RAYANE BARTIRA SILVA DO NASCIMENTO
ANÁLISE CITOARQUI TETÔNICA DOS COMPONENTES DO SISTEMA DE TEMPORIZAÇÃO CIRCADIANA DO SAGUI (Callithrix jacchus), COMPARADA
COM A INERVAÇÃO DAS SUAS PRINCIPAIS AFERÊNCIAS.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Psicobiologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte para a obtenção do título de Mestre em Psicobiologia.
RAYANE BARTIRA SILVA DO NASCIMENTO
ANÁLISE CITOARQUI TETÔNICA DOS COMPONENTES DO SISTEMA DE TEMPORIZAÇÃO CIRCADIANA DO SAGUI (Callithrix jacchus), COMPARADA
COM A INERVAÇÃO DAS SUAS PRINCIPAIS AFERÊNCIAS.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Psicobiologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte para a obtenção do título de Mestre em Psicobiologia.
Orientador: Jeferson de Souza Cavalcante.
Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Setorial do Centro de Biociências
Nascimento, Rayane Bartira Silva do.
Análise citoarquitetônica dos componentes do sistema de temporização circadiana do Sagui (Callithrix jacchus), comparada com a inervenção das suas principais aferências / Rayane Bartira Silva do Nascimento. – Natal, RN, 2011.
82 f. : Il.
Orientador: Prof. Jeferson de Souza Cavalcante.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em Psicobiologia.
1. Callithrix jacchus – Dissertação 2. Sagui – Dissertação. 3. Núcleo supraquiasmático – Dissertação. I. Cavalcante, Jeferson de Souza. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título.
Título
ANÁLISE CITOARQUI TETÔNICA DOS COMPONENTES DO SISTEMA DE TEMPORIZAÇÃO CIRCADIANA DO SAGUI (Callithrix jacchus), COMPARADA
COM A INERVAÇÃO DAS SUAS PRINCIPAIS AFERÊNCIAS.
Autora
RAYANE BARTIRA SILVA DO NASCIMENTO
Data da Defesa
03/08/2011
Banca Examinadora
______________________________________________________ Profª. Luciana Pinato
Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, SP
______________________________________________________ Profª. Miriam Stela Maris de Oliveira Costa
Universidade Federal do Rio Grande do Norte, RN
______________________________________________________ Profº. Jeferson de Souza Cavalcante
AGRADECIM ENTOS
Primeiramente ao meu Deus, pois em meio a tanta dificuldade Ele tem verdadeiramente sido o meu refúgio e fortaleza.
À minha mãe Eliane Nascimento pelo amor incondicional dedicado, estando sempre pronta a ouvir-me sendo fundamental durante o desenvolvimento deste trabalho.
Ao meu noivo Expedito Mendonça pelo carinho e amor dedicados e por compreender o quão importante é a continuidade da minha carreira científica.
Aos familiares e amigos pelo incentivo em meio a momentos ímpares em minha vida. Ao meu primo Expedito Júnior por ter me proporcionado o prazer de conhecer o Laboratório de Neuroanatomia – LABNEURO.
A Professora Miriam Stela por ter me ensinado a dar os primeiros passos na carreira científica.
Ao meu orientador Jeferson Cavalcante, e porque não chamá-lo amigo, afinal é isso que ele tem sido ao longo dessa jornada.
À Fívia Lopes pela amizade e preocupação pessoal.
Aos amigos que compõem o LABNEURO pelos conhecimentos compartilhados e momentos de descontração nos intervalos dos procedimentos.
À Regina Celi por sua organização e preparo de soluções no LABNEURO.
À Janaína Siqueira, Kayo Azevedo e Paulo Leonardo pelo apoio durante a realização dos últimos procedimentos o que tornou esses dias mais curtos e proveitosos.
“Bem aventurado o homem que acha sabedoria, e o homem que adquire conhecimento. Mais preciosa é do
que os rubins; e tudo o que podes desejar não se pode
comparar a ela”.
LISTA DE ABREVIATURAS
AII – Angiotensina II
APM – Área pré-óptica medial CB – Calbindina
CR – Calretinina
CTb – Subunidade B da toxina colérica ENK – Encefalina
FIG – Folheto intergeniculado GABA – Ácido gama-amino-butírico GFAP – Proteína acídica fibrilar glial GLD – Núcleo geniculado lateral dorsal GLU – Glutamato
GLV – Núcleo geniculado lateral ventral GRP – Peptídeo liberador de gastrina
NeuN – Proteína nuclear neuronal específica NPG – Núcleo pré-geniculado
NPGle – Lâmina externa do núcleo pré-geniculado NPGli – Lâmina interna do núcleo pré-geniculado NPY – Neuropeptídeo Y
NSQ – Núcleo supraquiasmático NT – Neurotensina
PACAP – Polipeptídeo pituitário ativador da adenilato ciclase qo – quiasma óptico
RNA – Ácido ribonucléico SP – Substância P
STC – Sistema de temporização circadiana VP – Vasopressina
TH – Tirosina hidroxilase
TRH – Trato retino-hipotalâmico 3v – Terceiro ventrículo
LISTA DE TABELAS E FIGURAS
Tabela 1 – Anticorpos utilizados segundo as especificações técnicas dos fabricantes.
Figura 1 – Sagui (Callithrix jacchus).
Figura 2 – Citoarquitetura do núcleo supraquiasmático e do núcleo pré-geniculado (Nissl).
Figura 3 – Imunorreatividade à NeuN no núcleo supraquiasmático.
Figura 4 – Imunorreatividade à NeuN no núcleo pré-geniculado. Figura 5 – Imunorreatividade à GFAP no núcleo supraquiasmático.
Figura 6 – Imunorreatividade à GFAP no núcleo pré-geniculado.
Figura 7 – Projeção retiniana ao núcleo supraquiasmático. Figura 8 – Projeção retiniana ao núcleo pré-geniculado.
Figura 9 – Imunorreatividade ao NPY e à 5-HT no núcleo supraquiasmático.
Figura 10 – Imunorreatividade ao NPY no núcleo pré-geniculado.
SUMÁRIO
Página
RESUMO 12
ABSTRACT 13
1. INTRODUÇÃO 14
1.1 Os Ritmos Biológicos 14
1.2 O Sistema de Temporização Circadiana 15
1.2.1 O Núcleo Supraquiasmático 15
1.2.2 O Folheto Intergeniculado 18
1.2.3 O Núcleo Pré-Geniculado 20
1.3 Proteína Nuclear Neuronal Específica
20
1.4 Proteína Acídica Fibrilar Glial 21
1.5 O Sagui 22
2. JUSTIFICATIVA 23
3. OBJETIVOS 24
4. MATERIAL E MÉTODOS 25
4.1 Animais 25
4.2 Injeção de CTb 25
4.3 Perfusão 26
4.4 Remoção do Encéfalo e Microtomia 26
4.5 Técnica Imunoistoquímica 27
4.6 Método de Nissl 30
4.7 Análise dos Resultados 30
5. RESULTADOS 31
5.1 Citoarquitetura do núcleo supraquiasmático e do núcleo pré-geniculado 31
5.1.2 Proteína Nuclear Neuronal Específica (NeuN) 31 5.1.2 Proteína Acídica Fibrilar Glial (GFAP) 32 5.2 Projeção Retiniana ao Núcleo Supraquiasmático e ao Núcleo
Pré-Geniculado
32
5.3 Neuropeptídeo Y (NPY) e Serotonina (5-HT) no Núcleo Supraquiasmático e no Núcleo Pré-Geniculado
33
FIGURAS
Figura 2 – Citoarquitetura do núcleo supraquiasmático e do núcleo pré-geniculado (Nissl).
