The role of acidity and organic modifiers in the methylxanthines determination: a HPLC experiment.

Educação

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EFEITO DA ACIDEZ E DE MODIFICADORES ORGÂNICOS NA DETERMINAÇÃO DE METILXANTINAS: UM EXPERIMENTO DE CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE) EMPREGANDO OTIMIZAÇÃO UNI E MULTIVARIADA

Nádia Machado de Aragão

Departamento de Química e Exatas, Campus de Jequié, Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia, Av. José Moreira Sobrinho, s/n, 45206-510 Jequié – BA, Brasil

Márcia Cristina da Cunha Veloso e Marcia Sousa Bispo

Departamento de Química, Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia, 40625-650 Salvador-BA, Brasil Jailson Bittencourt de Andrade*

Instituto de Química, Universidade Federal da Bahia, Campus de Ondina, 40170-115 Salvador-BA, Brasil

Recebido em 10/11/08; aceito em 24/5/09; publicado na web em 19/11/09

THE ROLE OF ACIDITY AND ORGANIC MODIFIERS IN THE METHYLXANTHINES DETERMINATION: A HPLC EXPERIMENT. In this work a new experiment using HPLC is proposed in order to explore the role of acidity and the organic modiiers in the determination of methylxanthines in tea and coffee. Multivariate and univariate optimizations of the experimental conditions were used. Keywords: methylxanthines; HPLC; caffeine.

INTRODUÇÃO

Até o inal da década de 70 a cromatograia liquida de alta eici-ência (CLAE) era pouco utilizada no Brasil, tornando-se mais popular a partir do desenvolvimento de novas fases estacionárias, como a fase reversa quimicamente ligada, que associadas ao uso de eluição gradiente e ao desenvolvimento de detectores mais seletivos e sensí-veis, tornou possível a separação de uma gama de substâncias a partir de matrizes complexas como alimentos, luidos biológicos e solo.1-3

A atual importância da técnica pode ser facilmente reconheci-da pelo enorme número de publicações cientíicas que tratam do desenvolvimento do método e, principalmente, da sua utilização. Os importantes avanços da CLAE devido ao seu acoplamento à espectrometria de massas (CLAE-EM) e à diminuição do seu custo operacional, fazem com que seja amplamente utilizada tanto em laboratórios de pesquisa e de análises clínicas, como em complexos industriais. Em vista dessa grande aplicação, torna-se cada vez mais importante que a mesma seja abordada nos cursos técnicos e de graduação em Química e áreas ains.

Um grupo de substâncias que se adequa facilmente a experi-mentos voltados para o treinamento hands on são as metilxantinas, que são alcaloides naturalmente presentes em plantas utilizadas na obtenção de bebidas alimentícias ou estimulantes consumidos em todo o mundo.4-6

As metilxantinas são originárias de bases púricas, sendo deriva-dos metiladeriva-dos da 2,6-dioxipurina ou xantina. De modo geral, estas substâncias possuem uma estrutura básica onde os hidrogênios nas posições 1,3 e 7 são trocados por substituintes metílicos, sendo as mais abundantes a cafeína (1,3,7- trimetilxantina), e as isoméricas teoilina (1,3-dimetilxantina) e a teobromina (3,7-dimetilxantina)6

(Figura 1). Entretanto, podem também possuir um caráter anfótero, comportando-se como ácidos ou bases em função do pH, como no caso da teoilina e da teobromina que possuem, respectivamente, um hidrogênio ácido ligado ao nitrogênio do anel do imidazol e ao nitrogênio imídico do anel de seis membros.7

Neste trabalho é proposto um experimento de CLAE no qual é possível comparar a inluência de diferentes fases móveis e da acidez, utilizando técnicas de planejamento univariado e/ou multivariado. Os modiicadores orgânicos utilizados foram metanol (considerado um bom eluente para CLAE devido a sua baixa viscosidade) e etanol, pela sua característica biorrenovável. As amostras utilizadas foram chás e café adquiridos no mercado local, que não trazem riscos para o meio ambiente ou para a saúde do aluno.

