UNIVERSIDADE DE LISBOA
FACULDADE DE CIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA VEGETAL
Inibição da desaminase celular APOBEC3G
pela proteína Vif do HIV-1: O papel da
localização celular
Dissertação orientada pelo Prof. Doutor João Gonçalves (Faculdade de
Farmácia da Universidade de Lisboa) e pela Prof. Doutora Margarida
Meireles (Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa)
Diana Isabel Máximo Rodrigues
Mestrado em Biologia Molecular Humana
2009
UNIVERSIDADE DE LISBOA
FACULDADE DE CIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA VEGETAL
Inibição da desaminase celular APOBEC3G
pela proteína Vif do HIV-1: O papel da
localização celular
Dissertação orientada pelo Prof. Doutor João Gonçalves (Faculdade de
Farmácia da Universidade de Lisboa) e pela Prof. Doutora Margarida
Meireles (Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa)
Diana Isabel Máximo Rodrigues
Mestrado em Biologia Molecular Humana
2009
Agradecimentos
Em primeiro lugar, ao Professor Doutor João Gonçalves, pela oportunidade de realizar o meu projecto de mestrado no seu laboratório, pela orientação em todos os aspectos e pela correcção da tese.
Em segundo, aos colegas de laboratório, em especial ao Nuno, à Patrícia e à Inês, por me ensinarem tudo o que sei e por me terem ajudado em tudo, no mais básico possível e nas
dúvidas “existenciais”. Aos restantes colegas, Andreia, Catarina, Soraia, Lídia, Luís, Carina,
Sylvie, Sara e Paula, pela ajuda diária constante. Aos colegas e amigos Joana, Ana Catarina e André por todos os favores que jamais vos poderei recompensar, pelo espírito de entre-ajuda, por me aturarem, por estarem lá nas horas difíceis, pelo apoio incondicional, pelos vossos ombros amigos.
Agradeço ainda à Professora Doutora Maria Margarida Meireles, pela disponibilidade e prontidão em todo o apoio que me prestou e pela correcção da tese.
Em último mas não menos importante, à minha família e aos meus amigos. Obrigada Mãe e Pai por tudo aquilo que as palavras não chegam para descrever. Pela educação, pelos sermões, pela compreensão, pela amizade, pela ajuda, pelo amor. A vocês e à minha restante família porque serem o meu chão, as minhas raízes, o meu lar. Aos amigos mais chegados e aos velhos amigos, pela paciência, pela cumplicidade e pelo carinho, por me ajudarem a ser a pessoa que sou hoje.
Índice Geral
Agradecimentos ... iii
Índice Geral ... iv
Índice de Figuras ... vii
Índice de Tabelas ... viii
Símbolos e Abreviaturas ... ix Resumo ... xii Abstract ... xiii 1. Introdução ... 1 1.1. O HIV e a SIDA ... 1 1.1.1 Etiologia e Patogenia ... 1 1.1.2. O impacto demográfico ... 1 1.2. Cataracterização do HIV-1 ... 2 1.2.1. Taxonomia ... 2 1.2.2. Genoma e Estrutura ... 2 1.2.3. Ciclo de replicação ... 3
1.3. A proteína viral Vif e o seu alvo celular ... 4
1.3.1. A importância da Vif ... 4
1.3.2. A interacção Vif-APOBEC3G ... 6
1.3.3. Especificidade à espécie ... 7
1.4. O factor anti-viral APOBEC3G ... 8
1.4.1. A família APOBEC ... 8
1.4.2. Regulação intracelular da desaminase ... 9
1.5. A necessidade de novas terapias: o potencial terapêutico da interacção Vif-APOCEC ... 10
2. Materiais e Métodos ... 11
2.1. Clonagem ... 11
2.1.1. Extracção de DNA plasmídico em média escala por kit (midiprep) ... 11
2.1.2. Reacção de polimerização em cadeia (PCR, Polymerase Chain Reaction) ... 12
2.1.3. Hidrólise enzimática de DNA ... 12
2.1.4. Reacção de ligação inserto-vector ... 13
2.1.5. Preparação de bactérias electrocompetentes ... 13
2.1.6. Transformação de bactérias electrocompetentes ... 14
2.1.7. Selecção e confirmação de colónias positivas para a clonagem ... 14
I) Selecção de colónias e extracção de DNA plasmídico em pequena escala sem kit (lise alcalina) ... 14
II) Confirmação de clones positivos por hidrólise enzimática de DNA e electroforese em gel ... 15
III) Extracção de DNA plasmídico em pequena escala por kit (miniprep) e sequenciação automática de DNA ... 15
2.2. Expressão proteica ... 16
2.2.1. Linha celular – HEK 293T ... 16
2.2.2. Transfecção pelo método de fosfato de cálcio ... 16
2.2.3. Extracção e quantificação de proteínas ... 17
2.2.4. Separação de proteínas por electroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) ... 17
2.2.5. Western blot ... 17
2.2.6. Extracção diferencial de proteínas do citosol e do núcleo ... 18
2.2.7. Transcrição e Tradução in vitro e Imuno-precipitação (IP) ... 19
2.3. Análise da função proteica em células eucariotas ... 20
2.3.1. Ensaio de degradação dos clones NLS-A3G ... 20
2.3.2. Ensaio de infecciosidade do HIV-1 na presença de NLS-A3G ... 20
I) Extracção de DNA plasmídico em média escala por kit (midiprep) ... 20
II) Co-transfecção, produção e concentração das partículas virais ... 21
III) Quantificação de partículas virais pelo ensaio imunosorvente ligado a enzima (ELISA) ... 21
IV) Linha celular – TZM-bl, infecção e quantificação da inibição da infecciosidade viral por CPRG ... 22
3. Resultados ... 23
3.1. Produção de clones pcDNA3.1/Zeo(+)-NLS-A3G-HA ... 23
3.2. A expressão dos clones pcDNA3.1/Zeo(+)-NLS-A3G-HA resulta em proteínas menores que o esperado ... 23
3.3. A proteína NLS-A3G-HA é mantida no citoplasma da célula ... 24
3.4. A localização celular não influencia o tamanho da NLS-A3G-HA ... 25
3.5. A Vif do HIV-1 consegue induzir a degradação da NLS-A3G-HA ... 25
3.6. A proteína NLS-A3G-HA é encapsidada nos novos viriões ... 26
3.7. A infecção viral é inibida pela NLS-A3G ... 27
4. Discussão dos resultados e Conclusões ... 28
5. Referências Bibliográficas ... 30
Índice de Figuras
Figura 1 | Organização do genoma do HIV-1 ... 2
Figura 2 | Estrutura do virião do HIV-1 ... 3
Figura 3 | Ciclo replicativo do HIV-1 ... 3
Figura 4 | A APOBEC3G causa a hipermutação do cDNA viral ... 5
Figura 5 | Motivos-chave na proteína Vif ... 6
Figura 6 | Degradação da APOBEC3G induzida pela Vif ... 7
Figura 7 | Os dois domínios catalíticos da APOBEC3G ... 8
Figura 8 | Obtenção de quatro clones positivos ... 23
Figura 9 | Expressão de NLS-A3G-HA em células HEK 293T ... 24