35
Figura 3 – Imunorreatividade à NeuN no núcleo supraquiasmático. 37 Figura 4 – Imunorreatividade à NeuN no núcleo pré-geniculado. 39 Figura 5 – Imunorreatividade à GFAP no núcleo supraquiasmático. 41 Figura 6 – Imunorreatividade à GFAP no núcleo pré-geniculado. 43 Figura 7 – Projeção retiniana ao núcleo supraquiasmático. 45 Figura 8 – Projeção retiniana ao núcleo pré-geniculado. 47 Figura 9 – Imunorreatividade ao NPY e à 5-HT no núcleo
supraquiasmático.
49
Figura 10 – Imunorreatividade ao NPY no núcleo pré-geniculado. 51 Figura 11 – Imunorreatividade à 5-HT no núcleo pré-geniculado. 53
6. DISCUSSÃO 54
6.1 Citoarquitetura 54
6.1.1Nissl 54
6.1.2 Proteína Nuclear Neuronal Específica (NeuN) 55 6.1.3 Proteína Acídica Fibrilar Glial (GFAP) 59
6.2 Projeção Retiniana 61
6.3 Neuropeptídeo Y (NPY) 63
7. CONCLUSÕES 65
8. REFERÊNCIAS 67
12 RESUMO
O núcleo supraquiasmático (NSQ) do hipotálamo anterior, juntamente com o folheto intergeniculado (FIG) do tálamo são considerados os componentes centrais do sistema de temporização circadiana (STC) de mamíferos. Tal sistema é responsável pela geração e regulação dos ritmos circadianos estabelecendo uma organização temporal dos processos fisiológicos e comportamentos. A proteína nuclear neuronal específica (NeuN) tem sido amplamente utilizada como um marcador neuronal em diversos estudos.Já a proteína acídica fibrilar glial (GFAP) é um componente dos filamentos intermediários encontrada no citoplasma dos astrócitos e é comumente usada como um marcador específico para essas células. Este trabalho tem como objetivo identificar, no sagui, neurônios imunorreativos a NeuN e células gliais imunorreativas a GFAP, bem como mapear a principal via de sincronização fótica do STC, o trato retinohipotalâmico (TRH), e identificar as vias indiretas para o NSQ e núcleo pré-geniculado (NPG) – estrutura homóloga ao FIG dos roedores, utilizando técnicas citoarquitetônica e imunoistoquímica. Observamos no NSQ a presença de neurônios imunorreativos a NeuN, bem como terminais imunorreativos a subunidade b da toxina colérica (CTb), a neuropeptído Y (NPY) e a serotonina (5-HT). Já no NPG notamos a presença de neurônios imunorreativos a NeuN e a NPY e terminais imunorreativos a CTb e a 5-HT. Os astrócitos estão presentes em toda a extensão do NSQ e do NPG deste primata do Novo Mundo.
13 ABSTRACT
The suprachiasmatic nucleus (SCN) of the anterior hypothalamus, together with the intergeniculate leaflet (IGL) of the thalamus are considered the central components of the circadian timing system (CTS) of mammals. This system is responsible for the generation and regulation of circadian rhythms by establishing a temporal organization of physiological processes and behaviors. The neuronal specific nuclear protein (NeuN) has been widely used as a neuronal marker in several studies. Since glial fibrillary acidic protein (GFAP) is a component of intermediate filaments found in the cytoplasm of astrocytes and is commonly used as a specific marker for these cells. This study aims to identify, in the marmoset, the NeuN immunoreactive neurons and glial cells immunoreactive to GFAP, as well as map the major route of photic synchronization of the STC, retinohypothalamic tract (RHT), and identify the indirect pathway to the SCN and pregeniculate nucleus (PGN) - structure homologous to IGL rodents, using immunohistochemical and cytoarchitectonic techniques. Observed in SCN the presence of neurons immunoreactive to NeuN and terminals immunoreactive subunit b of cholera toxin (CTb), neuropeptide Y (NPY) and serotonin (5-HT). In the PGN noted the presence of the NeuN and NPY immunoreactive neurons and the immunoreactive terminals CTb and 5-HT. Astrocytes are present throughout the extent of the SCN and the PGN this New World primate.
14 1. INTRODUÇÃO
No curso evolutivo o sistema nervoso tem proporcionado aos animais a capacidade de processamento de informações provenientes do meio e a elaboração de respostas comportamentais para esses estímulos. Vários são os estímulos capazes de gerar comportamentos, porém o estímulo dominante e capaz de provocar respostas comportamentais adaptativas é a alternância de luz e escuro no ciclo claro-escuro ambiental que apresenta um padrão rítmico de 24 horas. Esse estímulo contribui para a organização do comportamento em ciclos de atividade e repouso, onde os animais concentram suas atividades (alimentação, reprodução e fuga de predadores), de acordo com os seus sentidos dominantes, em uma das fases do dia (Moore, 1999; Marques e Menna-Barreto, 2003).
Esse padrão de organização comportamental só é possível devido à presença de estruturas neurais que compõem um sistema intrínseco do sistema nervoso denominado sistema de temporização circadiana (STC), o qual possibilita a sincronização de um ritmo endógeno a um determinado ciclo, permitindo dessa forma ao animal a capacidade de ajuste ao meio, e possibilitando assim, uma maior probabilidade de sobrevivência (Marques e Menna-Barreto, 2003).
1.1 – Os Ritmos Biológicos
Os ritmos biológicos apresentam características próprias: além de serem gerados pelo próprio organismo, são determinados geneticamente, persistem na ausência de pistas ambientais e apresentam repetição periódica. Os ritmos circadianos, oscilações endógenas em uma faixa limite entre 20 e 28 horas, são a forma de adaptação mais comum dos seres vivos. Esses ritmos podem ser expressos desde os organismos mais simples, como as bactérias, a organismos com um maior grau de complexidade, como o homem (Moore, 1999).
15 que esses ritmos são adaptações geradas endogenamente e geneticamente determinadas (Marques e Menna-Barreto, 2003; Moore, 1999).
Para a geração e manutenção dos ritmos circadianos faz-se necessário a presença de um sistema composto por um conjunto de estruturas neurais especializadas, que estabelecem uma organização temporal dos processos fisiológicos e comportamentos, o nome desse sistema é sistema de temporização circadiana (Moore, 1999).
1.2 – O Sistema de Temporização Circadiana (STC)
O STC é composto por um marca-passo central; vias de entrada, incluindo aferências retinianas para permitir a sincronização dos ritmos aos ciclos ambientais; e vias de saída que dão acesso aos efetores comportamentais (ver Cavalcante et al., 2006).
Para uma melhor adaptação ao meio e organização dos comportamentos, os animais desenvolveram dois diferentes padrões de temporização circadiana. Nos animais em que as estruturas visuais desenvolveram-se mais do que os outros sentidos, a atividade se concentra na fase de claro e o repouso na fase de escuro. Esses animais são conhecidos como diurnos. Já aqueles nos quais as estruturas olfativas e auditivas são mais desenvolvidas, concentram a sua atividade na fase de escuro e o repouso na fase de claro e são conhecidos como noturnos. Portanto, os padrões de temporização circadiana estão associados aos sentidos dominantes dos animais e dessa forma contribuem para os comportamentos de fuga, alimentação e reprodução (Moore, 1999).