PARTE EXPERIMENTAL

Equipamentos e materiais

Cromatógrafo a líquido de alta eiciência, Perkin Elmer série 200 equipado com injetor Rheodyne (Cotati, Califórnia, USA) com loop de 20 µL; detector UV-Visível modelo Perkin Elmer série 200; coluna cromatográica Lichrospher 100 RP-18 (244 x 4,4 mm, d.i. 5 µm), acoplada com pré-coluna Lichrospher (4 x 4 mm). Aparelho digital de ponto de fusão, Microquímica – MQAPF-301; iltros de celulose (Whatman 41, 0,45 µm); balança analítica Sartorius A 120 s; sistema de iltração Millipore para solventes orgânicos HA, 0,45 µm; ultrapuriicador de água, Nanopure Diamond, Barnstesd Modelo D11911; freezer.

Reagentes e solventes

Metanol, etanol, acetonitrila (grau cromatográico, 99,9%) e ácido acético glacial foram obtidos da Merck. Cafeína (Carlo Erba, Milão, Itália) puriicada por sublimação8 _{(uma alternativa para obtenção de}

cafeína é extração a partir de folhas chá preto com diclorometano, e puriicação por sublimação);9 _{teobromina (M&B) puriicada por}

recristalização; teoilina (Sigma-Aldrich) puriicada por recristali-zação (esta pode ser obtida também a partir de fármacos comerciais, tais como broncodilatadores, por meio de extração com solventes). Preparação de soluções padrão

Solução padrão estoque foi preparadas, pesando-se 0,040 g de cada metilxantina (cafeína, teobromina e teoilina)e dissolvendo-se em 50 mL de uma mistura: água/etanol/ácido acético (75/24/1% v/v/v). Após completar o volume para 200 ml em balão volumétrico, a solução foi iltrada em membranas de 0,45 µm ou em papel Whatman 41 (iltro duplo). Estas soluções se estocadas sob refrigeração são estáveis por 8 meses. A partir das soluções padrão estoques, foram preparadas soluções de trabalho mistas com as três metilxantinas na faixa de 2-30 µg mL-1_.

Preparo da fase móvel

Sugere-se preparar pequenos volumes de fase móvel (FM) uma vez que é utilizado o sistema de eluição isocrático e que as mesmas podem ser recicladas. As FM a serem testadas podem ser preparadas em provetas. As FM devem ser iltradas e desgaseiicadas.

Atenção: durante a preparação da FM os componentes deve-rão ser medidos separadamente e só depois misturados, uma vez que não é correto medir o volume de um dos componentes em uma proveta e depois avolumar com o segundo componente, na mesma proveta. A ação de forças intermoleculares10 _{pode levar à}

contração do volume. Preparo das amostras

Para as amostras de chás, foram feitas infusões, em 150 mL de água fervente, de quantidades informadas na embalagem (geralmente, um saco pequeno), visando reproduzir as condições mais comuns de consumo. Para as amostras de café, cerca de 1,0 g de café solúvel (aproximadamente uma colher de chá) foi dissolvido em 150,0 mL de água fervente. Os extratos obtidos, após iltração, foram injetados diretamente no sistema cromatográico.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Na otimização de métodos de análise por cromatograia, uma das metas é o equilíbrio entre o menor tempo de análise e uma melhor resolução. A resolução, R_s, é a medida quantitativa da separação de dois picos adjacentes, sendo calculada a partir da Equação 1: R_s = 2∆_{t / (tw}

1 + tw 2) (1)

onde: ∆_{t é a medida da separação dos máximos de dois picos}

ad-jacentes; e tw₁ e tw₂ são as larguras das bases dos picos, obtidas tangenciando-se as gaussianas até que interceptem a linha base.

Quando R_s = 1,0, os dois picos estão, razoavelmente, separados e quanto maior o valor de R_s, melhor será a separação entre picos de substâncias que eluem seguidamente. Na Figura 2 estão representados os parâmetros utilizados no cálculo da resolução R_s entre dois picos cromatográicos.1,11

Deste modo, duas respostas analíticas, para estudos de otimiza-ção de um método, podem ser consideradas: R_s (resolução croma-tográica entre dois analitos, que no caso deste experimento são as metilxantinas isoméricas teobromina e teoilina) e R_s/tA (resolução cromatográica (R_s) entre teobromina e teoilina em função do tempo total de análise( tA)).