Figura 10 | Localização citoplasmática de NLS-A3G-HA ... 24
Figura 11 | Expressão de NLS-A3G-HA in vitro ... 25
Figura 12 | Degradação de NLS-A3G-HA induzida pela proteína viral Vif ... 26
Figura 13 | Encapsidação de NLS-A3G-HA nos viriões produzidos ... 26
Figura 14 | Inibição da infecção por NLS-A3G-HA ... 27
Figura 15 | Mapas genómicos de plasmídios utilizados ... xv, xvi Figura 16 | Representação esquemática da construção efectuada para produzir os clones pcDNA3.1/Zeo(+)-NLS-A3G-HA ... xvi
Índice de Tabelas
Tabela 1 | Composição da mistura e condições da reacção de PCR ... xiv Tabela 2 | Representação esquemática das sequências de reconhecimento
das enzimas NotI e XhoI ... xiv Tabela 3 | Anticorpos utilizados na detecção de proteínas por Western blot ... xiv Tabela 4 | Constituição das soluções utilizadas ...xvii
Símbolos e Abreviaturas
Unidades e Símbolos pg Picograma(s) µg Micrograma(s) mg Miligrama(s) µL Microlitro(s) mL Mililitro(s) mm Milímetro(s) M Molar mM Milimolar U Unidade enzimática pb Pares de bases h Hora(s) min Minuto(s) seg Segundo(s) kDa Kilodalton(s) mA Miliamper(es) mm Milímetro(s) V Volt(s) Ω Ohm(s) ºC Graus Celsiust.a. Temperatura ambiente
rpm Rotações por minuto
x g Unidade de força centrífuga relativa
Reagentes e Abreviaturas
APOBEC3G (A3G) Apolipoprotein B editing catalitic polypeptide 3G
Abs Absorvância
DMEM Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium
PBS Phosphate Buffered Saline
TBS-T Tris-Buffered Saline-Tween 20
EDTA Ácido etilenodiaminotetra-acético
SOB Super Optimal Broth
HRP Horseradish peroxidase, Peroxidase de rábano selvagem
TE Tris-EDTA
BSA Bovine serum albumin, albumina de soro bovino
HBS HEPES Buffered Saline
HEPES Ácido 4-(2-hidroxietil)-1-Piperazinaetanosulfónico
m.o.i. Multiplicidade de infecção
SDS-PAGE Electroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio
PMSF PhenylMethaneSulphonylFluoride
CA Cápside
CCR5 Chemokine (C-C motif) Receptor 5
CD4 Cluster of Differentiation 4
CXCR4 Chemokine (C-X-C motif) Receptor 4
DNA Deoxyribonucleic acid, ácido desoxirribonucleico
RNA Ribonucleic acid, ácido ribonucleico
cDNA DNA complementar
E. coli Escherichia coli
Env Poliproteina do envelope
Gag Group-specific antigen polyprotein
ART Anti-retroviral therapy
HAART Highly active anti-retroviral therapy
HIV-1 Human Immunodeficiency Virus type 1
HA Hemaglutinina
HIV-2 Human Immunodeficiency Virus type 2
IP Imunoprecipitação
IN Integrase
LTR Long terminal repeat, repetição terminal longa
MA Matriz
mRNA RNA mensageiro
NC Nucleocápside
Nef Negative factor, factor negativo
ORF Open reading frame, grelha de leitura aberta
Pol Polimerase
PR Protease
Rev Reguladora da expressão do virião
SIDA Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
SU Glicoproteína de superfície
TAE Tampão de Tris-acetato EDTA
TM Transmembranar
Vif Viral infectivity factor, factor de infecciosidade viral
Vpr Viral protein R
Vpu Viral protein U
ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay
dNTP Trifosfato de desoxiribonucleótido
PCR Polymerase chain reaction, reacção de polimerização em cadeia
VSV-G Glicoproteína do Vírus da Estomatite Vesicular (Vesicular Stomatitis Virus)
GAPDH Glyceraldehyde 3-Phosphate Dehydrogenase
PARP Poly [ADP-ribose] polymerase 1
Resumo
A desaminase de citidinas APOBEC3G (A3G) (apolipoprotein B-editing catalitic polypeptide 3G), confere uma importante estratégia anti-viral às células humanas, a qual é neutralizada pelo factor de infecciosidade viral (Vif, viral infectivity factor) do Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV, Human Immunodeficiency Virus). Esta enzima é o componente central desta defesa intrínseca de células do sistema imunitário, como os linfócitos T e os macrófagos, ao promover a hipermutação do genoma do vírus mutado em vif, impedindo uma infecção produtiva destas células-alvo. Em contra-partida, a selecção deste gene durante a evolução do HIV-1 permitiu que uma proteína viral conseguisse induzir de forma eficiente a degradação da A3G, através da via-dependente de proteossomas celulares.
Neste trabalho, a interacção que ocorre entre a proteína viral e a enzima celular foi investigada, nomeadamente através de uma estratégia que inibe esta ligação e que pretende devolver a capacidade inibidora da infecção à desaminase. Através da adição de um sinal de localização nuclear (NLS, nuclear localization signal) à extremidade N-terminal da A3G, foi tentada a separação física destas duas proteínas em diferentes sub-localizações celulares. A proteína Vif foi aferida quanto à capacidade de induzir a degradação da proteína construída, e foram testadas as capacidades da NLS-A3G de incorporação nas partículas virais produzidas nas células infectadas e de inibição da replicação viral nas células-alvo. As diferenças detectadas na sensibilidade à acção da Vif e a total inibição da infecção que ocorre na ausência da proteína viral, poderão ser bastante promissoras na descoberta de novas regiões na estrutura de ambas proteínas, ou até mesmo na revelação de novos mecanismos de evasão da desaminase celular à acção da proteína viral. Poderá, assim, atingir-se uma maior compreensão da adaptação evolutiva deste vírus ao sistema imunitário do Homem, uma adaptação muito eficiente que culmina no desenvolvimento da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (SIDA).
Abstract
Cytidine deaminase APOBEC3G (A3G) (apolipoprotein B-editing catalitic polypeptide 3G), provides an important anti-viral strategy to human cells, which is neutralized by the viral infectivity factor (Vif) from the Human Immunodeficiency Virus (HIV). This enzyme is the main component of this intrinsic defense of immune system cells, as T lymphocytes and macrofages, by promoting the hypermutation of the viral genome with mutation on vif, preventing a productive infection of these target cells. Nevertheless, the selection of this gene during HIV-1 evolution allowed that a viral protein could efficiently induce A3G degradation, through the cellular proteasomes-dependent pathway.
