotas – UFPel

Juntos, fazem da nossa família o lugar para onde sempre se quer voltar. Obrigada pelo amor e carinho de vocês.

ao meu lado planejando, suportando e sonhando também os meus sonhos, muitas vezes abrindo mão dos seus. Obrigada por tua dedicação, pela tua alegria em cada pequena coisa que dá certo, pela paciência nos momentos mais difíceis, e pela maneira tranqüila de tomar conta de mim. Teu incentivo diário foi essencial para que este trabalho chegasse ao fim.

toda a confiança em mim sempre depositada. Seu amor e fidelidade à Endodontia Biológica o tornam um ícone reconhecido por todos. Minha admiração por sua dedicação e suas contribuições à Endodontia, me fazem sua discípula, com o compromisso de onde quer que eu vá, defender suas idéias. Obrigada por tudo.

Ao Prof. Dr. Markus Haapasalo

incentivou e se mostrou ao meu lado lutando pelo meu crescimento. Graças a ti, realizei o sonho do Doutorado Sanduíche. Obrigada pelo teu desprendimento sempre que precisei da tua ajuda (e foram muitas as vezes!), por acreditar em mim, por me proporcionar momentos de muita alegria, e por transmitir conhecimentos com tanto entusiasmo.

Ao Prof. Dr. Mario Tanomaru Filho e à Profª. Drª. Juliane

Tanomaru

Com seu exemplo de amor e de dedicação à pesquisa, vocês são os responsáveis pelo meu gosto e minha escolha pela pesquisa biológica. Obrigada pela orientação sempre sensata e presente durante o curso de Mestrado e pelo apoio durante toda a Pós-Graduação.

À Profª. Drª. Lea Assed Bezerra da Silva

Pela dedicação à Odontologia, pelas sugestões durante o curso de Doutorado, e por sua importante contribuição para a pesquisa endodôntica.

À Profª. Drª. Izabel Yoko Ito

Ao

Prof. Dr. Idomeo Bonetti Filho

Ao

Prof. Dr. Fábio Luiz Berbert

Aos queridos

Marissa e Gethin Owen

À

Dr

Ya Shen

À

Dr

Hui Zhang

À

D. Adair

e ao

Sr. Antônio Segura

Aos queridos

Renata, Carlinhos, Alexandre, Marina,

D. Alda, João Pedro e João Víto

Ao

Prof. Dr. Luiz Fernando Machado Silveira

Souza, Gustavo Sivieri, Henrique Somenzari (in memorian),

Maurício Aguirre, Jose Carlos Rivas, Renata Hussne,

Renato Palo, Ronaldo Ferreira, Fernando Crisci, Marco

Aurélio Borges e Regina Pontes Lima.

Aos amigos

Christian Sperantia, Andre Wong,

Karen

Mak,

Jensen

Wong,

Ameneh

Eslami,

Mari

Leppilampi, e Neda Tabatabaee

sua maneira, vocês preencheram nossa casa de alegrias, cumplicidade e tranqüilidade para enfrentar o dia-a-dia. Saudades de vocês.

Aos queridos amigos que fiz em Vancouver,

Amy

Greenberg, Mitchell Surkis, Julia Werner, Fritz Fischer,

Aos meus queridos tios,

Tia Ana, Tio Cláudio, Dinda

Lídia e Tio Juca

,

Ao

Oral Health Institute – University of British

Columbia

À Faculdade de Odontologia de Araraquara, UNESP, na pessoa de seu diretor

Prof. Dr. José Cláudio Martins Segalla

Aos Professores e amigos da

Faculdade de

Àos funcionários da Seção de Pós-Graduação da Faculdade de Odontologia de Araraquara – UNESP

,

Mara Amaral, José

Alexandre Garcia, Rosangela Aparecida Silva dos Santos,

Flavia Sousa de Jesus

Aos funcionários da Biblioteca da Faculdade de Odontologia de Araraquara – UNESP, em especial à

Ceres Maria Carvalho

Galvão de Freitas e Maria Helena Matsumoto Komasti

Leves

Aos professores do

Programa de Pós-graduação em

Endodontia

,

Resumo... 17

Abstract... 19

1 INTRODUÇÃO... 21

2 REVISÃO DA LITERATURA... 28

3 PROPOSIÇÃO... 65

4 MATERIAL E MÉTODOS... 67

5 RESULTADO... 85

6 DISCUSSÃO... 103

7 CONCLUSÃO... 124

8 REFERÊNCIAS... 126

Resumo

O objetivo deste estudo foi avaliar a atividade antibacteriana das soluções Tetraclean®_,MTAD®_{e modificações desta formulaçãosobre uma cepa de}

Enterococcus faecalis pelo teste de contato direto e frente ao biofilme. Na metodologia de contato direto, uma suspensão de E. faecalis foi exposta às soluções irrigadoras, por períodos de 30 s, 1, 3 e 10 min, e um agente neutralizante foi utilizado. As colônias viáveis foram quantificadas após diluições seriadas e cultura em placas de ágar. Para determinação do número inicial de UFC, água esterilizada foi usada como controle. Para o crescimento do biofilme, amostras de biofilme dentário foram suspensas em BHI (Brain Heart Infusion), e incubadas por 14 dias em anaerobiose, tendo como substrato, discos de hidroxiapatita. Após o período de incubação, os biofilmes foram expostos às soluções irrigadoras por períodos de 30 s, 1 e 3 min. Os biofilmes corados com oLive/Dead Baclight stain(Molecular Probes, Europe BV), que diferencia células viáveis (verde) e células não-viáveis (vermelho) foram observados na microscopia confocal. As imagens do biofilme obtidas pelo software EZ-C1 for Nikon foram transferidas para análise quantitativa da proporção de células viáveis sobre o total de células do biofilme para o software Imaris 5.0. No teste de contato direto, o Tetraclean®_{eliminou completamente o E. faecalis em 30 s,}

enquanto o MTAD® _{e o MTAD}® _{+ CTR 0,01% eliminaram após 10 min, e o}

MTAD®_{+ CTR 0,1% resultou em culturas negativas após 3 min de contato com a}

suspensão bacteriana. Quando removido oTween 80 do MTAD®_{, e acrescida a}

CTR 0,01%, obteve-se culturas negativas após 1 minuto. Os resultados obtidos pelo método de exposição ao biofilme confirmaram os achados do teste de contato direto. A análise estatística pelo método de Kruskal-Wallis demonstrou que o tempo de exposição aos irrigantes foi significante na redução das bactérias viáveis do biofilme (P<0,001). Houve também diferença significante entre os grupos experimentais (P<0,001). A solução MTAC (CTR 0,1%) foi a mais efetiva, matando cerca de 75% das células bacterianas presentes no biofilme em 3 minutos, seguida do MTAC (CTR 0,01%) e do Tetraclean®_{. As}

soluções MTAD®_{, e MTAD}®_{+ CTR 0,01% e 0,1% apresentaram menor potencial}

antibacteriano deixando viáveis mais de 52% das células do biofilme após os experimentos. É possível concluir que as soluções contendo cetramida em sua formulação apresentaram melhor efeito antibacteriano sobre o E. faecalis e sobre o biofilme.