Em mamíferos, os principais componentes neurais do STC são o Núcleo Supraquiasmático (NSQ) do hipotálamo e o Folheto Intergeniculado (FIG) do tálamo (ver Cavalcante et al., 2006; ver Morin e Allen, 2006; ver Golombek e Rosenstein, 2010).
1.2.1 – O Núcleo Supraquiasmático
16 apontando assim o NSQ do hipotálamo como o possível marca-passo circadiano (Moore e Lenn, 1972).
Estudos posteriores, utilizando experimentos de lesão no NSQ, mostram que os animais apresentam perda dos ritmos circadianos comportamentais, endócrinos e fisiológicos (Klein et al., 1991). Esses animais arrítmicos, em conseqüência de lesões no NSQ recuperam o ritmo circadiano através de transplante de NSQ fetal, no entanto, os animais hospedeiros adquirem o ritmo do doador (Ralph et al., 1990). Estudos utilizando cultura de células do NSQ in vitro mostram que essas células exibem um padrão de atividade elétrica por pelo menos um ciclo de 24 horas (Green e Gillette, 1982; Groos e Hendriks, 1982). Esses estudos indicam que o NSQ está envolvido com a geração dos ritmos circadianos e que na ausência de pistas ambientais ou de outras partes do sistema nervoso central, os neurônios do NSQ são capazes de manter um ritmo circadiano (Klein et al., 1991).
17 neuropeptídeo Y (NPY), a serotonina (5-HT) e a tirosina hidroxilase (TH). (Abrahamson e Moore, 2001; Moore et al., 2002; ver Cavalcante et al., 2006; ver Morin, 2007). A distinção das subdivisões do NSQ baseadas na distribuição dos aferentes visuais e na quimioarquitetura é semelhante entre as espécies de mamíferos (Cassone et al., 1988).
As vias aferentes, também ditas vias sincronizadoras, levam ao NSQ informações que possibilitam a sincronização dos ritmos endógenos aos ciclos externos. A informação luminosa, principal agente sincronizador, é conduzida até o NSQ por duas vias distintas. A principal via sincronizadora dos ritmos circadianos ao ciclo claro-escuro é o trato retino-hipotalâmico (TRH) que foi mostrado primeiramente em ratos utilizando técnicas de autoradiografia (Moore e Lenn, 1972). Esta via é formada por fibras originárias de células ganglionares da retina que percorrem o nervo óptico e destacam-se do quiasma óptico, ramificando-se no NSQ (Hendrickson et al., 1972; Moore e Lenn, 1972). O principal neurotransmissor utilizado é o glutamato (GLU) (De Vries et al., 1993; ver Hannibal, 2002).
Embora o NSQ receba entrada retiniana bilateral através do TRH em todos os mamíferos, o padrão desta inervação varia consideravelmente entre as espécies, de tal modo que a inervação retiniana pode ser predominantemente contralateral em sagui (Costa et al., 1999), predominantemente ipsilateral em mussaranho (Tokunaga et al., 1992) ou com quase completa simetria bilateral em ovelha (Tessonneaud et al., 1994).
Estudos utilizando traçadores neuronais mostram que as fibras do TRH ramificam-se predominantemente na porção ventrolateral do NSQ sendo a porção dorsomedial praticamente desprovida destas fibras (Abrahamson e Moore, 2001). Um estudo recente demonstra que o TRH está dividido dois componentes: o trato retino-hipotalâmico medial que apresenta como principais alvos o NSQ - região ventrolateral, a zona subparaventricular - região perisupraquiasmática, e núcleo hipotalâmico anterior - parte ventromedial; e o trato retino-hipotalâmico lateral que se projeta claramente para a área pré-óptica lateral e especialmente para a área hipotalâmica lateral - região anterior - zona ventral - parte retino-recipiente (ver Canteras et al., 2011). A lesão de axônios retinianos que se projetam para o NSQ resulta em perda da sincronização, com persistência dos ritmos em livre-curso (Johnson et al., 1988).
18 maioria das investigações infere que a presença de células imunorreativas a NPY no FIG e terminais no NSQ constituem prova da existência do TGH. Uma terceira fonte de aferências para o NSQ é representada pela projeção serotoninérgica proveniente dos núcleos da rafe (Yamakawa e Antle, 2010). Esta projeção foi inicialmente deduzida pela presença do importante plexo terminal serotoninérgico presente no NSQ de todos os mamíferos e há evidências que a serotonina module a entrada fótica para o NSQ pelo controle da liberação de glutamato a partir do TRH (ver Cavalcante et al., 2006; Pontes et al., 2010).
Além de receber aferências da retina, do FIG e da rafe mesencefálica, o NSQ recebe aferências do córtex límbico, prosencéfalo basal, hipotálamo, tronco encefálico e área pré-tectal (Moga e Moore, 1997).
As conexões eferentes do NSQ destinam-se principalmente para áreas talâmicas (zona incerta, núcleo paraventricular, núcleo paratenial) e hipotalâmicas (núcleo paraventricular, zona subparaventricular medial e lateral, área pré-óptica, núcleo dorsomedial, área peri-supraquiasmática, área tuberal ventral). Essas áreas específicas são consideradas sítios efetores do marcapasso para os sistemas sob controle circadiano (ver Leak e Moore, 2001). O NSQ também está conectado com outras áreas do sistema límbico, principalmente através de núcleos adjacentes, como os núcleos paraventriculares do tálamo e do hipotálamo (ver Cavalcante et al., 2006). A conectividade do NSQ reflete o alto nível de complexidade deste no controle dos ritmos biológicos, visto que o mesmo, não está apenas sob influência de sinais fóticos, mas também sinais neuroendócrinos, autonômicos e comportamentais (ver Lima, 2008).
1.2.2 – O Folheto Intergeniculado
19 orientação na direção do maior eixo do núcleo e raramente se estendem além das bordas do mesmo (Moore e Card, 1994).
O FIG foi inicialmente observado através de estudos baseados no padrão de aferências retinianas para o complexo geniculado lateral do tálamo (Hickey e Spear, 1976). As projeções retinianas ao FIG são provenientes das mesmas células ganglionares que se projetam para o NSQ, devido à bifurcação de seus axônios (Pickard, 1985; Morin et al., 1992; 2003). Essa fina lâmina de células exerce importante função na modulação dos ritmos circadianos de mamíferos através do TGH que utiliza o NPY como principal neurotransmissor, fazendo parte, portanto, do STC destes animais (ver Cavalcante et al., 2006). Além de neurônios contendo NPY, o FIG apresenta também em seu conteúdo neuroquímico, ENK, SP e GABA (Moore e Card, 1994).
Estudos mostram que lesões no FIG alteram significativamente o período do ritmo circadiano de atividade locomotora em animais mantidos sob condições constantes. Em camundongos mantidos sob condições de escuro constante a lesão bilateral do FIG provoca uma redução no nível de sua atividade locomotora (Lewandowski e Usarek, 2002) o que também é observado em ratos (Kuroda et al., 1997) e em hamsters mantidos em condições de claro constante (Wickland e Turek, 1994). Em Octodon degus, a lesão completa do FIG provoca visivelmente uma diminuição do nível de NPY no NSQ (Goel et al., 1999) visto que este peptídeo apresenta dois picos distintos de atividade no NSQ em consequência da mudança de claro para escuro, e esta informação sobre a mudança de luminosidade é transmitida para o mecanismo circadiano principalmente via FIG (Inouye et al., 1993, Shinohara et al., 1993).