In this work, the interaction that occurs between the viral protein and the cellular enzyme was investigated, namely by a strategy that inhibits this connection and that acts on returning the infection inhibitory ability to the deaminase. Through the addition of a nuclear localization signal (NLS) to the N-terminal end of A3G, the physical separation of this two proteins in different cellular sub-locations was attempted. Vif protein was evaluated as far as its ability to induce de degradation of the designed protein, and the A3G capabilities of incorporation in the viral particles produced in the infected cells and viral replication inhibition in the target cells were tested. The detected differences in sensitivity to Vif’s action and the complete inhibition of infection that occur in the absence of the viral protein, may be very promising in the discovery of new regions in the structure of both proteins, or even in the unveiling of new mechanisms of cellular deaminase evasion to the viral protein action. In this way, a better comprehension of the evolutional adaptation of this virus to the Human immune system may be achieved, a very efficient adaptation that ends up in the development of the Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS).
1.
Introdução
1.1. O HIV e a SIDA
1.1.1 Etiologia e Patogenia
Os Vírus da Imunodeficiência Humana tipo-1 e tipo-2 (HIV-1 e HIV-2) são os agentes etiológicos actualmente conhecidos de SIDA. O HIV-1, principal responsável pela epidemia mundial, foi isolado em 1983(1), enquanto o HIV-2 apenas foi descoberto três anos mais
tarde(2). Ambos derivaram de Vírus da Imunodeficiência Símia (SIV, Simian
Immunodeficiency Virus) que infectam chimpazés e macacos fuliginosos, respectivamente. Apesar das semelhanças morfológicas e biológicas, estes diferem significativamente em alguns componentes antigénicos e moleculares, o que faz com que o HIV-2 apresente períodos de latência consideravelmente mais longos e seja menos virulento, tornando-o responsável por epidemias mais localizadas, principalmente em certas regiões da África Ocidental(2).
Estes vírus infectam primariamente linfócitos T CD4+ e macrófagos por estes
apresentarem na sua superfície um receptor específico (CD4) e os correceptores CCR5 e CXCR4(3); contudo, outras células do sistema imunitário como os linfócitos B e as células dentríticas também podem expressar estes receptores, tornando-se susceptíveis à infecção pelo HIV. Como consequência, o sistema imunitário é destruído progressivamente, levando ao desenvolvimento da síndrome que surge associada a múltiplas infecções oportunistas,
complicações neurológicas e neoplasias(4).
1.1.2. O impacto demográfico
De acordo com os últimos dados do Programa das Nações Unidas para o HIV/SIDA/Organização Mundial de Saúde referentes ao ano de 2007, existem actualmente 33,2 milhões de pessoas infectadas com HIV no mundo, das quais mais de 30 milhões vivem em países de desenvolvimento. Apesar da terapia antiretroviral (ART, antiretroviral therapy) actual ser capaz de atrasar o aparecimento dos sintomas da SIDA para mais de 15 anos após a infecção, apenas 3 milhões de pessoas em 2007 estavam a receber tratamento, correspondendo a 31% do total de infectados com necessidade imediata desta terapia. A somar registaram-se só nesse ano 2,5 milhões de novos casos e 2,1 milhões de mortes, estando estas incluídas num total de 25 milhões de pessoas que já morreram devido a esta doença contabilizados deste 1981.
Particularmente em países em desenvolvimento, o HIV/SIDA continua a ser um dos maiores problemas mundiais em saúde pública. Esta crescente pandemia mantém a
In tr o d u ç ã o
exigência do estudo aprofundado deste vírus, dos seus mecanismos e interacções com os componentes das células, para alcançar terapêuticas mais eficazes a nível global.
1.2. Cataracterização do HIV-1
1.2.1. Taxonomia
O HIV-1 pertence à família Retroviridae, a qual engloba vírus cujo material genético é ácido ribonucleico (RNA, ribonucleic acid) de cadeia simples positiva não segmentada. Tal como o nome indica, os vírus desta família são caracterizados por realizarem a transcrição reversa do seu RNA genómico em ácido desoxirribonucleico (DNA, deoxyribonucleic acid) de cadeia dupla, processo desempenhado por uma enzima característica do seu proteoma, a transcriptase reversa(5).
Este vírus está incluído ainda no género Lentivirus, que significa vírus “lentos”, uma vez que estes vírus são caracterizados por longos períodos de latência. Estes distinguem-se dos
restantes retrovírus porque possuem cápside em forma de bala(6) e genomas complexos
com um grande número de proteínas acessórias que aumentam fortemente a eficiência da
infecção(5). Para além disso, possuem um invólucro formado por uma bicamada lipídica que
é derivada da membrana da célula hospedeira (Figura 1).
1.2.2. Genoma e Estrutura
O genoma do HIV-1 é formado por duas moléculas de RNA, cada uma com cerca de 9 kb. Estas são flanqueadas por repetições terminais longas (LTR, long terminal repeats), sequências vitais para a integração e transcrição do genoma viral, e possuem 9 grelhas de
leitura abertas (ORF, open reading frame) que originam 15 proteínas distintas(7).
Três ORFs codificam as poliproteínas precursoras Gag, Pol e Env (características de todos os retrovírus), as quais são posteriormente proteolizadas originando 9 proteínas. As poliproteínas estruturais Gag e Env constituem, respectivamente, o núcleo e o invólucro externo do virião, sendo quatro as proteínas Gag: matriz (MA, p17), cápside (CA, p24), nucleocápside (NC, p7) e p6; e duas as proteínas Env: superfície (SU, gp120) e transmembranar (TM, gp41). O virião de forma esférica (com cerca de 100nm de diâmetro) é revestido por um invólucro lipídico proveniente da membrana da célula produtora, no qual estão inseridos inúmeros complexos formados por trímeros de gp120 e gp41. A poliproteína
Figura 1 | Organização do genoma do HIV-1. As poliproteínas Gag, Pol e Env, são precursoras das proteínas do núcleo, do invólucro e das enzimas virais. Adicionalmente, 6 ORF originam as proteínas acessórias que regulam a expressão dos genes virais e que participam no processo de encapsidação, aumentando fortemente a eficiência da infecção.