Abstract

The aim of this study was to evaluate the antibacterial effect of MTAD® _{and Tetraclean}®_{. The tests were performed on Enterococcus faecalis}

using the direct exposure test and an in vitro biofilm model. Alternative formulations to MTAD®_{were also included in the experiments: MTAD}® _{+ 0.01%}

cetrimide (CTR); MTAD® _{+ 0.1% CTR; MTAC (the detergent Tween 80 was}

substituted for cetrimide) with 0.01% CTR and MTAC (0.1% CTR). In the direct exposure test, a bacterial suspension was mixed with the irrigation solutions. After 30 seconds, 1 minute, 3 minutes and 10 minutes, an inactivator agent was used. The number or viable colonies were calculated after serial 10-fold dilutions and culture in agar plates. To calculate the initial number of colonies, sterilized water was used as a control. Dental biofilm samples were suspended in BHI broth and incubated in anaerobic conditions in hidroxiapatite discs. After incubation for 14 days, the biofilms were exposed to the irrigation solutions for 30 seconds, 1 minute and 3 minutes. Live/Dead Baclight stain (Molecular Probes, Europe BV) was used to diferentiate viable cells (Green) and non viable cells (Red). The samples were observed in the Confocal Laser Microscope. The biofilm images in 3D obtained in the EZ-C1for Nikon softwarewere transfered to quantitative analysis in the Imaris 5.0 software. The software calculated the ratio of green cells. In the direct exposure test, Tetraclean® _{and MTAC (0.1% CTR)}

erradicatedE. faecalisin 30 s. MTAD®_{and MTAD}®_{+ 0.01% CTR eliminated E.}

faecalisafter 10 min. MTAD®_{+ 0.1% CTR resulted in negative culture after 3 min.}

Negative cultures were obtained after 1 min when MTAC (0.01% CTR) was used. The findings from the biofilm exposure method confirmed the results from direct exposure test. The Kruskal-Wallis statistical analysis showed a significant difference in time exposure to irrigant (P<0.001). There was also significant difference between the irrigation solutions (P<0.001). MTAC (0.1% CTR) showed the best performance, since it killed around 75% of bacteria organized in biofilm after 3 min, followed by MTAC (0.01% CTR) and Tetraclean®_{. MTAD}®_{, and}

MTAD®_{+ 0,01% or 0.1% CTR demonstrated the lower antibacterial activity, and}

permited more than 52% of bactéria to be viable after the biofilm experiments. In conclusion, solutions containing cetrimide presented better antimicrobial effect on E. faecalisand on biofilms.

1 Introdução

A presença de microrganismos seus produtos e subprodutos no tecido pulpar provindos de lesões de cárie ou por meio de infiltração em materiais restauradores ainda é o maior fator causador das alterações pulpares e periapicais, mesmo sendo possível a agressão e até mesmo a necrose pulpar também por agentes físicos e químicos. A reação imunopatológica pulpar em resposta a esta irritação bacteriana se inicia antes mesmo dos microrganismos adentrarem a polpa, quando os antígenos bacterianos interagem com o sistema imunológico10,61,103_.

Quando o processo carioso progride e a barreira de tecido mineralizado é ultrapassada pelos microrganismos, estes invadem o tecido pulpar e a infecção passa a se concentrar na porção mais superficial da polpa. Nestes casos, o âmago do tecido pulpar continua apresentando vitalidade e esterilidade. O tratamento das afecções pulpares nessa situação, ou biopulpectomia, é considerado o tratamento de um tecido inflamado, e tem como objetivo a manutenção da vitalidade e prevenção da infecção dos tecidos remanescentes.

reação inflamatória periapical, causada em resposta à presença dos microrganismos, seus produtos e subprodutos no canal radicular. Nos casos de gangrena pulpar e lesão periapical, o tratamento endodôntico tem como objetivo a eliminação da infecção endodôntica e a reparação dos tecidos periapicais. Diversos autores concordam que menores índices de sucesso da terapia endodôntica são alcançados quando microrganismos viáveis ainda estão presentes no sistema de canais radiculares no momento da obturação, e que a chave para a reparação dos tecidos periapicais reside na eliminação dos fatores irritantes19,64,95,139_.

Diferentemente dos demais tecidos do organismo humano, a eliminação da infecção presente no sistema de canais radiculares não se dá unicamente pela ação do sistema imunológico e de antibióticos administrados por via sistêmica. Devido às características anatômicas e fisiológicas complexas do elemento dentário e do sistema de canais radiculares, a erradicação da infecção endodôntica requer intervenção no local da infecção, além da resposta imune do hospedeiro e em alguns casos terapia antibiótica sistêmica. Desta forma, para que o intento de controle da infecção do sistema de canais radiculares seja alcançado, é necessária a realização de uma seqüência de intervenções como a instrumentação, irrigação com soluções anti-sépticas, uso de curativo de demora, obturação tridimensional e selamento coronário53,78,76,77,133,134_.

A composição e a localização da microbiota presente no sistema de canais radiculares com gangrena pulpar depende de vários fatores como a presença de oxigênio, disponibilidade de nutrientes, relações sinérgicas e competitivas entre as diferentes espécies envolvidas e do sistema imunológico do hospedeiro. Nos casos de nítida lesão periapical, com infecção endodôntica primária, sabe-se que existe o predomínio de microrganismos anaeróbios Gram-negativos1,3,41,147,146 _e

spp.9,41,138,147,146. No entanto, em casos de infecção endodôntica secundária ou persistente, o ambiente promove a alteração de toda a microbiota, e o predomínio passa a ser de microrganismos facultativos. O Enterococcus faecalisé a espécie mais freqüentemente isolada em canais radiculares de dentes com lesão periapical persistente, em culturas mistas ou em monoculturas, apesar de ser raramente encontrado em casos de infecção endodôntica primária 55,85,105,106,108,119,138_{. A dificuldade de}

eliminar o E. faecalis dos canais radiculares pode estar relacionada com sua grande capacidade de penetração nos túbulos dentinários além da sua maior resistência à ação de soluções e medicamentos que os demais microrganismos presentes nas infecções endodônticas17,51,80,99,115,162. Por conseguinte, o E. faecalis se tornou o microrganismo mais apropriado para realização de testes antimicrobianos in vitro de diferentes soluções irrigadoras, medicamentos e cimentos obturadores utilizados em endodontia27,36,110_.

A maioria das bactérias cresce na forma de biofilme. Os microrganismos organizados em comunidades apresentam maior proteção contra outras espécies de microrganismos competitivos, contra o sistema imunológico do hospedeiro e contra substancias tóxicas às bactérias como anti-sépticos e antibióticos. Os biofilmes também facilitam a absorção e a troca de nutrientes entre espécies, a remoção de produtos metabólicos potencialmente tóxicos assim como o desenvolvimento de um ambiente físico-químico apropriado, onde o potencial de oxidação e redução é mais favorável às células bacterianas142_.

dos tecidos periapicais. Além disso, bactérias organizadas em comunidades se comunicam entre si por meio de um mecanismo denominado quorum sensing. Este mecanismo de comunicação entre bactérias interfere na estrutura do biofilme uma vez que estimula o crescimento de espécies benéficas ao biofilme e dificulta o crescimento de outras espécies competitivas. Além disso, algumas propriedades fisiológicas das células bacterianas podem ser alteradas pelo quorum sensing. A expressão dos genes para a resistência a antibióticos, por exemplo, pode promover a proteção de toda a comunidade bacteriana, e estima-se que a resistência do biofilme aos antibióticos seja de 1000 a 1500 vezes maior que das bactérias na forma planctônica142,145.

Em dentes com necrose pulpar e nítida lesão periapical, o biofilme pode estar presente não só nas paredes dentinárias do sistema de canais radiculares86,92,124,150 _{mas também na porção externa da raiz,}

aderida à superfície radicular, em áreas de reabsorção cementária e dentinária79,93,159_{, e sua erradicação certamente representa um dos}

grandes desafios do tratamento endodôntico. Alguns estudos têm demonstrado a maior resistência de biofilmes orais à clorexidina, amoxycilina, doxiciclina e metronidazol quando comparados a bactérias na forma planctônica38,75,123,130,170.

É sabido que o preparo biomecânico, por meio da instrumentação e da irrigação com uso de soluções bactericidas para desinfecção, não é capaz de promover a total eliminação da infecção do sistema de canais radiculares15-17_{. Alguns autores têm demonstrado que}

após o preparo biomecânico, com instrumentação e irrigação dos canais radiculares, ocorre apenas a redução no número de microrganismos, mas não a completa desinfecção destes tecidos93,104_{. Assim, grupos de}

conseqüentemente permitam o tratamento dos canais radiculares destes casos em uma única sessão e maiores índices de sucesso sejam alcançados.