20 1.2.3 – O Núcleo Pré-Geniculado
Em primatas, a organização do complexo geniculado lateral do tálamo é diferente daquela encontrada em roedores. Este é composto pelo GLD, correspondente ao GLD de roedores e pelo núcleo pré-geniculado (NPG) um grupamento celular em forma de cunha que circunda dorsomedialmente o GLD (Jones, 2007).
O NPG tem sido descrito compreendendo duas porções distintas: a primeira localizada numa região látero-dorsal ao GLD, que é continua com o núcleo reticular do tálamo; e a outra situada numa região dorsomedial ao mesmo, a qual se continua com a zona incerta medialmente (Moore, 1993).
Tanto o GLV dos roedores quanto o NPG dos primatas são retino-recipientes, apresentam conexões com estruturas motoras oculares do tronco encefálico e recebem aferências dos córtices estriado e visual extra-estriado, sendo considerado assim o NPG o equivalente ao GLV de roedores (Livingston e Mustari, 2000).
Em macaco Rhesus (Moore, 1993), Callithrix jacchus (Costa et al., 1998; ver Lima, 2008) e Cebus apella (Pinato et al., 2009) foram encontrados neurônios imunorreativos a NPY no NPG, semelhante ao que é visto no FIG, permitindo supor que o NPG de primatas contenha também o equivalente ao FIG de roedores.
1.3 – Proteína Nuclear Neuronal Específica
A identificação da maioria dos tipos celulares do sistema nervoso de vertebrados é realizada através de procedimentos histológicos. Um marcador neuronal que tem sido extensivamente utilizado para a identificação de células nervosas é a proteína nuclear neuronal específica, mais conhecida por NeuN (Núcleo Neuronal) a qual é expressa no núcleo e no citoplasma da maioria das células do sistema nervoso dos vertebrados sendo utilizada para a marcação de células em tecidos embebidos por parafina e fixados com formalina (Preusser et al., 2006).
21 fetal humano onde células imunorreativas a NeuN são vistas após o processo de migração neuronal (Sarnat et al., 1998), em estudos morfométricos como marcador neuronal de tecido cerebral humano pós-morte (Wolf et al., 1996; Gittins e Harrison, 2004), em diagnósticos de histopatologia é considerado um marcador da diferenciação neuronal em tumores cerebrais (Preusser et al., 2006; Soylemezoglu et al., 2003) e em estudos de desordens neuro-degenerativas (Falke et al., 2003; Kordower, et al., 2001). Estudos relatam que a imunorreatividade para NeuN diminui drasticamente após danos no sistema nervoso central (Bendel et al., 2005; Ajmo et al., 2006; Liu et al., 2009) e essa diminuição pode indicar uma mudança na antigenicidade da proteína NeuN em vez de morte celular, e alguns neurônios podem recuperar o seu padrão de marcação após o reparo (Unal-Cevik et al., 2004).
1.4 – Proteína Acídica Fibrilar Glial
Os astrócitos são elementos de sinalização dinâmica que integram entradas neuronais, exibem excitabilidade, podem modular neurônios vizinhos e participam em funções críticas e essenciais do sistema nervoso como plasticidade, aprendizagem e memória (ver Araque et al., 2001; ver Fields e Stevens-Graham, 2002; ver Hansson e Rönnbäck, 2003). Além disso, os astrócitos podem regular a formação e remodelação de sinapses (Ullian et al., 2001) e induzir a neurogênese a partir de células-tronco neurais (Song et al., 2002). Estudos mostram que os astrócitos apresentam um importante papel na regulação dos ritmos circadianos e que a comunicação intercelular entre neurônios e astrócitos é provavelmente efetuada através de junções comunicantes (Prosser et al., 1994; Tamada et al., 1998).
22 1.5 – O Sagui
Popularmente chamado de sagui, Callithrix jacchus é um membro do filo Chordata, classe Mammalia, ordem Primates, família Callithricidae. É um primata neotropical, frequentemente encontrado nos estados do Nordeste brasileiro (Vivo, 1991). Apresenta pequeno porte, medindo cerca de 30 cm de corpo e mais 17 cm de cauda, o que confere equilíbrio ao animal. O seu peso varia entre 230g a 420g. Como características diagnósticas da espécie apresentam tufos circum-auriculares brancos, mancha branca mediana presente na fronte; manto distinto estendendo-se até os ombros, terço posterior do dorso apresentando padrão estriado de coloração; ventre castanho escuro agrisalhado; cauda anelada, anéis cinza-claro estreitos e anéis negros-agrisalhados mais largos (Vivo, 1991). Costumam se alimentar de frutos, pequenos insetos, ovos de aves, aranhas, pequenos répteis, brotos de folhas, sementes e da goma de árvores. Os saguis apresentam o hábito diurno, e como os primatas, em geral são animais de orientação essencialmente visual, apresentando um sistema visual bem desenvolvido (Figura 1).
23 2. JUSTIFICATIVA
24 3. OBJETIVOS
3.1 – Objetivo Geral
Verificar a distribuição de neurônios, células gliais e terminais axônicos nos centros circadianos do sagui (Callithrix jacchus).
3.2 – Objetivos específicos
ü Delimitar os componentes centrais do STC do sagui;
ü Identificar neurônios imunorreativos a NeuN, bem como, células gliais imunorreativas a GFAP nos componentes centrais do STC do sagui.
ü Mapear a principal via de sincronização fótica do STC através da injeção da subunidade b da toxina colérica.
25 4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 – Animais
Neste estudo foram utilizados saguis adultos jovens provenientes do Núcleo de Primatologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN) (Licença do IBAMA Nº 1/24/92/0039-0). Neste local os animais são mantidos em gaiolas de alvenaria e tela de arame, medindo 2,00 x 1,00 x 2,00m, estando expostos a condições de temperatura, umidade e iluminações naturais, com alimentação a base de frutas e água disponível continuamente em bebedouros.
Foram utilizados seis animais, avaliado como o número mínimo possível para se obter os resultados esperados. Esses mesmos animais foram também utilizados em outros projetos de pesquisa. Todos os cuidados foram tomados durante o manuseio dos animais, buscando sempre seu bem-estar bem como minimizar ao máximo qualquer possível estresse e/ou sofrimento. Os procedimentos experimentais seguiram estritamente as normas estabelecidas pelo National Research Council of the National Academy, publicadas no livro “Guidelines for the Care and Use of Mammals in Neuroscience and Behavioral Research”. Uma versão em pdf está disponível gratuitamente no site da Sociedade Brasileira de Neurociências e Comportamento (SBNeC) – http:// www.sbnec.org.br/links. O trabalho foi submetido e aprovado pela Comissão de Ética no Uso Animal (CEUA) da UFRN sob o número 026/2010.
4.2 – Injeção de CTb
26 na junção esclero-corneal, atingindo o corpo vítreo a um ângulo de aproximadamente 45 graus. A solução foi injetada por pressão com o auxílio de uma micro-bomba em uma velocidade de 1µ l por minuto. Ao fim da injeção, a agulha permaneceu no local por 15 a 30 minutos a fim de evitar refluxo da solução.