In tr o d u ç ã o
Pol origina três enzimas: protease (PR), transcriptase reversa (RT) e integrase (IN), as quais fornecem as
funções enzimáticas essenciais e são também
encapsidadas na partícula viral (Figuras 1 e 2)(3,6,7). As seis restantes ORFs originam pequenos transcritos que sofreram splicing. Estes codificam duas proteínas reguladoras de genes Tat (trans-activadora) e Rev (reguladora da expressão do virião) que não constituem a partícula, e quatro proteínas acessórias: Nef (factor negativo), Vif (factor de infecciosidade viral) e Vpr (proteína viral R), que são encapsidadas, e Vpu (proteína viral U) que assiste na formação do virião(3,5).
1.2.3. Ciclo de replicação
A fase precoce do ciclo de replicação inicia-se quando uma partícula infecciosa encontra uma célula-alvo que apresenta na sua membrana o receptor CD4, e este se liga à glicoproteína de superfície do vírus, gp120 (SU). Esta sofre alterações conformacionais que permitem o reconhecimento dos co-receptores CCR5 e CXCR4, possibilitando a fusão do invólucro viral com a membrana celular e consequentemente a entrada de todas as moléculas encapsidadas na partícula no citoplasma da célula(3). Aí, o RNA genómico viral em cadeia simples é convertido pela transcriptase reversa (com o auxílio da proteína da nucleocápside) num intermediário de DNA de cadeia dupla, o provírus, que é então transportado para o núcleo e integrado no genoma da célula, por acção da integrase (Figura
3)(5,6). Na fase tardia do ciclo, estes genes de DNA são transcritos e traduzidos pela maquinaria da célula hospedeira em
proteínas virais. As proteínas
estruturais são transportadas para a
membrana plasmática onde se
acumulam; a poliproteína Gag liga-se ao RNA genómico do vírus e então interactua com a membrana plasmática, a qual é forçada a se projectar e eventualmente a se separar, formando-se uma partícula (cujo invólucro lipídico é proveniente da membrana da célula) que é libertada para o exterior da célula
Figura 2 | Estrutura do virião do HIV-1. Na partícula viral são encapsidadas duas cópias do genoma que não sofreram
slicing, que se associam a milhares de
proteínas NC para formar um complexo ribonucleoproteico estável. São ainda encapsidadas as proteínas estruturais Gag e Env, as enzimas virais (Pol) e as três proteínas acessórias (não representadas) Nef, Vif e Vpr.
Figura 3 | Ciclo replicativo do HIV-1. Após fusão do virião com a membrana da célula, o RNA viral é transcrito em cDNA de cadeia dupla, o qual se integra no genoma da célula por acção da integrase, completando-se a fase precoce do ciclo. Na fase tardia as proteínas virais, sintetizadas pela maquinaria celular, acumulam-se próximo da membrana, juntamente com o RNA viral, e o novo virião forma uma gémula, acabando por sair da célula.
MA RT PR SU Invólucro lipídico CA NC RNA IN TM Núcleo Célula produtora Fusão Gemulação Integração
In tr o d u ç ã o
infectada (Figura 3)(6,8). A formação do virião infeccioso é completada já fora da célula, ao
ocorrer a maturação da partícula que consiste no processamento proteolítico da Gag e da Gag-Pol pela transcriptase reversa, levando à formação do núcleo e activação das enzimas virais(3,5).
1.3. A proteína viral Vif e o seu alvo celular
1.3.1. A importância da Vif
A proteína Vif, codificada pelo genoma do HIV-1 e expressa na fase tardia do ciclo de replicação por um mecanismo dependente de Rev, é uma pequena (23 kDa) proteína acessória básica formada por 192 aminoácidos, que é incorporada no virião (7-100
moléculas por cada partícula) através da interacção como RNA genómico viral(7,9). Na célula
localiza-se predominantemente no citoplasma, mas também é encontrada no núcleo(10) e
associada a membranas celulares. O gene vif, inicialmente designado sor, foi descoberto 1987 ao ser demonstrado que o vírus mutado HIV-1(Δvif) (com o gene vif delectado), apresentava uma perda da infecciosidade viral de 100 a 1000 vezes, em relação ao vírus selvagem, embora sem diminuição da produção viral(11). Esta proteína é essencial para a replicação do vírus em células humanas ditas não-permissivas (como linfócitos T CD4+ e macrófagos, que são as principais células-alvo do HIV, e várias linhas celulares de células T leucémicas), ou seja, células que quando infectadas pelo vírus mutado HIV-1(Δvif) (com o
gene vif delectado), produzem novas partículas virais não infecciosas(8,12,13). De facto, a Vif é
vital para neutralizar uma potente via anti-viral que existe neste tipo de células, uma vez a replicação das partículas virais produzidas na ausência de Vif é inactivada eficientemente por esta via inata. Em outro tipo de células, designadas de permissivas (como as linhas
celulares HeLa e 293T), mesmo o vírus mutado é capaz de replicar de forma eficaz(12,14,15).
Em 2002, Sheehy e os seus colaboradores descobriram que uma proteína celular é o
alvo da Vif(16), a subunidade 3G da desaminase do mRNA da apolipoproteína B -
APOBEC3G (A3G) (Apolipoprotein B-editing catalitic polypeptide 3G) inicialmente conhecida
como CEM-15(9,15,17). Esta enzima é um membro da família de desaminases de citidinas
(enzimas que modificam/editam ácidos nucleicos), e o seu nome foi-lhe atribuído pela
homologia considerável com a primeira enzima desta família (APOBEC1)(12). Ao se
expressar A3G em células permissivas, estas adquirem um fenótipo não-permissivo, o que revelou/desvendou que esta desaminase é o factor anti-viral cuja expressão natural está restrita às células não-permissivas, e que permite inactivar o HIV-1(Δvif). Portanto, a proteína viral Vif é crucial para proteger o vírus da actividade anti-viral da A3G, permitindo
In tr o d u ç ã o
Na ausência da Vif, a A3G presente no citoplasma da célula produtora é encapsidada (3 a 11 moléculas) nos viriões de HIV-1(Δvif) em formação ao ligar-se à porção N-terminal da região da nucleocápside da poliproteína Gag, bem como ao RNA viral, no local da membrana celular onde ocorre a gemulação das partículas virais(15,18). Como resultado da fusão viral, é introduzida no citoplasma da próxima célula alvo (Figura 4), e ao ocorrer a transcrição reversa de genoma de RNA do vírus, esta enzima vai catalizar
a excessiva desaminação de
desoxicitidinas (dC) a desoxiuridinas (dU) na cadeia negativa (-) do DNA
complementar (cDNA) formado,
preferencialmente em sequências 5’-CC CU(8,14,15,19). A cadeia negativa é o alvo da desaminação uma vez que a A3G apenas consegue utilizar moldes em cadeia simples de DNA, ao passo que a cadeia positiva existe quase totalmente como DNA de cadeia dupla(13).
