R e v i s t a d a S o c ie d a d e B r a s i le i r a d e M e d ic in a T r o p ic a l 2 7 ( 4 ) .- 2 6 1 - 2 6 2 , o u t- d e z , 1 9 9 4 .
RESUMO DE TESE
ISOLAM ENTO, CARACTERIZAÇÃO
E PROPRIEDADE IM UNIZANTE DE
UM A PROTEÍNA (72 kDa)
UBIQUITÁRIA DO CICLO
EVOLUTIVO D E
T R Y P A N O S O M AC R U Z 1
Este trabalho mostra algumas propriedades de um a proteína de 72 kD a reconhecida por um anticorpo monoclonal (mAb), de isotipo IgM, produzido contra trypomastigotas sanguíneos de T. c r u z i , cepa Y, isolados por centrifugação utilizando Histopaque.
Em um a prim eira etapa, a especificidade e a atividade lítica mediada pelo complemento (LMC) do mAb foram analisadas. Através de abordagens im unocitoquím icas foi demonstrado que o mAb reagiu com várias cepas de T. c r u z i (Y, W SL e Colombiana). Uma reação difusa foi observada no corpo das formas amastigotas e epimastigotas, enquanto que em trypomastigotas a reação foi mais restrita. Ele também reagiu com promastigotas de L . a m a z o n e n s i s e L . c h a g a s i . O mAb 164C11
apresentou atividade LM C d irig id a contra
tripom astigotas sanguíneos e foi mais efetivo do que o soro de camundongo em fase crônica - SCC (164C11 = 83% e SCC = 54% ).
Em uma segunda etapa, várias abordagens foram usadas p ara caracte rizar os antígenos reconhecidos pelo mAb 164C11. Através de Western blot, um antígeno de 72 kD a estava presente em T. c r u z i - amastigotas e epimastigotas obtidos de cultura celular; epimastigotas de cultura axênica e tripomastigotas sanguíneos - da cepa Y . Esta proteína também foi reconhecida em epimastigotas da cepa W S L e C o lo m b ian a . O m A b não m o stro u especificidade para T. c r u z i uma vez que ele reagiu com outros membros da família Trypanosomatidae. Como o antígeno de 72 kD a estava presente sobre todos os estágios evolutivos do T. c r u z i da cepa Y, as formas epimastigotas foram selecionadas para caracterizar o epitopo reconhecido pelo mAb. O tratam ento de epim astigotas, da cepa Y, com m etaperiodato seguido por W estern blot não aboliu a ligação do mAb à proteína de 72 kDa sugerindo que, apesar do antígeno de 72 kD a ser uma
R ecebido para publicação em 30/06/94.
ISOLATION, CHARACTERIZATION
A N D IMM UNOLOGICAL
PROPERTIES OF A PROTEIN (72
kDa) UBIQUITOUS OF
T R Y P A N O S O M A C R U Z I
EVOLUTIV
CYCLE
This work reports some properties o f a 72 kD a protein recognized b y a l6 4 C ll monoclonal antibody (mAb) o f the IgM isotype produced against bloodstream trypom astigotes o f T. c r u z i , Y strain, isolated by histopaque centrifugation.
In a first step, the specificity and complement- mediated lytic activity (CM L) o f the 164C11 mAb w e re an aly sed . U sin g im m u n o c y to c h em ic al approaches it was shown that the mAb was reactive w ith various strains o f T. c r u z i (Y, W SL and Colombian). In amastigotes and epimastigotes a diffuse body pattern of reactivity was found, while in trypomastigotes the reactivity was more restricted. It was also reactive with prom astigotes o f L .
a m a z o n e n s is and L . c h a g a s i. 164C11 mAb presented C M L ac tiv ity d irec ted a g a in st b lo o d stre a m trypomastigotes and was more effective than the chronic serum mouse - CSM ( 1 6 4 0 1 = 83% and CSM = 54%).