Torabinejad et al.158_{(2003) introduziu no mercado o BioPure}

MTAD® (Mixture of Tetracycline isomer, an Acid, and a Detergent, Dentsply Tulsa Dental, Tulsa OK, EUA), uma solução que contém em sua composição doxiciclina a 3%, ácido cítrico a 4,25% e um detergente, o Tween 80. Segundo orientações do fabricante, o BioPure MTAD® _deve

ser utilizado para irrigação dos canais radiculares, após o uso da solução de hipoclorito de sódio durante o preparo biomecânico. Estudos têm demonstrado a capacidade do MTAD® _{em remover a camada residual}

com o mínimo de alterações erosivas na superfície dentinária8,157. Além disso, de acordo com alguns autores, quando usado em conjunto com a solução de hipoclorito de sódio a 1,3%, o MTAD® _{tem apresentado}

superior atividade antimicrobiana quando comparado à solução de hipoclorito de sódio a 5,25% e o EDTA a 17%129,127,156_{. No entanto, alguns}

autores comprovaram que o MTAD® apresenta ação antifúngica deficiente122_{, incapacidade de eliminação do biofilme bacteriano}21,35_{, e}

pode provocar alteração de cor no tecido dentinário152_.

Semelhante ao MTAD®_{, o Tetraclean}® _{(Ogna Laboratori}

Farmaceutici, Milão, Itália) contém em sua formulação doxiciclina, porém em concentração mais baixa, a 1%, e ácido cítrico a 10%. O Tetraclean®

tem como veículo o polipropilenoglicol e como detergente, a cetramida a 0,2% o que diferencia suas propriedades daquelas apresentadas pelo MTAD®_{. A ação antimicrobiana da cetramida, um agente}

amônio-quartenário, também conhecido como brometo de hexadeciltrimetilamônio (CTAB) e altamente alcalino49_{, tem sido descrita em diversos}

estudos12,13,73,83,140_{. Adicionalmente, Portenier et al.}111 ₍₂₀₀₆₎

quando combinada à cetramida a 0,1%, possivelmente graças ao efeito sinérgico dos dois produtos.

O detergente Tween 80, utilizado na formulação do MTAD®_,

diferentemente da cetramida, apresenta atividade antimicrobiana limitada, mas parece aumentar o efeito antimicrobiano de algumas substâncias72. Todavia, o Tween 80 também é um potente neutralizador da ação antimicrobiana de agentes como a clorexidina e a iodopovidona63,131.

Vários antibióticos como a penicilina, a bacitracina e a estreptomicina foram utilizados no passado para a desinfecção dos canais radiculares48_{. Seu emprego, contudo, tem sido bastante limitado uma vez}

que estes antibióticos não apresentam amplo espectro e não são eficazes contra a microbiota endodôntica. As tetraciclinas, incluindo a doxiciclina, apresentam amplo espectro e ação bacteriostática inibindo a síntese protéica bacteriana devido ao rompimento do RNA transferase e RNA mensageiro nos ribossomos107_{. As tetraciclinas têm ainda a capacidade}

de adsorção ao tecido dentinário e substantividade5,6,168. Além do efeito antimicrobiano das tetraciclinas, outras propriedades podem ser citadas como o baixo pH que atribui a estas substâncias a característica de quelante do cálcio, com capacidade de desmineralização das paredes de dentina. Esta ação quelante pode inclusive ser comparada à ação do ácido cítrico7,56,168.

2 Revisão da Literatura

2.1 MTAD® _{e Tetraclean}® _{– Soluções Coadjuvantes do Preparo} Biomecânico dos Canais Radiculares

Em 2003, Torabinejad et al.158 relataram pela primeira vez na literatura o uso de uma solução que consiste na mistura de um isômero da tetraciclina, um ácido e um detergente, o BioPure MTAD® _{(Mixture of}

Tetracycline isomer, an Acid, and a Detergent, Dentsply Tulsa Dental, Tulsa, OK, EUA), cujo objetivo é a remoção da camada residual após a instrumentação, graças ao ácido cítrico a 4,25% em sua formulação, e ao mesmo tempo a desinfecção do sistema de canais radiculares, função atribuída à doxiciclina a 3%.

O Tetraclean® _{(Ogna Laboratori Farmaceutici, Milão, Itália)}

apresenta formulação semelhante ao MTAD®. Idealizado por Giardino e cols., foi patenteado em 2004 e segundo informações do fabricante deve chegar ao mercado em 2008. Contém também em sua formulação o ácido cítrico e a doxiciclina, porém em diferentes concentrações que as apreentadas na composição do MTAD®_{. O detergente utilizado no}

Tetraclean® é a cetramida a 0,2% no lugar do Tween 80, presente na formulação do MTAD®_{. Outra diferença apresentada pelo Tetraclean}®_{é o}

uso do polipropileno glicol como veículo.

O primeiro estudo avaliando o MTAD®_{foi publicado em 2003}

paredes dentinárias nos três terços dos canais radiculares por meio de Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV). Os dentes foram divididos em quatro grupos, segundo o protocolo de irrigação utilizado: água destilada (controle positivo), hipoclorito de sódio a 5,25%, hipoclorito de sódio 5,25% e irrigação final com EDTA a 17%, e hipoclorito de sódio a 5,25% e irrigação final com MTAD®. Os resultados demonstraram que o MTAD® removeu de forma eficaz a camada residual, sem modificar significativamente a estrutura dos túbulos dentinários. Os túbulos dentinários, neste estudo, sofreram maior erosão quando o EDTA foi utilizado por 5 minutos nos canais radiculares.

O efeito de várias concentrações de hipoclorito de sódio para irrigação dos canais radiculares em conjunto com irrigação final com MTAD® _{também foi avaliado em 2003 por Torabinejad et al.}157 _Oitenta

dentes extraídos foram divididos em nove grupos: grupo 1, irrigação com água destilada; grupo 2, irrigação com hipoclorito de sódio a 5,25% e irrigação final com EDTA a 17%; grupo 3, irrigação com hipoclorito de sódio a 5,25%, grupo 4, irrigação com água destilada e irrigação final com MTAD®_{, grupo 5, irrigação com MTAD}® _{durante todo o preparo}

biomecânico, grupo 6 irrigação com hipoclorito de sódio a 0,65% e MTAD®, grupo 7, irrigação com hipoclorito de sódio a 1,3% e MTAD®, grupo 8, irrigação com hipoclorito de sódio a 2,6% e MTAD®_{, grupo 9,}

diluídas, a camada residual foi totalmente removida. Como não houve diferença estatisticamente significante na remoção da camada residual utilizando soluções de hipoclorito de sódio de 1,3% a 5,25%, os autores indicam a utilização de hipoclorito a 1,3%, por sua menor toxicidade. Além disso, este protocolo de irrigação não ocasionou alterações significantes na estrutura dos túbulos dentinários.

Beltz et al.8 (2003) avaliaram a perda tecidual após expor tecido pulpar e dentinário de dentes de bovinos ao MTAD®_{, EDTA e}

hipoclorito de sódio (NaOCl) em várias concentrações. Amostras de tecido liofilizado foram misturadas por 2 horas, a 37°C, com estas soluções. Após este período os tecidos foram enxaguados com água, e liofilizados. A alteração no peso após a exposição às soluções irrigadoras foi mensurada. Os resultados demonstraram que as soluções de hipoclorito de sódio a 5,25%, 2,6% e 1,3% removeram efetivamente os componentes orgânicos da polpa e da dentina. A maior solubilização do tecido pulpar quem promoveu foi o hipoclorito de sódio a 5,25% e 2,60%, com resultados semelhantes. O efeito de solubilização da polpa pelo MTAD® foi semelhante ao do EDTA. O EDTA foi a solução com maior capacidade de solubilização da dentina, dissolvendo cerca de 70% da dentina, enquanto o hipoclorito de sódio a 5,25% dissolveu apenas 22% deste tecido. A dentina em contato com o MTAD® _{ganhou cerca de 60% de}

peso, provavelmente devido à ligação da doxiciclina à dentina, impedindo que se fizesse a mensuração do efeito de dissolução do MTAD® _na

dentina por meio do método empregado neste estudo.