O DNA viral contendo uridinas (U) pode ser reconhecido e degradado pela acção combinada de duas enzimas de reparação do DNA, a glicosilase de uracil-DNA (que remove os uracilos originando locais abásicos) e a endonuclease apurínica-apirimidínica (que cliva os locais abásicos), bloqueando assim a replicação viral(8,9,15,19,20,21). Porém, um número reduzido de cadeias negativas pode resistir à degradação e servir de molde para formar a cadeia positiva (+) do cDNA. Nesta, as mutações ficam registadas como transições de guanosina (G) para adenosina (A) em mais de 10% de todos os resíduos G(14,15), e este provírus pode integrar-se no genoma da célula hospedeira, embora as sequências geneticamente comprometidas não darão origem a uma progenia de viriões infecciosos. A A3G pode ainda inibir a replicação de uma forma independente da desaminação quando ligada ao RNA viral, ao competir fisicamente com o movimento da transcriptase reversa na
cadeia molde de RNA, resultando numa diminuição inicial transcrição(22). Contudo, esta
inibição é frequentemente incompleta e ocorre a produção da cadeia negativa do cDNA que é então alvo da acção da A3G dependente da desaminação.
Núcleo
Célula produtora Proteossoma 26S
Ubiquitinação e degradação Incorporação Gemulação Fusão Degradação? Integração Hipermutação C/G T/A Degradação? Célula alvo
Figura 4 | A APOBEC3G causa a hipermutação do cDNA viral. A desaminase é encapsidada nos novos viriões, actuando na cadeia negativa (-) do cDNA durante a transcrição reversa. O DNA viral hipermutado pode ser degradado por enzimas de reparação ou pode ser integrado no genoma da célula. A proteína viral Vif liga-se à APOBEC3G e induz a sua poli-ubiquitinação, de forma a marcá-la para degradação pelo proteossoma 26S.
In tr o d u ç ã o
Assim explica-se como é possível que células não permissivas possam produzir níveis normais de viriões, mas que estes não sejam capazes de replicar de forma eficiente nas próximas células-alvo. Apesar de tudo, a desaminação das citidinas pode ser construtiva em vez de destrutiva, e pode ajudar as sequências do HIV-1 a evoluir, contribuindo possivelmente para o surgimento de variantes com vantagens selectivas que lhes permitam
escapar a respostas imunes adaptativas ou a adquirir resistência a fármacos anti-virais(13).
1.3.2. A interacção Vif-A3G
Sabe-se então que, de forma a se protegerem deste mecanismo de defesa das células, todos os lentivírus (à excepção do vírus da anemia infecciosa equina) desenvolveram os genes vif, cuja função primária é prevenir a encapsidação da A3G nos viriões produzidos, impedindo-a de realizar a sua função anti-viral de desaminase(9). Para tal, a Vif liga-se directamente à A3G e diminui a sua estabilidade ao induzir a sua degradação por uma via
dependente de proteossomas, eliminando-a das células produtoras(8,12,13,15,23). Assim, os
níveis celulares de A3G são reduzidos, prevenindo-se desta forma a incorporação da desaminase nas novas partículas virais e permitindo a preservação da infecciosidade viral(8,20,24). A expressão de Vif pode então resultar numa depleção da A3G das células T
infectadas pelo HIV-1 enquanto os níveis de mRNA da A3G permanecem inalterados(13).
Não obstante, a ligação da Vif à A3G não é suficiente para neu tralizar o fe nótipo
anti-viral(12). A porção N-terminal da Vif (aminoácidos 14-17 e 40-44) interactua com a
extremidade N-terminal na A3G (aminoácidos 54-124 e 128)(9,15); contudo, outros dois
domínios da Vif são fundamentais para que ocorra a degradação da desaminase(12). Um
deles é um motivo muito conservado perto da extremidade C-terminal, designado motivo SLQ (aminoácidos 144-149), cuja sequência SLQ(Y/F)LA (seguido de 4 a.a. hidrofóbicos) é semelhante a um motivo conservado na caixa BC das proteínas supressoras de sinalização de citocinas (SOCS) e intervém na ligação da Vif à elongina C, um componente do complexo da ligase de ubiquitina E3(13,17,25). É de salientar que este motivo SLQ é a sequência mais conservada nas proteínas Vif do HIV-1 e de outros lentivírus, o que sugere
que fármacos direccionados para este local podem ser resistentes a mutações do vírus(12). O
outro motivo altamente conservado, também designado de motivo HCCH (aminoácidos 108-139), é a sequência H-X5-C-X17-18C-X3-5-H, localizada a montante da caixa BC, e que
estabelece a interacção com a culina-5(15,17). Os dois resíduos de cisteína que fazem parte do motivo HCCH são componentes críticos de um domínio de dedos-
Figura 5 | Motivos-chave na proteína Vif. Os motivos SLQ e HCCH, bem como os aminoácidos 14-17 e 40-44 são sequências vitais para a interacção com a A3G e com dois constituintes do complexo da ligase de ubiquitina E3, a culina-5 e a elongina C. 108H-X 5-C-X17-18-C-X3-5-H 139 Motivo SLQ Motivo HCCH 144 SLQ(Y/F)LA149
N-terminal 14RMRD17 40YHHRY44 C-terminal
In tr o d u ç ã o
-de-zinco, sendo a ligação do zinco vital para a função da Vif pois permite a correcta conformação da proteína(9,13). Estas interacções são essenciais para que a Vif consiga recrutar o complexo da ligase de
ubiquitina E3, formado pela
elongina C, a elongina B, a culina-5 e a ring-box-1 (Rbx1)(14,17,25). Este complexo pode assim interagir com a A3G e encaminhá-la para a
proximidade da enzima conjugadora E2-ubiquitina, induzindo a poli-ubiquitinação da desaminase – uma modificação pós-traducional que marca a proteína para degradação pelo
proteossoma 26S (Figura 6)(14,15). Para além desta função, existem também evidências que
a Vif pode ajudar a suprimir a tradução do mRNA da A3G, sendo que este efeito combinado com a aceleração da degradação proteossomal resultam na depleção eficiente dos níveis intracelulares da desaminase contrapondo a sua actividade anti-viral(20,23,24,26). Têm sido propostas propriedades funcionais adicionais da Vif que previnem a encapsidação da A3G nos viriões de uma forma independente da degradação, como a exclusão física da A3G dos locais de formação das particulas virias, ou inibição da encapsidação da desaminase por competição da ligação com componentes virais como a nucleocápside na poliproteína Gag ou no RNA viral(15,23).