4.3 – Perfusão
Após um período de sobrevida de sete dias, cada animal recebeu novamente a medicação pré-anestésica de cloridrato de tramadol e xilazina, ambos na dose de 5 mg/Kg por via intramuscular sendo induzidos e mantidos em anestesia inalatória com isoflurano e oxigênio 100% administrado através de máscara. Os animais foram colocados em decúbito dorsal sobre uma grade em uma capela de perfusão. Após certificar que os animais estavam profundamente anestesiados, foram iniciados os procedimentos cirúrgicos por volta das nove horas da manhã. Primeiramente, o processo xifóide do osso esterno foi pinçado com auxílio de uma pinça de Allis tracionando-o em direção à cabeça do animal, enquanto isso a pele foi seccionada bem como suas partes moles e costelas a fim de ter acesso ao coração dentro da cavidade torácica. Exposto o coração, uma agulha conectada a uma bomba peristáltica (Masterflex, Cole-Parmer, Niles, IL) foi introduzida no ápice do ventrículo esquerdo em direção a aorta ascendente, e em seguida realizou-se uma pequena incisão no átrio direito objetivando o escoamento do líquido do leito vascular. Inicialmente foram impulsionados 400 mL de solução salina a 0,9% em tampão fosfato 0,1M e pH 7,4, com Heparina (Hipolabor Laboratories, 5000UI/mL) na concentração de 2 ml/L de solução salina, em um fluxo de 100 mL por minuto em temperatura ambiente, objetivando lavar o leito vascular do animal, prevenir a formação de coágulos e uma melhor fixação dos tecidos. Posteriormente, foi impulsionado 700 mL de solução fixadora (paraformaldeído a 4% Vetec Química Fina, em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4) em duas velocidades. A metade da solução foi infundida em fluxo rápido (35 ml/min) e a outra metade em fluxo lento (17,5 ml/min), totalizando 30 minutos de infusão.
4.4 – Remoção do Encéfalo e Microtomia
27 foram armazenados em solução de sacarose a 30% (Nuclear-CAQ) em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4, a 4°C até a realização da microtomia.
Na microtomia os encéfalos foram congelados em gelo seco e seccionados através de um micrótomo de deslizamento. Foram obtidas secções coronais de 30μm, coletadas seriadamente em seis compartimentos contendo tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4. Cada compartimento continha um corte de cada sequência de seis, de modo que a distância entre uma secção e a seguinte no mesmo compartimento era de aproximadamente 180mm. As secções foram conservadas na solução supracitada a 4°C para a realização dos procedimentos subsequentes, ou em solução anti-congelante.
4.5 – Técnica imunoistoquímica
Os cortes foram submetidos a reações imunoistoquímicas seguindo o protocolo ABC (Complexo Avidina-Biotina peroxidase), utilizando anticorpos a fim de identificar corpos celulares, astrócitos ou terminais imunorreativos a: CTb, NeuN, GFAP, NPY e 5-HT.
28 secções foram colocadas em contato com o complexo avidina-biotina peroxidase (Kit ABC Elite, Vector Labs, Burlingame, CA, USA) a uma diluição 1:100 μl em Triton X-100 a 0,4% em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4 contendo cloreto de sódio (NaCl) em rotor com velocidade lenta por duas horas em temperatura ambiente. Ao fim dessa etapa, as secções foram novamente submetidas a quatro lavagens de 10 minutos em solução de tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4. Em seguida, as secções foram colocadas em contato com o cromógeno 3,3’, 4,4’– tetrahidrocloreto-diaminobenzidina (DABtetra) (Sigma, St Louis, MO, USA) a 2,5% diluída em tampão fosfato 0,1M, pH 7,4. Seguiu-se a reação final adicionando-se uma solução contendo peróxido de hidrogênio (H2O2) a 0,003% como substrato, obtendo-se da região marcada uma cor marrom resultante da oxidação da DAB. Esta última etapa foi realizada em uma capela de exaustão. Por fim, as seções foram submetidas novamente a quatro lavagens de 10 minutos com solução tampão fosfato 0,1M, pH 7,4.
29 Tabela 1: Anticorpos utilizados segundo as especificações técnicas dos fabricantes. Antígeno Anticorpo
Primário (AP) Anticorpo Secundário (AS) Soro Normal
Protocolo Cromógeno
CTb Anti-CTb obtido em cabra (1:5000,
List Biological Laboratories,
INC.)
Anti-cabra obtido em asno (1:5000,
Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)
Asno 2% ABC 2% DAB
NeuN Anti-NeuN obtido em camundongo
(1:1000μl, Chemicon International)
Anti-camundongo obtido em coelho (1:600µl, Jackson
ImmunoResearch Laboratories, Inc.)
Coelho 2%
ABC 2% DAB
GFAP Anti-GFAP obtido em camundongo (1:1000µl, Chemicon International) Anti-camundongo obtido em cabra (1:1000µl, Jackson
ImmunoResearch Laboratories, Inc.)
Cabra 2%
ABC 2% DAB
NPY Anti-NPY obtido em coelho (1:8000, Sigma
Chemical Company)
Anti-coelho obtido em asno (1:400,
Santa Cruz Biotechnology)
Asno 2% ABC 2% DAB
5-HT (Anti-5-HT obtido em coelho,
1:5000, Sigma Chemical Company)
Anti-coelho obtido em asno (1:400,
Santa Cruz Biotechnology)
30 4.6 – Método de Nissl
Para o estudo da citoarquitetura, foi realizada a coloração pelo método de Nissl usando a Tionina como corante. As secções foram lavadas em solução de tampão fosfato 0,1M, pH 7,4, posteriormente montadas em lâminas previamente gelatinizadas e postas para secar em temperatura ambiente por 48 horas. Após a secagem, as secções foram submetidas ao método de Nissl, que consiste na desidratação do tecido através da passagem deste em concentrações crescentes de alcoóis etílicos (70%, 95% e 100%), sendo posteriormente deslipidificados em xilol. Em seguida o tecido é reidratado em concentrações decrescentes de alcoóis e em água destilada e posteriormente submergido no corante Tioninaa 0,25%. Após passar pelo corante as secções foram novamente desidratadas e deslipidificadas e em seguida cobertas com lamínulas utilizando como meio de montagem DPX (Aldrich Milwaukee, WI). O método de Nissl possibilita a visualização de neurônios e diminutos corpos celulares de células gliais.
4.7 – Análise dos Resultados
31 5. RESULTADOS
5.1 – Citoarquitetura do Núcleo Supraquiasmát ico e do Núcleo Pré-Geniculado
5.1.1 Método de Nissl
Verificamos que a coloração pelo método de Nissl permitiu adequada visualização do NSQ como uma estrutura distinta no hipotálamo anterior, destacando-se por uma maior afinidade das suas células à tionina, em toda a extensão rostro-caudal, em comparação aos grupamentos celulares adjacentes no hipotálamo apresentando um formato triangular (Figura 2A-C). Nas secções coronais ao nível do complexo geniculado lateral do tálamo, identificamos o NPG como um grupamento neuronal em forma de cunha circundando dorsomedialmente o GLD em toda a extensão rostro-caudal (Figura 2D-F). No nível mais rostral é notável a presença de diferentes populações neuronais no NPG que o caracteriza como uma estrutura subdividida em duas lâminas (Figura 2D).