As propriedades antimicrobianas do MTAD® _foram

comparadas às do hipoclorito de sódio e do EDTA por Torabinejad et al.156 _{2003. Foram utilizadas duas metodologias distintas: uma por meio}

diferença estatisticamente significante entre os halos de inibição promovidos pelo MTAD® _{e pelo hipoclorito de sódio a 5,25%. Ao diluir as}

soluções, os halos de inibição promovidos pelo MTAD® foram sempre maiores que do EDTA e do NaOCl a 5,25% . No método de concentração inibitória mínima, o EDTA não apresentou efeito sobre o E. faecalis, o NaOCl a 5,25% manteve sua atividade antimicrobiana em diluições de até 32 vezes, enquanto o MTAD® _{conseguiu agir sobre E. faecalis com até}

200 diluições. Além disso, o NaOCl após dois e 5 minutos de exposição ao E. faecalis, não matou todas as células bacterianas. Após o mesmo período de exposição ao MTAD®_{, a cultura de E. faecalisfoi negativa.}

Shabahang et al.129 _{(2003) compararam a capacidade do}

MTAD® e do hipoclorito de sódio a 5,25% da desinfecção da dentina de dentes contaminados com saliva. Os canais foram preparados, a camada residual foi removida pelo uso do EDTA a 17%, e os dentes foram autoclavados. A seguir foram contaminados pela injeção de saliva e incubados em meio BHI (Brain Heart Infusion). Em um dos grupos, os canais foram irrigados com 1 mL de MTAD®, e em seguida imersos nesta solução por 2 minutos; no segundo grupo, o mesmo tratamento foi feito, porém com hipoclorito de sódio a 5,25%. Todas as amostras foram irrigadas com meio BHI e permaneceram incubadas em um tubo contendo BHI durante 96 horas, a 37°C. A avaliação foi realizada por meio da análise de presença de turvação. Das 60 amostras tratadas com NaOCl a 5,25%, 26 permaneceram com cultura positiva, enquanto apenas uma, das 60 tratadas com MTAD®_{apresentaram culturas positivas.}

Shabahang, Torabinejad127_{, ainda em 2003, avaliaram o}

efeito antibacteriano da irrigação dos canais com hipoclorito de sódio 1,3% e 5,25%, com ou sem o uso do EDTA como solução irrigadora final, e da irrigação com hipoclorito de sódio com ou sem o uso do MTAD®

previamente inoculado nos canais radiculares. Nenhum dos espécimes tratados com hipoclorito de sódio e irrigação final com MTAD®_apresentou

crescimento positivo de E. faecalis. Os achados deste estudo demonstraram que o MTAD® _{foi superior na desinfecção da dentina e}

penetração nos túbulos dentinários. Uma das justificativas para este melhor comportamento do MTAD® pode ser a presença de um detergente na sua formulação.

Zhang et al.173 _{(2003) avaliaram a citotoxicidade do MTAD}®

comparado com soluções irrigadoras e medicações comumente utilizadas em endodontia: eugenol, peróxido de hidrogênio a 3%, hipoclorito de sódio a 5,25%, REDTA, Peridex e Pasta Pulpdent. Fibroblastos L929 foram colocados em contato com várias concentrações destes materiais. A citotoxicidade foi avaliada 24 horas após a incubação das células com os materiais, por meio do ensaio de MTT. Os autores observaram que o MTAD® apresentou menor citotoxicidade que o eugenol, que o peróxido de hidrogênio, que a pasta de hidróxido de cálcio Pulpdent, que o hipoclorito de sódio a 5,25%, que o Peridex e que o EDTA, porém maior citotoxicidade que o hipoclorito de sódio a 2,63%, 1,31% e 0,66%.

Machnick et al.81 _{(2003) realizaram um estudo para verificar}

se o MTAD®_{utilizado como irrigação final durante o preparo biomecânico}

dos canais radiculares causaria algum efeito sobre as propriedades da dentina. Neste estudo, os autores observaram os efeitos do MTAD® _na

resistência flexional e no módulo de elasticidade da dentina. Houve uma redução estatisticamente significante da resistência flexional para o grupo onde o MTAD®_{ficou em contato com a dentina durante 2 horas, e para o}

grupo onde foi utilizado EDTA. Uma redução significante do módulo de elasticidade também foi observada nestes grupos, e também no grupo onde foi utilizado o hipoclorito de sódio a 0,6%. Quando o MTAD® _foi

elasticidade, com o grupo onde foi utilizado soro fisiológico. Estes resultados indicam que o MTAD® _{pode ser usado como prescrito pelo}

fabricante, sem afetar as propriedades físicas da dentina.

Machnick et al.82 _{(2003) avaliaram também o efeito do}

MTAD® e do ácido fosfórico na força de união do adesivo dentinário OptiBond Solo Plus com a dentina e com o esmalte. Os espécimes foram primeiramente incluídos em resina, com uma das superfícies exposta. Um dos seguintes tratamentos foi dado aos espécimes antes da aplicação do Optibond Solo Plus: 1 minuto de irrigação com NaOCl e 1 minuto com EDTA; 1 minuto com NaOCl e 1 minuto com MTAD®; 30 segundos com ácido fosfórico; 1 minuto com soro fisiológico; ou 20 minutos de irrigação com NaOCl associado a 5 minutos com MTAD® (protocolo clínico para uso do MTAD®_{). Todas as superfícies tratadas foram superiores às}

superfícies onde foi utilizado soro fisiológico. Não houve diferença estatisticamente significante entre a força de adesão observada nos grupos onde foram utilizados NaOCl/EDTA, NaOCl/MTAD® _{ou MTAD}®

segundo o protocolo de uso clínico quando comparados ao grupo onde foi feito o ataque ácido. Estes resultados demonstram que os dentes tratados com NaOCl mais MTAD® _{não necessitam de condicionamento adicional}

da dentina antes da aplicação do adesivo dentinário.

O possível efeito da remoção da camada residual pelo uso do MTAD® _{na infiltração coronária de canais radiculares obturados foi}

com tinta nanquim. No grupo 1, o corante penetrou em toda extensão do canal radicular. Nenhuma infiltração foi observada nos espécimes do grupo controle. Não houve diferença estatisticamente significante entre os grupos 3 e 4 (camada residual intacta ou camada residual removida por EDTA), mas a infiltração de corante foi significativamente menor nos canais do grupo 5 , onde a camada residual foi removida com MTAD®, quando este foi comparado ao grupo 3. Não houve diferença estatisticamente significante entre os grupos 4 e 5 (camada residual removida com EDTA ou com MTAD®_).

Torabinejad et al.155 (2005) compararam o desconforto pós-operatório após o preparo biomecânico realizado a partir de dois protocolos de remoção da camada residual: canais instrumentados e irrigados com hipoclorito de sódio a 5,25%, EDTA a 17% durante 1 minuto, seguido de irrigação final com hipoclorito de sódio a 5,25%; ou irrigação com hipoclorito de sódio a 1,3% e MTAD®durante 5 minutos. Os canais foram secos com pontas de papel absorvente, e a cavidade de acesso foi fechada com cimento selador provisório Cavit. Os pacientes foram relataram o grau de desconforto segundo uma escala pré-estabelecida, variando de 0 a 9, desde sua saída do consultório até 7 dias após o preparo biomecânico. Nenhum dos pacientes relatou dor severa, edema ou outro efeito colateral. A dor aumentou levemente nas primeiras 6 horas após o preparo biomecânico, e foi observada uma redução significante, nos próximos intervalos de tempo, em ambos os grupos. Nenhuma diferença quanto ao grau de dor pós-operatória pôde ser observada entre os grupos.

Portenier et al.111(2006) avaliaram a atividade antibacteriana de clorexidina com e sem cetramida e do MTAD® _{contra duas cepas de}

clorexidina/cetramida a 0,1%/0,1% e a 0,01%/0,01%. Os resultados demonstraram que a clorexidina a 0,2% e o MTAD® _{a 100% mataram}

rapidamente as duas cepas. A combinação de cetramida com a clorexidina acelerou o tempo de eliminação das bactérias, possivelmente graças ao efeito sinérgico dos dois produtos. A presença de dentina, ou de albumina de soro bovino diminuiu consideravelmente a ação antibacteriana destas substâncias.