1.3.3. Especificidade da espécie
Como praticamente todos os lentivírus têm um gene vif, é fácil extrapolar que a A3G ou proteínas da mesma família (por exemplo, APOBEC3F (A3F)) podem exercer actividade contra uma variedade de vírus deste género. Contudo, existe uma elevada especificidade ao nível da espécie na actividade da A3G, a qual está relacionada com determinantes genéticos muito específicos. Assim, a A3G humana é marcada para degradação pela Vif do HIV-1, enquanto que, por exemplo, a A3G do macaco verde africano não é afectada pela Vif do vírus humano. Esta especificidade também se aplica às proteínas Vif do HIV-1 e do SIV do macaco verde africano. Contudo, a Vif do SIV do macaco rhesus actua de uma forma mais alargada e já consegue neutralizar a A3G dos humanos e do macaco verde africano,
bem como a da própria espécie(13,25,27). É de salientar de as Vif do SIV dos chimpazés e do
SIV dos macacos fuliginosos conseguem degradar com sucesso a A3G humana, o que
explica como estes vírus representam os percursores dos HIV-1 e 2, respectivamente(15,23).
Um único resíduo de aminoácido na posição 128 na A3G humana é responsável por esta
Figura 6 | Degradação da APOBEC3G induzida pela Vif. Após interacção com a proteína viral, a desaminase sofre ubiquitinação pelo complexo E3 ubiquitina ligase que interage com a Vif.
Ubiquitinação
Degradação proteossomal
In tr o d u ç ã o
especificidade, sendo que a mudança deste resíduo da sequência do humano (aspartato) para o da sequência do macaco verde africano (lisina), D128K, é suficiente para reverter a
sensibilidade às Vif do HIV-1 e do SIV do macaco(19,27). Igual função apresentam os
aminoácidos mente, os aminoácidos 14-17 da Vif também conferem a restrição à espécie(15).
Assim, demonstra-se que as defesas celulares que restringem a transmissão dos lentivírus dos macacos para o Homem podem ser ultrapassadas por polimorfismos subtis dentro de genes como o vif(8).
1.4. O factor anti-viral A3G
1.4.1. A família APOBEC
No Homem, os genes da enzimas APOBEC estão espalhados por vários cromossomas e resultam na produção de onze enzimas: AID (activation-induced deaminase), APOBEC1,
APOBEC2, sete enzimas APOBEC3 e ainda APOBEC4(9). Os genes da subfamília
APOBEC3 estão codificados em tandem no cromossoma humano 22q.13.1: APOBEC3A-B-C-DE-F-G-H. Todas as APOBECs têm os mesmos domínios característicos, um pequeno domínio em hélice-α seguido por um domínio catalítico (CD), um pequeno péptido linker, e um domínio pseudocatalítico (PCD); nas A3G e A3F (e também nas APOBEC3B e APOBEC3DE) estas unidades estão duplicadas formando uma estrutura hélice1-CD1-linker1-PCD1-hélice2-CD2-linker2-PCD2. Cada domínio catalítico contém o motivo
conservado His-X-Glu-(X)23-28-Pro-Cys-(X)2-4-Cys, no qual os resíduos de histidina e cisteína
se ligam a um ião zinco e o resíduo de glutamato está envolvido no transporte de protões durante a reacção hidrolítica de desaminação. Estes resíduos são fulcrais para que ocorra, na presença de água, a remoção de um grupo amina na posição C4 da base azotada 2´-desoxiciditina convertendo-a a 2’-desoxiuridina (Figura 7a)(13,14,15,27)
.
Figura 7 | Os dois domínios catalíticos da APOBEC3G. a | Tal como a A3F, a A3B e a A3DE, a A3G possui dois domínios catalíticos no entanto apenas o domínio N-terminal participa na reacção de desaminase, sendo o domínio C-terminal cataliticamente inactivo, estando envolvido na ligação ao RNA viral e, portanto, na encapsidação da desaminase no virião. b | O mecanismo de desaminação. Os resíduos de histidina e cisteína ligam-se a um ião zinco, e na presença de água o resíduo de glutamato promove o transporte de protões que culmina na libertação de um grupo amina na posição C4 da citosina, convertendo-a uracilo.
a
b CD1 CD2
C-terminal N-terminal
In tr o d u ç ã o
Apesar da A3G apenas realizar a sua actividade de desaminase em cadeias simples de
DNA(15), esta também se consegue ligar a DNA em cadeia dupla, RNA em cadeia simples e
dupla e a híbridos RNA:DNA. Nas APOBEC que contêm dois domínios de desaminase (CD1 e CD2), geralmente apenas um dos domínios está cataliticamente activo, estando o segundo domínio envolvido na ligação ao ácido nucleico (neste caso do HIV-1, RNA) e encapsidação no virião. Desta forma, as propriedades de ligação a ácidos nucleicos da A3G estão associadas com os seus dois domínios de desaminase: o domínio C-terminal fornece a actividade catalítica, ligando-se ao DNA em cadeia simples, enquanto o domínio N-terminal é cataliticamente inactivo mas pode ser vital para a ligação ao RNA viral, permitindo
que a enzima seja encapsidada nas partículas virais na forma de oligodímero(13,28).
A A3G foi a primeira enzima desta família que se descobriu inibir o HIV-1(20). Contudo, actualmente sabe-se que outros membros da família também são potentes inibidores da infecção pelo HIV, embora a A3G seja a que tem um maior efeito anti-viral. Depois da A3G, a A3F é o segundo membro desta família mais eficiente a suprimir infecções de HIV-1(Δvif). Ambas as enzimas são altamente neutralizadas pela Vif, por mecanismos de degradação dependentes da ubiquitinação, mas a Vif também é capaz de prevenir a encapsidação de
A3G e A3F através de mecanismos independentes da degradação(9,15,27,28).
1.4.2. Regulação intracelular da desaminase
O estudo intensivo da A3G fez despoletar variadas questões sobre a regulação desta actividade mutagénica potencialmente promíscua e do seu efeito tóxico no genoma celular. Estudos de localização subcelular indicam que a A3G é uma proteína citoplasmática que, ao
contrário de outros dois membro s da família APOBEC – AID e APOBEC1 – não é
transportada para o núcleo, sendo fortemente retida no citoplasma por acção de uma sequência de 16 aminoácidos (113 a 128) próxima do CD1 e que se sobrepõe a alguns
resíduos cruciais à interacção com a poliproteína Gag e com a Vif(29,30).