A resolução cromatográica é inluenciada por três parâmetros experimentais: N (número de pratos teóricos ou eiciência), k (fator de retenção) e α _{(seletividade) conforme Equação 2}1_:

R_s = N1/2 _{/ 4 [k}

2 / (k2 + 1)] [(α - 1) / α] (2)

Otimização univariada do fator de retenção (k) na separação das metilxantinas por CLAE-fase reversa (FR)

A força cromatográica da FM está relacionada à fase estacionária utilizada e sua modulação é feita empiricamente, partindo-se, normal-mente de uma fase móvel com força elevada. Considerando-se que o experimento proposto foi realizado utilizando-se uma mesma coluna com fase estacionária ligada apolar (onde o fator N não será alterado), começou-se com uma proporção elevada do solvente menos polar, que no caso foi o modiicador orgânico (metanol ou etanol). Assim, podem-se testar várias proporções entre modiicadores orgânicos e água na separação das metilxantinas.

Inicialmente a fase móvel metanol:água (40:60 ; v/v), pH aparente 6,14, foi utilizada na separação e quantiicação de cafeína em amostras de chás e café.12 _{Entretanto, no caso de misturas de metilxantinas,}

esta fase móvel permite uma boa separação de cafeína, mas não consegue separar as metilxantinas isoméricas teoilina e teobromi-na, que coeluem (Figura 3). Nesse sentido, foi feita a tentativa de diminuir a força cromatográica da FM, diminuindo-se a proporção do modiicador orgânico.

A mudança da composição da fase móvel para metanol:água (30:70 ; v/v), ou metanol:água (20:80 ; v/v) não alterou o peril do cromatograma, resultando apenas em aumento nos tempos de reten-ção das substâncias13 _{(Figura 3). Portanto, a alteração do fator k não}

melhorou a resolução cromatográica entre as duas metilxantinas isoméricas. Partiu-se então para a otimização da seletividade (α). Otimização univariada da seletividade (α)

Efeito do pH na separação das metilxantinas por CLAE-FR Devido à possibilidade de protonação das metilxantinas, re-sultando em espécies iônicas estabilizadas por efeitos indutivos e ressonantes, pode-se sugerir que o aumento da acidez da fase móvel pode inluir na separação.13

Para avaliar a inluência do pH foi escolhido o ácido acético por suas características não tóxicas e pouco agressivas ao sistema de CLAE. A alteração da composição da fase móvel metanol:água (20:80; v/v) para metanol:água:ácido acético (20:79:1; v/v/v) resultou num pH<4, não havendo uma boa resolução entre as metilxantinas isoméricas (Figura 4).

Utilizando-se a fase móvel metanol:água:ácido acético (20:75:5; v/v/v), à vazão de 1,0 mL min-1_{, foi possível separar as três}

metilxanti-nas, em um tempo de análise de 14 min (Figura 4), revelando o efeito positivo da acidez da fase móvel na separação das metilxantinas, especialmente as isoméricas que apresentaram R_s = 2.

Adicionalmente, pode ser observado na Figura 4 que as metilxan-tinas isoméricas, que se comportam como bases fracas, eluiram numa ordem que está de acordo com as suas características estruturais. De acordo com a relação sigmoidal entre k versus pH para bases fracas, os k diminuem com a diminuição do pH das FM. A teobromina é mais básica que a teoilina, devido ao efeito eletroindutor do grupo metil presente no anel imidazólico. Deste modo, em meio ácido a teobromina (com constante de protonação em solução aquosa igual a log K= 10,5)14

encontra-se mais ionizada que a teoilina (com constante de protonação em solução aquosa igual a log K= 8,6)14_{, e como foi usada uma fase}

estacionária apolar (fase reversa), a teobromina elui antes da teoilina.

Efeito do modiicador orgânico

Como modiicador orgânico foi escolhido o etanol por ser de baixa toxicidade e proveniente de fontes renováveis, mantendo-se a vazão de 1,0 mL min-1 _{e a mesma composição da fase móvel:}

etanol:água:ácido acético (20:75:5; v/v/v). A troca de metanol por etanol reduziu signiicativamente o tempo total de análise cromato-gráica de 14 para cerca de 6 min (Figura 5) sem perda signiicativa na resolução cromatográica das metilxantinas isoméricas (R_s=1,0).