A ultra-estrutura da dentina de canais radiculares instrumentados e irrigados durante o preparo biomecânico com hipoclorito de sódio, e na irrigação final com MTAD® foi avaliada por Tay et al.153 (2006). Os autores analisaram por meio de Microscopia Eletrônica de Transmissão o terço coronário, o médio, e o apical, de 24 dentes extraídos. Como grupo controle positivo, os canais foram irrigados com água destilada, e como controle negativo, com EDTA. Os resultados demonstraram camada residual de 2 a 5 µm após a instrumentação com sistema rotatório e irrigação com água destilada (controle positivo). O uso do EDTA na irrigação final (controle negativo) removeu totalmente a camada residual, criando uma superfície de dentina demineralizada de 4 a 6 µm de espessura, nos terços coronário, médio e apical dos canais dentinários. O uso do MTAD®também proporcionou completa remoção da camada residual, criando zonas de dentina parcialmente desmineralizada com 10 a 12 µm de espessura. Os autores sugerem que o MTAD®possa ser utilizado por 2 minutos apenas, ao invés de cinco, no final do preparo biomecânico dos canais radiculares, provocando desta forma, menor espessura de dentina desmineralizada, que poderia não ser totalmente preenchida pelos adesivos dentinários, ou pelos cimentos endodônticos, o que poderia permitir a infiltração bacteriana posterior.

Ruff et al.122 _{(2006) compararam a eficácia do hipoclorito de}

Durante toda instrumentação, os canais foram irrigados com hipoclorito de sódio a 6%, e no final, irrigados com EDTA a 17% seguido de nova irrigação com NaOCl a 6%. Após esterilização dos espécimes, os canais foram inoculados com uma suspensão de C. albicans. Os grupos foram então irrigados com as soluções a serem avaliadas e os resultados demonstraram que o hipoclorito de sódio a 6% e a clorexidina a 2% foram igualmente efetivos na remoção da C. albicans. As duas substâncias foram superiores ao MTAD® e ao EDTA, sendo que o MTAD®apresentou resultados mais favoráveis que o EDTA. Os autores salientam que a baixa atividade antifúngica do MTAD® _{pode ser clinicamente insignificante se}

levarmos em consideração que seu uso deve ser combinado ao do NaOCl, um agente que apresenta atividade antifúngica.

Tay et al.152 _{(2006) relatou a formação de uma coloração}

vermelho-arroxeada da dentina exposta à luz após o preparo biomecânico e irrigação com NaOCl a 1,3% seguido do uso de MTAD®. O teste revelou que se trata de uma reação exotérmica, que não está relacionada com uma reação de ácido-base. Reciprocamente, a reação é de natureza de oxi-redução, ligada à tetraciclina, onde a foto-oxidação da tetraciclina resulta em uma coloração vermelho-arroxeada, derivada de um produto da degradação da tetraciclina, com alta afinidade pela hidroxiapatita. Provavelmente este processo é desencadeado pelo uso do hipoclorito de sódio, um agente oxidante. Os autores sugerem que para evitar esta pigmentação, deve ser feito o enxágüe do hipoclorito com o ácido ascórbico, um agente redutor, antes da aplicação do MTAD®_{na dentina.}

Clegg et al.21 _{(2006) avaliaram a efetividade antibacteriana}

do hipoclorito de sódio a 6%, a 3% e a 1%, da clorexidina a 2%, e do MTAD®_{. Para resultados mais próximos da realidade clínica, os autores}

foram imersos em uma das cinco soluções teste por 15 minutos, exceto o MTAD®_{, que conforme recomendado pelo fabricante, ficou em contato}

com a dentina durante apenas 5 minutos. Os espécimes foram avaliados em MEV, e também por meio da cultura de raspas de dentina. As soluções de hipoclorito de sódio a 6% e 3% foram capazes de romper e de eliminar o biofilme bacteriano; enquanto o NaOCl a 1% seguido do MTAD® _{por 5 minutos foi capaz de romper, mas não de eliminar as}

bactérias; e a clorexidina a 2% não conseguiu romper o biofilme. Na metodologia de cultura, não houve crescimento nos espécimes expostos ao NaOCl a 6%, clorexidina a 2% e NaOCl a 1% seguido do MTAD®_.

Além do primeiro estudo que analisou a espessura de matriz de colágeno desmineralizada na dentina radicular por diferentes soluções utilizadas em Endodontia, Tay et al.151 _{(2006) realizaram um segundo}

estudo avaliando o efeito da irrigação com EDTA e MTAD® _na

desmineralização de dentina intra-radicular, e na nano infiltração após obturação com AH Plus e guta-percha. Foi utilizado um protocolo de irrigação com tempo reduzido, 2 minutos, ao invés dos 5 minutos recomendados pelo fabricante. A Microscopia Eletrônica de Transmissão confirmou que a redução do tempo de irrigação não comprometeu a capacidade de remoção da camada residual. O MTAD® criou uma espessura de 5 a 6 µm de dentina desmineralizada, enquanto o EDTA a 17% criou uma espessura de 1 a 2 µm de dentina desmineralizada, mas também removeu completamente a camada residual. Os autores observaram que a matriz de dentina desmineralizada criada pelo uso do EDTA e do MTAD® na irrigação final dos canais radiculares não foi completamente infiltrada pelo cimento resinoso AH Plus.

Dunavant et al. 35 _{(2006) avaliaram a eficácia de soluções}

submerso nas soluções a serem avaliadas por 1 ou 5 minutos. Foram avaliadas hipoclorito de sódio a 1% e 6%, MTAD®_{, clorexidina a 2%,}

REDTA e SmearClear®. O efeito de cada solução foi determinado pela contagem da porcentagem de células bacterianas mortas em relação às bactérias viáveis. Não houve diferença estatisticamente significante com relação ao tempo de ação das substâncias avaliadas. O percentual de células bacterianas mortas foi: NaOCl a 6% (>99,99%), NaOCl a 1% (99,78%), SmearClear® (78,06%), clorexidina a 2% (60,49%), REDTA (26,99%), e MTAD® _{(16,08%). De acordo com esta metodologia, os}

autores concluíram que as soluções de hipoclorito de sódio a 1% e 6% foram mais eficazes na eliminação do biofilme de E. faecalis, que as demais soluções irrigadoras avaliadas.

Kho, Baumgartner67 _{(2006) compararam a eficácia contra}

Enterococcus faecalis, de dois protocolos de irrigação utilizados em Endodontia: hipoclorito de sódio a 5,25% seguido do uso de EDTA a 17%, e hipoclorito de sódio a 1,3% seguido do uso de MTAD®_{. Os canais}

radiculares foram inoculados com uma suspensão deE. faecalise após o preparo biomecânico de acordo com os grupos experimentais, foi realizada a secção da porção apical dos espécimes. As amostras foram trituradas, pesadas, e levadas ao meio de transporte RTF. Em seguida foram suspensos em meio BHI, incubados e as unidades formadoras de colônia (UFC) foram quantificadas. Não houve diferença no número de UFC de E. faecalis quando utilizados os protocolos de irrigação com MTAD®_{ou com EDTA a 17%.}

Com relação ao Tetraclean®_{, Giardino et al.}45 ₍₂₀₀₆₎

compararam a efetividade desta substância contraE. faecalis,em relação ao MTAD® _{em diversas concentrações. Foram utilizadas diluições de 1:2}

até 1:2048. O MTAD® _{conseguiu eliminar E. faecalis em uma diluição de}

A tensão superficial de soluções utilizadas durante o tratamento endodôntico foi avaliada também por Giardino et al.46 _(2006).