5.1.2 Proteína Nuclear Neuronal Específica (NeuN)
Observamos que a imunorreatividade à NeuN se mostrou presente dentro dos limites do NSQ nos três níveis de secção (Figura 3A-C). As células estão agrupadas em duas porções, uma dorsal e uma ventral ao longo do eixo rostro-caudal (Figura 3D-F). As subdivisões do NSQ são bem evidenciadas no nível mais caudal (Figura 3C e F). Pudemos verificar a presença de uma maior intensidade de marcação no citoplasma dos neurônios da região dorsal. Os neurônios da região ventral apresentam uma marcação citoplasmática menos intensa.
32 distribuídos entre os neurônios esféricos. O segundo e terceiro tipos representaram a população neuronal mais abundante dentro do NPG (Figura 4D-F).
5.1.3 Proteína Acídica Fibrilar Glial (GFAP)
Células gliais mostraram-se imunorreativas a GFAP em toda a extensão do NSQ (Figura 5A-C). As células imunorreativas a GFAP apresentam morfologia estrelada caracterizando a presença de astrócitos em todo o núcleo (Figura 5D-F). É notável uma maior imunorreatividade nos níveis rostral e médio do núcleo (Figura 5B e E).
A imunorreatividade à GFAP mostrou-se presente em todos os níveis de secções (Figura 6A-C). A morfologia estrelada, característica dos astrócitos, pode ser visualizada nos três níveis de secção ampliados (Figura 6D-F). Encontramos uma alta concentração de vasos sanguíneos nessa região e um respectivo aumento da densidade celular em torno destes.
5.2 – Projeção Retiniana ao Núcleo Supraquiasmát ico e ao Núcleo Pré-Geniculado
O NSQ apresentou uma densa inervação, proveniente da retina, marcada por fibras/terminais imunorreativos a CTb na região ventral nos três níveis de secção (Figura 7A-F). A imunorreatividade a CTb está presente em ambos os hemisférios cerebrais, contudo apresenta-se predominante no hemisfério contralateral ao olho injetado (Figura 7A-C).
33 5.3 – Neuropeptídio Y (NPY) e Serotonina (5-HT) no Núcleo Supraquiasmático e Núcleo Pré-Geniculado
Notamos a presença de fibras/terminais imunorreativas a NPY ao longo do eixo rostro-caudal do NSQ (Figura 9A-C) com predominância na região ventral deste. A imunorreatividade contra 5-HT mostrou-se predominante na região dorsal do NSQ (Figura 9D-E).
Encontramos neurônios imunorreativos a NPY, bem marcados (Figura 10D-F) e concentrados apenas na lâmina interna do NPG (Figura 10A-C). As fibras foram visualizadas em toda extensão desta (Figura 10C-F).
35
A
B
C
F
E
D
3v
qo GLD
3v
3v qo
qo
GLD
GLD NSQ
APM
NPG
APM
NSQ
NSQ
NPG
39
E
GLD
GLD
GLD
A
B
C
F
D
NPGli
NPGle NPGli
NPGle NPGli
45
A
B
C
F
E
D
3v
qo
3v
3v qo
qo
3v
qo
3v
3v
qo
qo
47
A
B
C
F
E
D
GLD GLD
GLD
GLD GLD
GLD
Contralateral
CTb Ipsilateral
NPGli
NPGli
NPGli NPGli
NPGli
NPGli
NPGle NPGle
NPGle NPGle
51
A
B
C
F
E
D
GLD GLD GLD
NPY
NPGli NPGle
NPGli NPGle
NPGli
53
A
B
C
GLD GLD GLD
5-HT
NPGli
NPGle
NPGli NPGle
NPGli
54 6. DISCUSSÃO
O estudo do sistema de temporização circadiana foi iniciado na década de 1970 a partir de experimentos que promoviam lesões no marcapasso circadiano e de estudos realizados com a utilização de traçadores neuronais a fim de identificar as principais vias para o mesmo. Nesse estudo, identificamos nos componentes centrais desse sistema, neurônios morfologicamente distintos e com padrão imunorreativo diferenciado, astrócitos caracterizados por sua morfologia estrelada, além de fibras/terminais axônicos em áreas específicas.
6.1 – Citoarquitetura
6.1.1 Nissl
Baseado na técnica de Nissl, o NSQ do sagui caracteriza-se como uma estrutura com forma seccional triangular ao longo do eixo rostro-caudal com células densamente agrupadas e fortemente coradas com tionina localizadas no hipotálamo anterior, acima do quiasma óptico, bilateralmente ao terceiro ventrículo. A localização do NSQ nesta espécie de primata está em conformidade com a localização padrão vista anteriormente em Callithrix jacchus (Costa et al., 1998), Cebus apella (Nascimento et al., 2010), Arvicanthis
niloticus (Smale e Boverhof, 1999), Octodon degus (Goel et al., 1999) e outras espécies de
mamíferos (Lydic et al., 1982; Cassone et al., 1988), sugerindo que o NSQ, nesta classe, é uma estrutura neural filogeneticamente estável.
Os corpos celulares dos neurônios do NSQ são relativamente pequenos com aproximadamente 10µm e são distinguidos nas subdivisões por seu conteúdo neuroquímico (ver Welsh et al., 2010). O acoplamento das subdivisões do NSQ (ventrolateral e dorsomedial) é necessário para a geração de um ritmo sincronizado dentro deste e para o ajuste as pistas externas (Noguchi e Watanabe, 2008). Dessa forma, os neurônios oscilatórios deste núcleo atuam controlando uma série de sistemas efetores incluindo aqueles que regulam o ciclo de atividade e repouso, a temperatura corporal, a função neuroendócrina e o desempenho psicomotor.
55 dorsomedialmente o GLD. Esse núcleo apresenta neurônios com morfologia diferenciada assemelhando-se a morfologia celular encontrada nos componentes do complexo geniculado lateral do tálamo de roedores. Estudos pioneiros descrevem três tipos neuronais no NPG com relação à coloração pelo método de Nissl: um grande número de neurônios pequenos e fusiformes, um pequeno número de neurônios grandes com citoplasma fortemente marcado, e por fim, um número moderado de neurônios médios e multipolares com poucos grânulos de Nissl (Polyak, 1957). O primeiro e terceiro tipos são encontrados na lâmina interna e o segundo tipo somente na lâmina externa (Niimi et al., 1963). Babb (1980) descreve em Macaca mulatta a presença de neurônios esféricos na lâmina interna, neurônios ovóides em
ambas as lâminas e neurônios poligonais na lâmina externa. Em nosso estudo, o NPG do sagui apresenta-se semelhante quanto a variação morfológica das células anteriormente descritas (Babb, 1980). Quanto a localização padrão, nossos dados corroboram com estudos anteriores em Callithrix jacchus (Costa et al., 1998), humanos (Moore, 1993), Macaque monkey (Moore, 1993), Macaca fascicularis (Livingston e Mustari, 2000) e Cebus apella
(Nascimento et al., 2010).
6.1.2 – Proteína Nuclear Neuronal Específica (NeuN)
NeuN é considerada uma proteína nuclear específica do sistema nervoso e tem sido usada em um grande número de estudos (Mullen et al., 1992; Gittins e Harrison, 2004; Preusser et al., 2006). A imunorreatividade à NeuN pode ser detectada em várias espécies de vertebrados, incluindo anfíbios, pássaros e mamíferos sugerindo uma considerável conservação desta proteína na escala filogenética (Lind et al., 2005).