In a second step, many approaches were used to characterize the antigens recognized by the 164C11 mAb. By W estern blot a 72 kD a antigen was present in T. c r u z i Y strain cellu lar culture-derived amastigotes and trypom astigotes; axenic culture- d e r iv e d e p im a s tig o te s a n d b lo o d s tr e a m trypomastigotes. This protein was also recognized on the epimastigotes o f W SL and Colombian strain. The mAb was not specific for T. c r u z i, since it was r e a c tiv e w ith o th e r m e m b e rs o f th e Trypanosomatidae family. As the 72 kD a antigen was present on all developmental stages o f T. c r u z i Y strain, epimastigote forms w ere selected to characterize the epitope recognized by the mAb. Treatment of Y strain epimastigotes w ith sodium metaperiodate followed by W estern blot did not abolish the ability o f the 72 kD a protein to bind the mAb suggesting that although the 72 kD a antigen is a glycoprotein (GP), the epitope recognized is a peptide. The digestion w ith endoglycosidase F
R e su m o d e T e se . G o m e s YM. Is o la m en to , c a r a c te r iz a ç ã o e p r o p r i e d a d e im u n iz a n te d e u m a p r o te ín a (72 k D a ) u b iq u itá r ia d o c ic lo e v o lu tiv o d e Trypanosoma cruzi. R e v is ta d a S o c ie d a d e B r a s ile ir a d e M e d ic in a T r o p ic a l 2 7 : 2 6 1 -2 6 2 , o u t-d e z , 1 9 94 .
glicoproténa (GP), o epítopo reconhecido é um peptídeo. A digestão com endoglicosidase F não aboliu a reação e não modificou a migração do antígeno indicando que a ligação do carboidrato à proteína não é do tipo “N -linked” .
Para determ inar se a GP de 72 kDa poderia estar associada a entrada do parasita em células fagocíticas, a interação de formas tripom astigotas (cepa Y), com m acrófagos (M
0
) e células Vero foi examinada. Os parasitas pré-incubados com sobrenadante do mAb 164C11 e semeados sobre os M0
e células Vero m ostraram uma percentagem de inibição da infecção de 82,8 % e 75,7 %, respectivamente, após um a incubação de 72 h. Nenhuma inhibição foiobservada quando M
0
e células Vero foramincubadas com o mAb seguindo a infecção com parasitas não tratados, sugerindo que a GP de 72 kD a pode ser um dos componentes de membrana im plicado no processo de invasao da célula hospedeira.
A proteína de 72 kD a foi purificada por eletroforese preparativa e a preparação obtida (TcY 72) foi usada para im unizar camundongos C57B1/ 10. Os resultados m ostraram que os camundongos im unizados apresentaram: 1) um título de IgG mais elevado do que IgM , e estas Igs reconheceram um antígeno de 72 kD a em epimastigotas. Nenhuma reação foi evidenciada no grupo controle; 2) uma reação positiva de hipersensibilidade retardada; 3) um a dim inuição do pico de parasitem ia e da mortalidade; 4) um aumento de linfócitos T C D 3+ , os T C D 8+ mais elevados que os T C D 4+ . Estes resultados sao importantes porque é conhecido que os linfócitos T C D 8+ desempenham um papel im portante na imunidade protetora da doença de Chagas. N ós não investigamos o papel da TcY 72 na auto-im unidade. E ntretanto, experim entos a d ic io n a is sao n e c e ssá rio s p ara e lu c id a r a participação da TcY 72 contra “self antigen” .
neither abolished the reactivity nor changed the m igration o f the antigen, indicating that the carbohydrate moiety is not N-linked.
To determine w hether the 72 kD a GP could be associated with the parasite entry into phagocytic cells, the interaction o f trypom astigote forms (Y strain) w ith M
0
and Vero cells was examined. Parasites preincubated w ith the supernatant o f164C11 mAb and seeded onto M
0
and Vero cells showed an infection inhibition percentage o f 82.8 % and 75.7% , respectively, after an incubation of 72h. No inhibition was observed when the M0
and Vero cells were incubated w ith the mAb following the infection w ith the no n -treated parasites, suggesting that the 72 kDa GP may be one o f the trypomastigote surface components implicated in the process o f host cell invasion.The 72 kD a GP was purified by preparative electrophoresis and the preparation obtained (TcY 72) was used to immunize C57B1/10 mice. The results showed that the immunized mice presented: 1) an IgG titre more elevated than IgM and these Igs recognized a 72 kD a epim astigote antigen. No reaction was evidenced in the control group; 2) a positive delayed hypersensitivity was significative when compared to the control group: 3) a reduced parasitemia peak and mortality ; 4) an increase o f T CD3 + lymphocytes was observed in relation to the control, the T C D 8+ increased more than the T CD 4+ . This results are relevant because it is known that T C D 8+ lymphocytes play an im portant role in protective immunity o f C hagas’disease. W e have not yet investigated the role o f TcY 72 on auto immunity. However, further experiments are needed to clarify the participation o f the TcY 72 against self antigen.
Yara d e M ir a n d a G om es
Tese apresentada a Université Pierre et M arie Curie para obtenção do Título de Doutor.
Paris, França, 1993.