Foram avaliadas as soluções: EDTA a 17%, Cetrexidin® (uma mistura de cetramida 0,2% e clorexidina), SmearClear® _{(EDTA e Cetramida), NaOCl}

a 5,25%, MTAD® _{e Tetraclean}®_{. O NaOCl a 5,25%, e o EDTA a 17%}

apresentaram os valores mais altos de tensão superficial, enquanto o Cetrexidin®_{e o Tetraclean}®_{apresentaram os valores mais baixos.}

De Deus et al.31 _{(2007) avaliaram a capacidade do MTAD}®

em desmineralizar a dentina radicular em comparação ao EDTA a 17% e ao ácido cítrico a 5%. Após a produção de camada residual padronizada em todos os espécimes, e exposição às soluções avaliadas, foram obtidas imagens em diferentes tempos de desmineralização com 1000 X de aumento no microscópio ótico Cosite. Após a análise das imagens foi possível determinar quantitativamente o efeito das substâncias na dentina radicular. O teste não- paramétrico de Kruskal-Wallis demonstrou que a cinética de desmineralização promovida pelo ácido cítrico e pelo MTAD®

foi significantemente mais rápida que o promovido pelo EDTA.

Johal et al.60 (2007) compararam a atividade antibacteriana de dois protocolos de irrigação: um utilizando NaOCl a 1,3% e irrigação final com MTAD®_{, e outro utilizando NaOCl a 5,25% e irrigação final com}

EDTA a 15%. O experimento foi realizado em canais radiculares de dentes extraídos onde após a infecção das raízes com E. faecalis por quatro semanas em meio BHI foram colhidas amostras dos canais radiculares utilizando cones de papel. O grupo irrigado com NaOCl a 5,25% e EDTA não apresentou nenhuma amostra com cultura positiva, enquanto oito de 20 amostras do grupo onde a irrigação foi realizada com NaOCl, a 3% e MTAD® _{resultaram em culturas positivas. Amostras}

EDTA, e com culturas positivas em 10 dos 20 canais irrigados com NaOCl a 1,3% e MTAD®_.

Virtej et al.163 _{(2007) estudaram a desinfecção de canais}

radiculares promovida por diferentes métodos. Foram utilizados 70 dentes unirradiculares extraídos, esterilizados, e posteriormente adaptados em um aparato de acrílico para que fossem usados durante uma semana na cavidade bucal de voluntários com o intuito de contaminação dos espécimes. Após o período de contaminação, pontas de papel foram utilizadas para colheita do material dos canais radiculares. A análise da contaminação da primeira amostra foi realizada após diluições seriadas e cultura em placas de ágar sangue. As placas foram incubadas em microaerofilia e em anaerobiose por até sete dias a 37oC. A distribuição dos grupos experimentais variou conforme a técnica de desinfecção dos canais radiculares realizada: grupo 1, Endox Endodontic System® _(Lysis

SRL, Nova Milanese, Itália); grupo 2, MTAD®; grupo 3, NaOCl a 3%; e grupo 4, aplicação de ozônio com o HealOzone® _{(Kavo, Biberach,}

Alemanha). A segunda amostra foi colhida após o uso dos métodos de infecção, e a terceira amostra, uma semana mais tarde. Durante a colheita das amostras, os cones de papel absorvente estavam embebidos em tioglicolato. Os resultados da segunda amostra demonstraram que não houve diferença estatisticamente significante entre os grupos onde o NaOCl, o MTAD® ou o HealOzone® foram utilizados, enquanto o Endox demonstrou a menor efetividade antimicrobiana entre os grupos. Na terceira amostra foi detectado crescimento bacteriano em amostras de todos os grupos.

Royal et al.121 (2007) avaliaram a desinfecção dos materiais de obturação Resilon® _{e guta-percha, utilizando três diferentes soluções:}

NaOCl a 5,25%; MTAD® _{e clorexidina a 2%. Após a contaminação de}

esterilizada, colocadas em tubos contendo meio BHI, e incubadas a 37oC por sete dias. A análise dos resultados foi feita pela observação da presença de turbidez, indicativa de crescimento bacteriano. Nas amostras onde foi observada turbidez, os autores realizaram coloração de Gram para identificação das espécies e eliminação da possibilidade de contaminação. As três soluções avaliadas apresentaram-se efetivas na desinfecção das amostras de Resilon®_{, eliminando a contaminação porE.}

faecalisem apenas 1 minuto.

Newberry et al.94 _{(2007) avaliaram o efeito antibacteriano do}

MTAD® sobre oito diferentes cepas de E. faecalis. Duzentas e quarenta raízes de dentes unirradiculares extraídos foram instrumentadas usando NaOCl a 1,3% e EDTA a 17% durante a irrigação. As raízes foram divididas em oito grupos, e cada grupo contaminado com uma das cepas deE. faecalisdurante uma semana. As raízes foram irrigadas com NaOCl a 1,3% e com MTAD® durante 5 minutos. Raspas de dentina foram colhidas com brocas esféricas a partir da superfície externa radicular. Os resultados demonstraram efetividade na eliminação de sete das oito cepas de E. faecalisestudadas.

Giardino et al.47 _{(2007) avaliaram a ação antibacteriana do}

hipoclorito de sódio, MTAD®_{e Tetraclean}®_{contra oE. faecalis organizado}

Krause et al.71 (2007) compararam o efeito antibacteriano do NaOCl, MTAD®_{, e de dois de seus componentes, a doxiciclina e o ácido}

cítrico sobre o Enterococcus faecalis. Uma das metodologias utilizadas testou a desinfecção de blocos de dentina bovina, seguindo o modelo utilizado por Haapasalo e Orstavik51 _{(1987), onde as raspas de dentina}

foram coletadas após irrigação dos canais radiculares com os diferentes agentes avaliados, e em seguida incubadas em TSA para posterior quantificação das UFC. No primeiro teste, feito em dentina bovina, nas áreas mais superficiais, o NaOCl e a doxiciclina foram mais efetivas contra oE. faecalis, enquanto nas camadas mais profundas, o NaOCl foi mais efetivo na desinfecção dos túbulos. No modelo de difusão em ágar de disco, a doxiciclina e o MTAD® _{produziram maiores halos de inibição}

que o NaOCl.

De Deus et al.32_{(2008) estudaram o efeito da irrigação com}

MTAD® na habilidade seladora de canais radiculares obturados com cimento Endofill. Em um segundo grupo, os canais foram irrigados com EDTA a 17%, e no grupo controle, a camada residual não foi removida. A capacidade seladora da obturação dos canais radiculares foi observada por meio do método de infiltração de glucose, quantificada por spectrofotometria após 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49 e 56 dias. Os resultados não demonstraram diferença significativa entre os grupos avaliados.

Shabahang et al.128 _{(2008) substituíram doxiciclina por}

clorexidina, e adicionaram clorexidina à formulação do MTAD® com o intuito de verificar um possível aumento na sua atividade antibacteriana. Dentes unirradiculares extraídos foram infectados com E. faecalis e incubados por quatro semanas em meio BHI. Após a infecção dos túbulos dentinários os dentes foram irrigados com: grupo 1: NaOCl a 1,3% e MTAD®_{; grupo B: NaOCl a 1,3% e MCAD (onde ao invés de doxiciclina foi}

após a irrigação com as soluções experimentais foi feito por meio a análise da presença de turbidez do meio BHI após uma semana de incubação dos espécimes. Dos 10 espécimes irrigados com MCAD, sete apresentaram culturas positivas. Nenhum dos espécimes irrigados com MTAD® _{ou com MTAD-C apresentou crescimento bacteriano após sete}

dias de incubação. Os autores concluíram que a substituição da doxiciclina por clorexidina diminui a atividade antibacteriana do MTAD®_.

Mohammadi, Shahriari84 _{(2008) realizaram um estudo para}

verificação da atividade antibacteriana residual do MTAD®_{e da clorexidina}

2.2 Uso Local das Tetraciclinas em Odontologia

A sensibilidade antibacteriana dos Enterococcus spp. Foi avaliada por Zeldow, Ingle172(1962). Os autores avaliaram os antibióticos: penicilina, eritromicina, tetraciclina e cloranfenicol. Os resultados demonstraram que os Enterococcusspp. foram resistentes à penicilina e à tetraciclina em, respectivamente, 83% e 33% dos casos, e sensíveis à eritromicina e ao cloranfenicol.