Contudo, a exclusão nuclear não deve ser o único mecanismo existente na célula para limitar a actividade A3G, uma vez que os componentes citoplasmáticos e nucleares se misturam aquando da divisão celular após a disrupção da membrana nuclear. De facto, a A3G expressa no citoplasma ocorre na forma de complexos ribonucleoproteicos (RNP) de
alta massa molecular (HMM – high-molecular-mass) (5-15kDa) nos quais a actividade de
desaminase da A3G é altamente inibida. A A3G na forma de complexos de baixa massa
molecular (LMM – low-molecular-mass) funciona como um potente factor de restrição ao
impedir a replicação do vírus logo após a entrada na célula. De notar que a acção da A3G LMM não é antagonizada pela Vif uma vez que esta é encapsidada em pouca quantidade nos viriões e só é produzida Vif na fase tardia do ciclo de replicação por intermédio da poliproteína Rev; logo, este efeito antiviral que ocorre mal o vírus entra na célula acontece
In tr o d u ç ã o
independentemente da incorporação da A3G nas partículas virais e é igualmente eficiente tanto contra o vírus selvagem como contra o HIV-1(Δvif). Mais, este bloqueio pós-entrada
não depende exclusivamente da desaminação(9,15).
1.5. A necessidade de novas terapias: o potencial terapêutico da
interacção Vif-APOBEC
Actualmente, a terapia antiretroviral ART (ou HAART, highly active antiretroviral therapy), consiste na administração de pelo menos 3 diferentes fármacos anti-retrovirais inibidores da
transcriptase reversa e da protease, no sentido de reprimir a replicação do vírus(4). Contudo,
a ART não representa uma cura, é uma terapêutica dispendiosa que apenas atrasa a progressão da infecção e deve ser administrada durante toda a vida.
A compreensão dos mecanismos de interacção das proteínas Vif viral e A3G celular potencia a descoberta de novas terapêuticas anti-retrovirais mais eficazes. A caracterização de novas moléculas capazes de bloquear a degradação da A3G pela proteína Vif, de inibir a ligação da proteína viral à desaminase ou a componentes do complexo da ligase de ubiquitina E3 são alvos a considerar para que o tratamento definitivo da infecção HIV/SIDA seja uma realidade conseguida num futuro não muito distante.
1.6. Objectivos e Hipótese de trabalho
Esta dissertação visa o objectivo global de criação de uma estratégia de inibição da interacção da proteína Vif do HIV-1 com o factor anti-viral celular A3G. Neste sentido, a ligação entre as duas proteínas é impedida pela sua separação física em diferentes sub-localizações celulares, tendo esta divisão sido conseguida pela formação de uma proteína A3G contendo um sinal de localização nuclear (NLS, nuclear localization signal). Desta forma, sendo a Vif uma proteína citoplasmática, a A3G retida no núcleo não poderia ser marcada para degradação pela Vif nem degradada no proteossomas celulares. Contudo, para poder desempenhar a sua actividade anti-viral, esta A3G modificada teria de revelar uma capacidade de se translocar para a proximidade da membrana celular para que posse ser encapsidada nos novos viriões, todavia evitando o reconhecimento por parte da Vif. Esta estratégia poderia ser dependente da ligação à porção da nucleocápside da poliproteína Gag do vírus, a qual dificulta a ligação da Vif, ou por desfasamento temporal da localização citoplasmática das duas proteínas, causado pelos diferentes tempos de semi-vida característicos de cada uma. Sob esta hipótese, e através de estudos ex vivo, esta proteína A3G modificada foi sujeita a análise quanto às seguintes propriedades: capacidade de evasão à marcação para a degradação provocada pela Vif; encapsidação nos viriões formados nas células produtoras e inibição da replicação viral nas células-alvo.
2.
Materiais e Métodos
Os anticorpos utilizados para a detecção de proteínas em Western blot, bem como as diluições usadas, estão sumarizados na Tabela 3 dos Anexos.
Os mapas dos plasmídios citados encontram-se na Figura 16 dos Anexos.
Na Tabela 4 dos Anexos encontra-se listada a composição de todas as soluções referidas.
2.1. Clonagem
2.1.1. Extracção de DNA plasmídico em média escala por kit (midiprep)
Antes de mais, para começar o processo de clonagem foi necessário realizar a extracção de DNA plasmídico clonado em bactérias, nomeadamente do vector de expressão em células eucariotas pcDNA3.1/Zeo(+) (Invitrogen) que será utilizado na construção dos clones; e do plasmídio contendo o gene humano da APOBEC3G (com o epitopo HA) clonado em pcDNA3.1/Zeo(+) (abreviadamente: pcDNA3.1/Zeo(+)-A3G-HA) (AIDS Research and Reference Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH), que irá servir de
DNA molde inicial. Ambos os plasmídios estão clonados numa estirpe de E.coli, TOP10F’
(Invitrogen) (genótipo: F'[lacIqTn10(TetR)] mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15
ΔlacX74 recA1 deoR nupG araD139 Δ(ara-leu)7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 λ-) e
devido à possibilidade de contaminação todos os procedimentos de manipulação de culturas bacterianas foram realizados em condições de esterilidade. Para obter uma cultura crescida destas bactérias transformadas com os plasmídios, foi realizado um inóculo de uma única
colónia em 250mL (média escala) de meio LB (líquido) com 100μg/mL de ampicilina (USB
Corporation) (resistência conferida pelo vector), com posterior incubação a 37ºC com agitação a 225rpm, durante a noite. No dia seguinte, toda a cultura é sujeita a centrifugação a 2400 x g durante 30 minutos e o sobrenadante desprezado, recolhendo-se assim o pellet de células. A extracção é então efectuada recorrendo ao Jetstar 2.0 Plasmid Purification MIDI Kit (Genomed), seguindo as instruções fornecidas pelo fabricante e todas as indicações opcionais que permitem obter melhor resultados em termos de quantidade e pureza do DNA obtido. O DNA foi eluído em água destilada, desionizada e autoclavada. A quantificação do DNA foi efectuada através do espectrofotómetro NanoDrop 1000 (Thermo Scientific), sendo posteriormente armazenado a -20ºC.
Para a preparação de um stock destas bactérias, foram necessários 5mL de uma cultura crescida, a qual foi sujeita a centrifugação a 3500 x g durante 10 minutos, o sobrenadante foi desprezado e o pellet ressuspenso em 1mL de uma solução de glicerol 10%(v/v). O stock ficou então armazenado a -80ºC.
Mat e riai s e Mét o d o s
2.1.2. Reacção de polimerização em cadeia (PCR, Polymerase Chain Reaction)
O gene da proteína A3G de Homo sapiens clonado no vector pcDNA3.1/Zeo(+) e contendo a sequência codificante do epitopo HA a jusante do gene, foi amplificado por PCR utilizando o seguinte par de oligonucleótidos sintéticos: forward NotI-NLS-A3G-F (5’ – ATA AGA ATG CGG CCG CTA AAC TAT ATG CCC AAG AAG AAG CGC AAG GTA GGA GGC AAG CCT CAC TTC AGA AAC ACA GTG – 3’) produzido pela InvitrogenTM, e reverse HA-XhoI-R (5’ – CCG CTC GAG CGG CTA AGC GTA GTC CGG AAC GTC G – 3’) produzido pela Thermo Fisher Scientific. Estes oligonucleótidos iniciadores, além da amplificação, permitem ainda a criação de sequências de reconhecimento de enzimas de restrição e a introdução de uma sequência (que codifica o sinal de localização nuclear) que será traduzida em fusão com o gene. Nesta reacção foi utilizada a polimerase de DNA Phusion (Finnzymes) uma vez que esta enzima apresenta uma forte actividade de revisão de provas e uma alta fidelidade, permitindo uma amplificação mais eficiente, com tempos de extensão menores e mais produtiva. A mistura e as condições da reacção estão descritas na Tabela 1 dos Anexos.