Considerando-se que, neste caso, a etapa crítica de resolução foi entre a teoilina e teobromina, a relação R_s/tA foi de 0,14 quando o modiicador orgânico foi o metanol, ao passo que quando o etanol foi utilizado a relação R_s/tA passou para 0,18 revelando que, nas condições deste trabalho, o etanol foi o melhor modiicador orgânico. Otimização multivariada

O uso de planejamento multivariado tem sido bastante difundido em várias técnicas analíticas15-18 _{e foi aplicado para obter as condições}

otimizadas de composição (etanol:água:ácido acético) e vazão da fase móvel, na separação de metilxantinas em amostras complexas.

O planejamento fatorial completo em três níveis é um modelo matemático que descreve superfícies de respostas curvas, permitindo, já no planejamento fatorial, a obtenção dos pontos que produzem melhores respostas analíticas (valores otimizados). Assim, o plane-jamento fatorial completo em três níveis, para otimização de duas variáveis, torna-se mais simples e rápido quando comparado a outros planejamentos, além de requerer um número reduzido de experimen-tos (n= 9 experimenexperimen-tos).15-18

Dessa forma pode ser estudada a inluência das seguintes vari-áveis: acidez da fase móvel (em diferentes concentrações de ácido acético) e vazão da fase móvel. Os níveis máximos e mínimos de acidez e vazão da fase móvel estão representados nas Tabelas 1 e 2. A resposta que se desejou otimizar foi a resolução cromatográica entre as três metilxantinas, partindo-se como padrão uma composição previamente estabelecida (etanol:água:ácido acético).17 _{Os resultados}

deste planejamento foram avaliados usando análise de variância (ANOVA) e foram processados empregando-se o programa compu-tacional Estatística 5.5.19

Otimização da acidez e vazão da fase móvel

Considerando-se o tempo como um fator relevante em qual-quer análise química, nos estudos de otimização foi considerada Figura 3. Separação de metilxantinas utilizando metanol (MeOH) e água

como fase móvel

Figura 4. Separação de metilxantinas utilizando metanol, água e ácido acético (AcOH) como fase móvel

a resposta analítica R_s/tA. No estudo da acidez da fase móvel, diferentes concentrações de ácido acético foram usadas (Tabelas 1 e 2). Para as concentrações de ácido acético descritas na Tabela 1, os resultados em termos de gráico de contorno (Figura 6), mostraram melhores respostas com concentrações, de ácido acé-tico, menores que 2% e maiores valores de vazão. Desta forma, novos experimentos foram realizados empregando-se as concen-trações descritas na Tabela 2. O gráico de contorno apresentado na Figura 7 mostra que as melhores respostas foram obtidas com concentração de ácido acético em torno de 1,0% e maiores valo-res de vazão (>1,2 mL min-1_{). A resolução de 1,28, entre as duas}

metilxantinas isoméricas (teobromina e teoilina), apresentada na Tabela 4, foi obtida nas condições de vazão de 1,0 mL/min e composição da fase móvel contendo 1,0% de ácido acético, ou seja, etanol:água:ácido acético (24:75:1 ; v/v/v). As Tabelas 3 e 5 apresentam os resultados obtidos com as demais condições do planejamento experimental. O gráico de contorno que representa estes resultados é mostrado na Figura 7.

A relação entre a acidez da fase móvel (F), a vazão (V) e a res-posta analítica como resolução cromatográica entre teobromina e teoilina em função do tempo total de análise (Rs/tA) é representada pela Equação 3:

Rs/tA = 0,276519 + 0,012278F – 0,033611F2 _{+ 0,036389V –}

0,011944V2 ₍₃₎

Derivando esta equação em função das variáveis, pode-se chegar às condições ótimas de acidez (em termos da concentração de ácido acético na fase móvel) e vazão da fase móvel, obtidas a partir das Equações 4 e 5:

∂Rs/tA/∂F = 0,012278 - 2(0,033611) F = 0 (4)

∂Rs/tA/∂V = 0,036389 - 2(0,011944) V = 0 (5)

Logo, os valores codiicados para composição da fase móvel são, em termos da concentração de ácido acético e vazão, respectivamente: F=0,18 e V=1,52.

Descodiicando estes valores, a partir da Equação 6: C_i = | X _i - X _i o _{/ CX}

i | K (6)

onde: C_i = valor codiicado; X _i = valor real; X _i o _{= valor central}

do planejamento; CX _i = passo central do planejamento; K = valor codiicado máximo que a variável pode assumir.