A remoção da camada residual pela doxiciclina foi avaliada por Barkhordar et al.7 _{(1997). Após a instrumentação de canais}

radiculares de dentes extraídos, foi realizada a irrigação com diferentes concentrações de doxiciclina mais soro fisiológico; doxiciclina mais NaOCl; EDTA mais soro fisiológico; ou NaOCl mais EDTA. De acordo com os resultados, a doxiciclina foi eficiente na remoção da camada residual. Tais resultados são provavelmente devido à acidez (pH = 2) da doxiciclina, responsável pela quebra da camada residual superficial e intratubular.

Noda et al.96 _{(2000) avaliaram a suscetibilidade}

antibacteriana de bactérias isoladas de casos de infecções endodônticas persistentes, aos antibióticos: penicilinas, cefalosporinas, aminoglicosídeos e tetraciclinas. As espécies mais freqüentemente isoladas pertenciam aos gêneros Streptococcus e Enterococcus. Cepas de Enterococcus spp. foram altamente resistentes aos antibióticos avaliados,especialmente às cefalosporinas, à gentamicina e à tetraciclina.

Davis et al.29 _{(2003) investigaram o efeito da doxiciclina e do}

foram irrigados com soro fisiológico, ácido cítrico ou doxiciclina e preenchidos com diferentes materiais obturadores para posterior análise da microinfiltração nos materiais. A infiltração não foi significantemente diferente quando comparadas as três soluções irrigadoras. Na segunda parte do estudo, duas lojas ósseas foram criadas na mandíbula de coelhos. Em cada animal, uma das lojas era irrigada com solução fisiológica, e outra com ácido cítrico ou doxiciclina. Os animais foram mortos após nove ou 18 dias, para análise histológica da região. Também o processo de reparo das lojas ósseas não foi significantemente diferente de acordo com a solução irrigadora utilizada.

Eick et al.37 _{(2004) avaliaram a eficácia de diferentes}

antibióticos (clindamicina, doxiciclina, metronidazol e moxifloxacin) contra biofilmes de Actinobacillus actinomycetemcomitans, Streptococcus constellatus e Porphyromonas gingivalis. A cultura dos biofilmes foi feita em lâminas, previamente cobertas com saliva artificial, e incubados por até 48 horas. De acordo com os autores, os antibióticos avaliados não penetraram completamente no biofilme. O moxifloxacin foi a substância com maior efeito antibacteriano sobre os biofilmes, eliminando o A. actinomycetemcomitans e o P. gingivalis após 48 horas. No entanto, a erradicação completa do biofilme por meio do uso de antibióticos é improvável, levando em conta as altas concentrações inibitórias mínimas necessárias para a eficácia antibacteriana.

dias após o tratamento dos espécimes. Após cultura em placas de ágar sangue as colônias foram quantificadas. Os autores puderam concluir que a clorexidina a 2% apresentou maior substantividade que a doxiciclina e o NaOCl a 2,6%.

Yang et al.170 (2006) observaram a ação dos antibióticos amoxicilina, doxiciclina, eritromicina, metronidazol e vancomicina além de substancias como a clorexidina, o etanol e o lauril-sulfato de sódio sobre a estrutura do biofilme. Após exposição do biofilme por 30 minutos às substâncias avaliadas, foi observada inibição de diferentes componentes do biofilme. Os resultados indicaram uma relação dose-dependente da substancia avaliada sobre a inibição do biofilme.

Chu et al.18 _{(2006) avaliaram a eficácia da desinfecção dos}

canais radiculares de dentes com necrose pulpar e lesão periapical após o tratamento endodôntico e uso de um curativo de demora à base de hidróxido de cálcio (Calasept®), ou de antibióticos/esteróides, Ledermix®, uma combinação de um corticosteróide e de demeclociclina, assim como a doxiciclina, um derivado da tetraciclina; ou Septomixine®, uma combinação de um corticosteróide, e três antibióticos, a polimixina B, a tirotricina, o sulfato de neomicina e o haletazol. Amostras biológicas foram colhidas antes e após o tratamento endodôntico em duas sessões de 88 canais radiculares infectados. Anteriormente ao tratamento, 87 dos 88 canais radiculares apresentaram culturas positivas. Após o uso do curativo de demora com Ledermix®, Septomixine® ou Calasept®, as porcentagens de canais radiculares que permaneceram com culturas positivas foram 48%, 31% e 31% respectivamente. Não houve diferença significante entre os grupos.

antifúngica da anfotericina B foi otimizada com a associação dos dois outros antibióticos.

Sedlacek, Walker123 _{(2007) utilizaram um modelo in vitro de}

biofilme subgengival para avaliar o efeito de antibióticos sobre o biofilme. Os biofilmes foram expostos aos antibióticos: tetraciclina, amoxicilina, clindamicina e eritromicina, doxiciclina, minociclina, metronidazol, amoxicilina/clavulanato e amoxicilina/metronidazol por 48 horas. As concentrações de antibiótico necessárias para inibir os microrganismos organizados no biofilme foram até 250 vezes maiores que as concentrações necessárias para inibir os microrganismos na forma planctônica. As combinações de amoxicilina/clavulanato e amoxicilina/metronidazol foram as mais eficazes na supressão do crescimento bacteriano, inibindo até 90% das células bacterianas presentes no biofilme. Além disso, os autores concluíram que a resistência do biofilme está relacionada com o tempo de crescimento do mesmo, sendo que a máxima resistência é alcançada na fase estacionária do crescimento celular bacteriano.

2.3 Tween 80: Ação Antimicrobiana e Interação com outras Substâncias

Smith et al.141 _{(1963) relataram pela primeira vez a}

inativação da ação antimicrobiana de algumas substancias pelo Tween 80. Este detergente, em uma concentração de 1% teria efeito semelhante à a-lecitina na inativação de esteróides. Os esteróides avaliados apresentaram capacidade de inativação do Streptococcus pyogenes e foram completamente inativados pela a-lecitina a 0,1%, e pelo Tween 80. Os autores também demonstraram que a a-lecitina e o Tween 80 apresentam a ação inativadora dos esteróides tanto isolados quanto quando usados em associação.

Hugo, Longworth58 _{em 1964 foram os primeiros a apontar}

similaridade no modo de ação da clorexidina e de composto amônio-quartenários e afirmaram que o Tween 80 combinado à a-lecitina é um agente neutralizante destes dois produtos.

Heard, Ashworth57 _{(1968) também demonstraram que a}

clorexidina e os compostos amônio-quartenários se comportam como agentes surfactantes típicos, formando micelas. Relataram ainda que tanto a clorexidina quanto os compostos amônio-quartenários são inativados pelo Tween 80.

Engley,Dey40 (1970) apud: Sheikh131 et al. 1981) recomendaram o uso de um neutralizante universal para diversos medicamentos, onde na composição era utilizado oTween 80a 0,5% e a a-lecitina a 0,7%.

altas do detergente inibiram o crescimento daPrevotella melaninogenicae daFusobacterium nucleatum.

Sheikh131 _{(1981) desenvolveu um método de inativação de}

três anti-sépticos: digluconato de clorexidina, iodopovidona e hexaclorofeno. O neutralizante continha em sua formulação Asolectina a 3%, Tween 80 a 10% e tiossulfato de sódio a 0,3%. Este sistema foi totalmente efetivo na prevenção do efeitocarry-overdos três anti-sépticos avaliados. Além disso, a solução neutralizante não apresentou efeitos sobre os 10 microrganismos anaeróbios incluídos no estudo.

A atividade antibacteriana do metil-p-hidroxibenzoato, fenoxietanol e clorocresol sobre a Pseudomonas aeruginosa foi avaliada por Kurup et al.72 _{(1991) em presença de várias concentrações deTween}

80. A atividade antibacteriana destas soluções foi aumentada na presença do Tween 80. Os autores atribuem este aumento à redução de tensão superficial causada pela presença do detergente Tween 80.

Remmal et al.117_{(1993) afirmaram que a presença de Tween}

80, como agente emulsificante em óleos essenciais, interfere na atividade antimicrobiana destes óleos de forma negativa. A concentração inibitória mínima dos óleos de cravo da índia e orégano em presença deTween 80 foi maior que quando não havia a presença do detergente.