56 que apresentam níveis detectáveis desta proteína estão agrupados na porção ventral do NSQ e co-localizam com a Doublecortin, uma proteína associada a microtúbulos que participa dos processos de diferenciação e migração neuronal (Friocourt et al., 2003) e, assim como NeuN, esta é considerada um marcador de estágios da neurogênese (Geoghegan e Carter, 2008).
É evidente que os neurônios imunorreativos a NeuN na porção ventral do NSQ neste primata estão agrupados na região retinorrecipiente indicando a participação destes neurônios no processo de recepção de informação fótica.
Com relação à marcação celular de NeuN no NPG, este pôde ser caracterizado como uma estrutura bilaminar, apresentando duas camadas distintas: uma lâmina externa (NPGle) e outra interna (NPGli). Ambas as lâminas apresentam forte imunorreatividade a NeuN ao longo do eixo rostro-caudal. Essa subdivisão do NPG em lâminas interna e externa corrobora com os achados em Macaca mulatta (Babb, 1980). A presença de neurônios grandes e poligonais exclusivamente na lâmina externa e de neurônios pequenos esféricos e fusiformes na lâmina interna permitiu distinguir nitidamente essas duas regiões, corroborando com achados anteriores (Niimi et al., 1963). Considerando a presença dessas células, notamos que a morfologia neuronal da lâmina externa se assemelha as das células presentes no GLV de roedores e que a lâmina interna possui células que lembram o aspecto descrito para o FIG e corroboram com estudos anteriores, em que o NPG dos primatas teria o equivalente ao GLV e ao FIG dos roedores (Moore, 1993). Em roedores, o GLV e o FIG apresentam neurônios fortemente imunorreativos a NeuN dificultando a delimitação dessas estruturas (dados não publicados). Já em Cebus apella, a imunorreatividade contra essa proteína neuronal é ausente no NPG, mas os neurônios do GLD exibem forte imunorreatividade à NeuN (Nascimento et al., 2010).
57 Embora NeuN tenha sido identificada em grande parte das células nervosas, existem neurônios NeuN negativos incluindo os neurônios Cajal-Retzius da camada 1 do córtex cerebral em desenvolvimento, o núcleo olivar inferior no bulbo, as células mitrais no bulbo olfatório, as células de Purkinje e o núcleo denteado no cerebelo (Sarnat et al., 1998; Kumar e Buckmaster, 2007). Além disso, NeuN não é expressa em células da glia (Mullen et al., 1992). Estudos em humanos levam a crer que a falta de imunorreatividade para NeuN por
neurônios do núcleo olivar inferior e núcleo denteado cerebelar sugere uma origem embrionária comum com as células de Purkinje a partir do tubérculo cerebelar. Apesar disso, os neurônios pontinos basais que apresentam mesma origem embrionária dos grupamentos supracitados exibem forte imunorreatividade à NeuN durante o desenvolvimento e na idade adulta (Sarnat et al., 1998). Esta diferença sugere que talvez a expressão de NeuN não apresente tanta influência em relação a origem embrionária, mas sim em outros aspectos celulares. Estudos relatam que a imunorreatividade à NeuN é modulada por sinais fisiológicos e patológicos como despolarização crônica da célula e lesões em nervos e tratos (Weyer e Schilling, 2003; McPhail et al., 2004).
Um estudo a nível molecular, documenta que NeuN apresenta duas isoformas eletroforeticamente distinguíveis de 46 KDa e 48KDa e ambas as isoformas podem ser encontradas no núcleo celular e citoplasma, porém a abundância nestes compartimentos é distinta podendo existir pelo menos sete diferentes formas fosforiladas da proteína NeuN, onde a imunorreatividade desta depende do estado de fosforilação visto que um grupamento fosfato é crítico para a adequada formação do epítopo a ser reconhecido pelo anticorpo (Lind et al., 2005).
58 Fox-3 também chamada de proteína 3 ligante de hexarribonucleotídeo (hexaribonucleotide-binding protein 3 e D11Bwg0517e), um membro da família do gene Fox-1 que se liga especificamente a um elemento de RNA, UGCAUG. Fox-1 também chamada de proteína 1 ligante de ataxina-2 (A2BP1, ataxin-2 binding protein 1) é expressa em neurônios e músculos estriados, enquanto que a expressão de Fox-3 é restrita aos neurônios (ver Kuroyanagi, 2009). Um estudo recente sugere que NeuN/Fox-3 esteja transitando entre o nucleoplasma e a matriz nuclear sendo este um componente intríseco da matriz nuclear neuronal (Dent et al., 2010).
59 6.1.3 – Proteína Acídica Fibrilar Glial (GFAP)
Os astrócitos são células que apresentam funções essenciais no sistema nervoso como a regulação das concentrações iônicas de cálcio e potássio, bem como a liberação de substâncias nos espaços extracelulares em resposta a neurotransmissores (Bowman e Kimelberg, 1984; Barbour, et al., 1989; Nowak, et al., 1987; Van den Pol 1991; Zou et al., 2010). Além de fornecerem suporte para a migração dos neurônios e crescimento dos axônios, fatores secretados a partir dessas células gliais podem regular a diferenciação neuronal (Blondel et al., 2000).
GFAP é um marcador exclusivo para astrócitos (Eng et al., 1971; Bignami et al., 1972). Em nosso estudo pudemos observar a presença de astrócitos por toda a extensão
do NSQ através da imunorreatividade contra GFAP não nos permitindo maiores subdivisões. Nossos dados assemelham-se aos de um estudo anterior em hamster onde a imunorreatividade à GFAP foi observada em todo o NSQ desses roedores (Inoue et al., 2000) . Estudos anteriores em ratos mostram que um grande número de astrócitos está distribuído particularmente na porção ventral do NSQ entre neurônios e capilares sanguíneos (Güldner e Wolff, 1973) e a proporção entre o número de neurônios e astrócitos no NSQ nesses animais é de 1:3 (Güldner, 1983). Outros dados em ratos mostram uma forte expressão de GFAP na porção ventrolateral do NSQ, visto que a porção dorsomedial deste apresenta uma menor densidade de células imunorreativas a GFAP (Tamada et al., 1998; Inoue et al., 2000; Mendonça et al., 2004). Dados apontam que diferenças regionais na quantidade de GFAP em astrócitos dependem primariamente no nível de expressão gênica (Kitamura et al., 1987) e que a expressão de GFAP no NSQ em ratos pode ser afetada por mal nutrição crônica (Mendonça et al., 2004). Além disso, estudos em ratos e hamsteres apontam que o desenvolvimento dos astrócitos no NSQ é estimulado por inervação do TRH, e a presença do polipeptídeo pituitário ativador da adenilato ciclase (PACAP) encontrado nas células ganglionares da retina pode estimular a expressão de GFAP em astrócitos hipotalâmicos (Lavialle e Servière, 1994; Munekawa et al., 2000; Ikeda et al., 2003). Estudos em ratos (Hajós, 2008) e em camundongos (Santos et al., 2005) evidenciam variação circadiana na expressão da proteína no NSQ destes.