Os valores críticos, que representam as respostas ótimas, apare-cem dentro do domínio experimental e correspondem aos valores: F = 1,1% de ácido acético na fase móvel e vazão, V = 1,25 mL min-1_.

Tabela 1. Níveis de acidez e vazão da fase móvel empregados na primeira etapa do planejamento experimental

Variáveis Baixo (-) Médio (0) Alto (+)

% ácido acético 2,0 6,0 10

Vazão (mL min-1_{) 1,0 1,1 1,2}

Tabela 2. Níveis de acidez e vazão da fase móvel empregados na segunda etapa do planejamento experimental

Variáveis Baixo (-) Médio(0) Alto (+)

% ácido acético 0,5 1,0 1,5

Vazão (mL min-1_{) 1,0 1,1 1,2}

Tabela 3. Resolução cromatográica entre teobromina e teoilina com fase móvel contendo 1,5% de ácido acético

Vazão

(mL min

₎

Resolução (Rs)

Tempo total de análise

(tA)

(min)

1,0 1,10 5,90

1,1 1,14 5,28

1,2 1,28 4,94

Tabela 4. Resolução cromatográica entre teobromina e teoilina com fase móvel contendo 1,0% de ácido acético.

Vazão

(mL min

₎

Resolução (Rs)

Tempo total de análise

(tA)

(min)

1,0 1,28 6,70

1,1 1,30 6,24

1,2 1,32 5,78

Tabela 5. Resolução cromatográica entre teobromina e teoilina com fase móvel contendo 0,5% de ácido acético

Vazão

(mL min

₎

Resolução (Rs)

Tempo total de análise (tA)

(min)

1,0 1,12 6,77

1,1 1,12 6,21

1,2 1,29 5,74

Figura 7. Gráico de contorno no estudo de acidez da fase móvel (concen-tração de ácido acético entre 0,5 e 1,5% v/v) com a vazão, representando as condições otimizadas do método analítico, considerando a razão entre a resolução cromatográica entre teobromina e teoilina e o tempo total da análise, como resposta analítica

Entretanto, como altas vazões da fase móvel aumentam a pres-são do sistema¸ a resolução cromatográica de 1,28 (Tabela 4) foi considerada como satisfatória para a separação das metilxantinas isoméricas. Portanto, as condições otimizadas utilizadas foram: composição da fase móvel: etanol:água:ácido acético (24:75:1; v/v/v) e vazão de 1,0 mL min-1_.

Os experimentos realizados sob as condições ótimas de vazão e acidez da fase móvel, para diversas soluções padrão, apresentaram cromatogramas similares ao mostrado na Figura 8, em que, no tempo de 6 min, teobromina, teoilina e cafeína são separadas cromatogra-icamente.

CONCLUSÃO

O uso do etanol e de água, no lugar de eluentes tóxicos e caros, como o metanol e a acetonitrila, que tradicionalmente são utilizados em CLAE, associados à eluição isocrática, que possibilita que a fase móvel possa ser reciclada e utilizada em mais de uma análise, permite ilustrar aos alunos os princípios da química segura, o uso de recursos renováveis e a diminuição na geração de eluentes tóxicos. O uso do etanol como modiicador orgânico da fase móvel, embora tendo algumas implicações como a sua alta viscosidade que resulta em aumento da pressão total do sistema, mostrou-se viável na separação das metilxantinas estudadas. A sua utilização é satisfatória frente a outros solventes empregados com maior frequência, como o metanol e a acetonitrila, que embora apresentem menores viscosidades, são de maior toxicidade e maior custo.

Figura 8. Cromatograma por CLAE-FR para solução de metilxantinas, nas condições otimizadas do método [etanol:água:ácido acético (24:75:1% v/v/v, respectivamente e vazão 1,0 mL min-1_]

A otimização do método, usando o planejamento fatorial com-pleto em três níveis, permite o contato dos estudantes com técnicas estatísticas multivariadas e a obtenção de resultados eicientes e rápidos para determinação dos parâmetros que afetam a análise.

Como sugestão podem-se aplicar os métodos univariado e multi-variado em amostras de chás e café solúvel, focalizando procedimen-tos simples para determinação e avaliação dos diversos parâmetros empregados na validação de um método analítico.

AGRADECIMENTOS

Ao PRONEX/FAPESB/CNPq, CAPES e FINEP pelo auxílio inanceiro.

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