2.4 Ação Antimicrobiana da Cetramida

El-Nima39 _{(1984) demonstrou que a cetramida apresenta}

efeito sinérgico com os antibióticos sulfametoxipiridanize, polimixina B, gentamicina, carbenicilina, neomicina e ampicilina na eliminação da Pseudomonas aeruginosa. Quando em concentrações entre 0,01% e 0,04%, a cetramida foi capaz de diminuir a concentração inibitória mínima dos antibióticos sobre a P. aeruginosa, enquanto o Tween 80 não demonstrou nenhum efeito nesse sentido.

D’Arcangelo et al.26 _{(1998) realizaram teste antibacteriano}

com hipoclorito de sódio a 1% e a associação de clorexidina a 0,2% e cetramida a 0,2%. As soluções foram avaliadas em presença de Streptococcus mitis, S. mutans, S. salivarius e S. sanguis. O tempo de contato dos microrganismos com as soluções foi de 10, 20 e 30 minutos, e os resultados obtidos revelaram culturas negativas com as duas soluções, mesmo no período de exposição mais curto.

Em avaliação da atividade antibacteriana de algumas substancias sobre o metabolismo da Enterobacter cloacae, Majtán, Majánová83 _{(1999) verificaram que a cetramida apresenta ação}

antibacteriana com uma concentração de até 3,12 mg/L.

Em 2003, Botelho12 avaliou a ação antibacteriana de um cimento de ionômero de vidro acrescido de agentes antimicrobianos, entre eles a cetramida. A ação antimicrobiana foi avaliada por meio do método de difusão de ágar. As zonas de inibição foram mensuradas após 24 horas de incubação. A adição de cetramida ao cimento de ionômero de vidro apresentou o maior halo de inibição contra as cepas avaliadas.

clorexidina a 2% e clorexidina a 0,2% associada à cetramida a 0,2% (Cetrexidin®, Vebas, San Giuliano, Milão, Itália). Os testes foram realizados em dentes recém extraídos esterilizados e infectados com E. faecalis por 24 horas em meio BHI. Os canais foram irrigados por 5 minutos com as soluções a serem avaliadas e um cone de papel absorvente foi levado aos canais para colheita da amostra. Também neste estudo, os autores avaliaram a atividade e antibacteriana destas soluções in vivo, em pacientes portadores de dentes com necrose pulpar e lesão periapical visível radiograficamente. Além disso, a biocompatibilidade das soluções foi avaliada em tecido subcutâneo de ratos. Os resultados da avaliação das propriedades antibacterianas das soluções demonstraram que a associação de clorexidina e cetramida foi mais efetiva in vitro e in vivo. Com relação à biocompatibilidade o NaOCl foi a mais agressiva das soluções.

Botelho13, em 2005, acrescentou agentes antimicrobianos, entre eles a cetramida, à formulação de um condicionador de dentina em uma concentração de a 1% e realizou teste de difusão de gota em ágar para examinar o efeito inibitório sobre três bactérias cariogênicas. De acordo com os resultados, o condicionador de dentina acrescido de cetramida apresentou os maiores halos de inibição contra as três bactérias avaliadas.

de soro bovino diminuiu consideravelmente a ação antibacteriana das substâncias.

Iwanami et al.59_{(2007) realizaram um estudo para verificar a}

2.5 Biofilme como Modelo Experimental in vitro

Eick et al.37 _{(2004) utilizaram em seu estudo biofilmes de}

Actinobacillus actinomycetemcomitans, Streptococcus constellatus e Porphyromonas gingivalis. O crescimento dos biofilmes foi feito em lâminas cobertas com saliva artificial, por até 48 horas. Os resultados demonstraram que os antibióticos clindamicina, doxiciclina, metronidazol e moxifloxacin não penetraram completamente no biofilme. Segundo os autores, a erradicação completa do biofilme por meio do uso de antibióticos é improvável, levando em conta as altas concentrações inibitórias mínimas necessárias para a eficácia antibacteriana.

Kishen et al.68 _{(2006) investigaram a interação entre o E.}

George et al.43 (2005) estudaram o efeito de diferentes condições de crescimento nas características do biofilme deE. faecalis, e a penetração destes microrganismos nos túbulos dentinários, uma vez que muito se fala das condições favoráveis ao crescimento doE. faecalis após o tratamento endodôntico. A cultura do biofilme foi feita sobre blocos de dentina em aerobiose, anaerobiose, com riqueza de nutrientes e com deficiência de nutrientes por um período de 21 dias. A análise dos biofilmes foi realizada com Microscopia Eletrônica de Varredura, Microscopia Confocal e Raios-X de Energia Dispersiva (EDX). A penetração das bactérias nos túbulos dentinários foi observada por meio da Microscopia Ótica com coloração de Gram. O EDX demonstrou um aumento significante dos níveis de cálcio (Ca+_{) na estrutura do biofilme}

formado sob condições anaeróbicas e com deficiência de nutrientes. A profundidade de penetração das bactérias foi maior quando o ambiente foi rico em nutrientes.

Clegg et al.21_{(2006) inocularam amostras de cultura colhidas}

de canais radiculares de dentes com necrose pulpar, em blocos de dentina. Os espécimes foram imersos nas soluções teste (MTAD®_,

clorexidina e hipoclorito de sódio) e foram avaliados em Microscopia Eletrônica de Varredura, e também por meio da cultura de raspas de dentina. O hipoclorito de sódio a 6% e a 3% foi capaz de romper e de eliminar o biofilme bacteriano; enquanto o NaOCl a 1% seguido do MTAD® _{por 5 minutos foi capaz de romper, mas não de eliminar as}

bactérias; e a clorexidina a 2% não conseguiu romper o biofilme. Na metodologia de cultura, não houve crescimento nos espécimes expostos ao NaOCl a 6%, clorexidina a 2% e NaOCl a 1% seguido do MTAD®_.

avaliaram a efetividade antimicrobiana do hipoclorito de sódio a 6%, 3% e 1%, da clorexidina a 2%, e do MTAD®_.

biofilmes de monoculturas de E. faecalis, S. aureus, C. albicans, P. intermédia, P. gingivalis, P. endodontalis e F. nucleatum. Os biofilmes foram gerados em filtros de membrana de celulose e incubados em placas de BHI ágar para os facultativos e aeróbios e FAA (Ágar Anaeróbio Fastidioso) para os microrganismos anaeróbios. A eficiência do método para criação do biofilme foi verificada em MEV após 10 dias de incubação. Os filtros de membrana foram retirados do meio de cultura e colocados em contato com as soluções a serem avaliadas por períodos de 5, 10, 15, 30 e 60 minutos. Após os períodos de tempo determinados a ação do hipoclorito foi neutralizada com tiossulfato de sódio e a da clorexidina com a associação de a-lecitina e Tween 80. As células bacterianas viáveis foram suspensas, e após a diluição seriada foi feita cultura em placas de ágar para posterior contagem das UFC. Os agentes utilizados na forma líquida demonstraram melhor ação antimicrobiana no biofilme. Além disso, os microrganismos anaeróbios foram eliminados mais rapidamente que os facultativos e aeróbios.

Soukos et al.143 (2006) utilizaram um modelo in vitro de biofilme de E. faecalis para avaliação da terapia fotodinâmica sobre microrganismos presentes em infecções endodônticas. Uma suspensão de E. faecalisfoi feita em meio BHI onde foram incubados segmentos de dentina radicular durante três dias em ambiente anaeróbio. Após o tratamento da dentina, os segmentos de canal radicular foram irrigados com meio BHI e o conteúdo dessas amostras foram agitadas em um vortex, foram realizadas diluições seriadas. As amostras foram incubadas após plaqueamento em ágar sangue, em ambiente anaeróbio por sete dias. A terapia fotodinâmica foi capaz de eliminar até 97% das bactérias viáveis do biofilme.

Em 2006, Rolland et al.120 _{observaram a formação do}