61 6.2 – Projeção Retiniana
A CTb tem sido amplamente utilizada como um traçador neuronal altamente sensível em diversos estudos (Ericson e Blomqvist, 1988; Mikkelsen, 1992; Schimizu et al., 1994; Nakagawa et al., 1998; Costa et al., 1998; 1999; Cavalcante et al., 2005; Engelberth et al., 2008; Nascimento Jr et al., 2010; Cavalcante et al., 2011). Um fator comum no NSQ de todos os mamíferos estudados é a inervação bilateral pelas células ganglionares da retina. Contudo, diferenças entre as espécies são notadas quanto à intensidade de distribuição das fibras nos dois lados. Dessa forma, pudemos observar que a projeção da retina para o NSQ no sagui exibe uma assimetria bilateral através da presença de terminais do TRH imunorreativos a CTb na região ventral do núcleo, ao longo do eixo rostro-caudal, com predominância contralateral. Nossos dados corroboram com achados anteriores em Callithrix jacchus (Costa et al., 1998; 1999; Cavalcante et al., 2002). Outros estudos apontam a projeção retiniana assimétrica para o NSQ com predominância contralateral em diversas espécies como macaco rhesus (Hendrickson et al., 1972; Moore, 1973), Saguinus oedipus (Moore, 1973), macaco de cheiro (Tigges e O´Steen, 1974), rato (Johnson et al., 1988; Levine et al., 1991), gato (Murakami et al., 1989), Arvicanthis niloticus (ver Smale e Boverhof, 1999) e Cebus apella (Pinato et al.,
2009). Em uma espécie diurna de esquilo, Spermophilus lateralis, a projeção retiniana é descrita como sendo exclusivamente contralateral (Smale et al., 1991). Diferentemente dos nossos achados, a projeção da retina ao NSQ em mussaranho exibe uma discreta predominância ipsilateral (Tokunaga et al., 1992) assim como em chimpanzé (Tigges e O´Steen, 1974) e completamente simétrica ou predominantemente ipsilateral em ovelhas (Tessonneaud et al., 1994). Já em hamster a projeção retiniana é descrita com predominância ipsilateral no nível rostral e simétrica no nível caudal (Pickard e Silverman, 1981), aproximadamente simétrica (Johnson et al., 1988; Youngstrom et al., 1991) ou mesmo uma assimetria contralateral (Yellon et al., 1993). O significado da variabilidade no padrão de distribuição da projeção retiniana no NSQ ainda é desconhecido. É possível que essas diferenças possam refletir variações individuais e metodológicas. Costa et al. (1999) sugere que a assimetria contralateral ou ipsilateral seja produto da captação seletiva do traçador por parte de determinados grupos de células ganglionares da retina nas diferentes espécies.
63 6.3 – Neuropeptídeo Y (NPY)
Em nosso estudo pudemos visualizar terminais imunorreativos a NPY na porção ventral do NSQ que corrobora com estudos anteriores em Callithrix jacchus onde terminais do TGH, demonstrados por fibras imunorreativas a NPY foram visualizadas na porção ventral do núcleo (Costa et al., 1998). Esse denso plexo de finas fibras imunorreativas a NPY se sobrepõe à zona de terminação do TRH. Um estudo anterior em Cebus apella evidencia que fibras imunorreativas a NPY estão esparsamente distribuídas no NSQ e não mostram uma típica regionalização ventral dentro do núcleo (Pinato et al., 2007) que difere dos dados em rato (ver Moore et al., 2002; Morin et al., 2006; Ueda et al., 1986), Macaca mulata (Moore, 1989). Em humanos foi identificada uma população de neurônios imunorreativos a NPY na porção central do NSQ diferindo do padrão encontrado em outros primatas e roedores (Moore, 1993).
No complexo geniculado lateral do tálamo de roedores, neurônios imunorreativos a NPY são encontrados por todo o FIG, poucos estão presentes no GLV, e no GLD a imunorreatividade a esse peptídeo é ausente. Os neurônios NPY positivos, bem como, um moderado plexo de fibras estão presentes por toda a extensão rostrocaudal do FIG. Em relação à imunorreatividade a NPY nos outros componentes do complexo geniculado lateral do tálamo, existem ocasionais axônios no GLV e axônios esparsos no GLD (Moore e Card, 1994). Nossos dados apontam à presença neurônios imunorreativos a NPY na lâmina interna do NPG, bem como um moderado plexo de fibras e terminais nessa região que praticamente não se projetam à NPGle. Nossos dados concordam com um estudo anterior em Callithrix jacchus que aponta a presença de neurônios NPY positivos no NPG (Costa et al., 1998). Um
64 6.4 – Serotonina (5-HT)
As fibras serotoninérgicas da rafe mesencefálica formam um denso plexo dentro do NSQ de roedores em contraste a áreas hipotalâmicas adjacentes (Card e Moore, 1984; Morin et al., 1992). Em camundongos, hamsters e gatos, as fibras serotoninérgicas formam um plexo
ventral no NSQ. Em humanos o plexo serotoninérgico apresenta um padrão semelhante ao descrito em roedores. Estudos pioneiros em Callithrix jacchus mostram que a distribuição das fibras serotoninérgicas é complexa constituindo um denso plexo de fibras finas que preenchem o núcleo principalmente nas áreas central e dorsal deste (Costa et al., 1998; Cavalcante et al., 2002; Pinato et al., 2007). Neste estudo observamos fibras imunorreativas a 5-HT distribuídas principalmente na porção dorsal e medial do NSQ próximas a parede do terceiro ventrículo. Esse padrão de imunorreatividade parece diminuir ao longo do eixo rostro-caudal. É interessante observar que as fibras serotoninérgicas estão ausentes na região ventral do NSQ nesta espécie, corroborando com dados anteriores em Callithrix jacchus (Costa et al., 1998; Cavalcante et al., 2002; 2011) e diferindo da distribuição vista em Cebus apella onde as fibras serotoninérgicas apresentam-se esparsas e não mostram uma
regionalização particular concordando com os dados para ovinos, onde as fibras serotoninérgicas são esparsamente distribuidas por todo o núcleo (Tillet et al., 1989).
65 7. CONCLUSÕES
Diante dos dados apresentados podemos considerar que a técnica de Nissl evidencia adequadamente as estruturas centrais do STC em Callithrix jacchus. Como esperado, o NSQ e o NPG do sagui exibe um padrão citoarquitetônico já descrito previamente com células gliais e neuronais fortemente coradas.
Os neurônios são claramente observados através da imunoistoquímica à NeuN que permitiu a visualização das subdivisões tanto do NSQ quanto do NPG, através do caráter morfológico e do padrão imunorreativo das células.
O padrão de distribuição dos terminais retinianos na região ventral do NSQ e na lâmina interna do NPG foi evidenciado pela imunorreatividade a CTb, com predominância contralateral em ambas as estruturas. O TGH pôde ser evidenciado pela presença de neurônios imunorreativos a NPY no NPG e terminais no NSQ que se sobrepõem aos terminais do TRH na região ventral.
Os astrócitos, identificados através da expressão de GFAP, estão presentes em grande densidade e distribuídos por toda a extensão das estruturas centrais do STC do sagui, não permitindo maiores subdivisões das estruturas, diferindo do padrão de distribuição dos neurônios.
A distribuição das fibras serotoninérgicas no NSQ do sagui apresenta um padrão peculiar diferindo daquele encontrado em outros mamíferos, visto que a região ventral é caracterizada pela ausência dessas fibras. Já no NPG a presença dessas fibras em todo o núcleo indica a participação da serotonina no processo de ritmicidade biológica.
67 _____________________________________
* Normas técnicas de acordo com o periódico internacional The Journal of Comparative Neurology. 8. REFERÊNCIAS*
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