Posteriormente, recorreu-se a
electroforese em géis de agarose
SeaKem LE(Lonza) a 1% em tampão TAE 1X com 0,5μg/mL de brometo de etídio, para a visualização do DNA obtido separado de acordo com o tamanho molecular (em pb). Para tal,
adicionou-se à reacção de PCR tampão de aplicação e esta foi aplicada no gel, assim como 5μL do
marcador de pesos moleculares (GeneRuler 1Kb DNA Ladder, 0,5µg/µL - Fermentas). A electroforese da amostra e do marcador ocorreu em paralelo a uma voltagem de 0,5-5,0V/cm em tampão TAE, até atingir o nível de resolução desejado, seguindo-se a visualização do DNA através de luz ultravioleta utilizando o equipamento ChemiDoc (Bio-Rad) que permitiu fotografar a imagem obtida.
Após confirmação que o produto deste PCR tem um tamanho semelhante ao gene da
A3G (~1200pb), este foi purificado através de
electroforese em gel de agarose de
purificação
SeaKem GTG (Lonza) a 1%, do volume total da reacção. O gel foi visualizadonum transiluminador, a banda de interesse foi extraída e o DNA purificado pelo Jetquick Gel Extraction Spin Kit (Genomed) ou pelo Invisorb Spin DNA Extration Kit (Invitek).
Este DNA corresponde ao inserto que irá ser utilizado na clonagem pretendida, e para simplificação, será designado doravante pela abreviatura NLS-A3G-HA. Após quantificação no NanoDrop o DNA foi mantido a -20ºC.
2.1.3. Hidrólise enzimática de DNA
Para proceder à clonagem do inserto no vector de expressão utilizado (pcDNA3.1/Zeo(+)) foi necessário realizar a digestão dos dois DNAs com enzimas de
Mat e riai s e Mét o d o s
restrição, nomeadamente NotI e XhoI (Fermentas), as quais originam extremidades coesivas, 5’P projectadas. Os locais de clivagem no vector e as sequências de reconhecimento das enzimas estão esquematizados na Figura 16 e na Tabela 2 dos Anexos, respectivamente. Em condições de digestão dupla (com as duas enzimas em simultâneo) foi necessário utilizar 5U de NotI e 10U de XhoI por cada μg de DNA, em tampão O (Fermentas) para que a actividade de cada enzima atingisse uma percentagem de 100%. Assim, o volume total da reacção foi calculado tendo em conta o volume e a quantidade de DNA da amostra de inserto purificado, de seguida foi feito o cálculo dos volumes das enzimas necessários, adicionou-se o volume do tampão (10X) de modo a que ficasse a 1X no volume final de reacção; para arredondar o valor final completou-se com água destilada, desionizada e autoclavada. No caso do vector pcDNA3.1/Zeo(+), a digestão foi realizada usando DNA em excesso (5μg). As reacções ocorreram durante a noite a 37ºC, após a qual o volume total de cada reacção foi purificado por electroforese em gel de agarose de purificação (como descrito em 2.1.2.), o DNA purificado por kit, quantificado no NanoDrop e armazenado a -20ºC.
2.1.4. Reacção de ligação inserto-vector
Para ligar inserto e vector digeridos, utilizou-se a enzima ligase de DNA T4(New England Biolabs) e o respectivo tampão (10X). A ligação foi efectuada em 3 diferentes proporções de quantidade de DNA vector:inserto, preparadas em reacções distintas: 1:0, 1:1 e 1:3. A quantidade de vector utilizada foi de 60ng, sendo que a reacção 1:0 foi realizada como controlo uma vez que não incluía DNA do inserto. A reacção com a proporção 1:1 continha igualmente 60ng de inserto, e a reacção 1:3 levou 3 vezes mais DNA do inserto que do vector, ou seja, 180ng. As misturas de cada reacção foram preparadas utilizando o volume necessário de DNA de vector e de inserto que correspondesse à quantidade desejada; a estes foi adicionado 1μL de ligase (400000U/mL) e 1μL de tampão (de modo a ficar 1X no volume final), e o volume das 3 reacções independentes foi acertado com água destilada, desionizada e autoclavada, de forma a perfazer 10μL de volume final.
2.1.5. Preparação de bactérias electrocompetentes
Para clonar as construções efectuadas em bactérias TOP10F’, foi necessário torná-las competentes por electroporação. Nesse sentido, foi preparado um pré-inóculo com uma
cultura de TOP10F’ de um stock armazenado a -80ºC em 10mL de meio SOB sem
antibiótico e foi incubado a 37ºC em agitação (225rpm) durante a noite. No dia seguinte, 5mL desse pré-inóculo foram inoculados em 500mL de meio SOB sem antibiótico e
incubados sob as mesmas condições até atingirem uma OD600 entre 0,5 e 0,6; nessa altura
Mat e riai s e Mét o d o s
cultura foi centrifugada a 2400 x g por 30 minutos a 4ºC, utilizando copos de centrífuga de 250mL frios, e desprezado o sobrenadante, tendo sido necessário repetir novamente este passo até esgotar o volume total da cultura. O pellet de células foi ressuspenso em 50mL de 10%(v/v) de glicerol frio, através de movimentos circulares sobre gelo, e centrifugado a 2400 x g por 15 minutos a 4ºC, desprezando-se o sobrenadante de seguida. O último passo foi repetido novamente, sendo que o pellet foi ressuspenso no glicerol residual, aliquotado em tubos de 1,5mL com 40μL da suspensão e congelado de imediato através de azoto líquido, ficando as células armazenadas a -80ºC.
2.1.6. Transformação de bactérias electrocompetentes
A competência destas células foi testada pela adição a um dos tubos preparados de 10pg do plasmídio pUC19 (Invitrogen), seguindo-se o protocolo de electroporação descrito a seguir. Para além deste controlo, também foram transformadas a posteriori bactérias
competentes com o DNA das 3 reacções de ligação, adicionando para tal 2μL de cada
reacção aos tubos preparados com 40μL de bactéria, previamente descongelada em gelo.
As misturas de bactéria e plasmídio/ligação foram mantidas em gelo durante 15 minutos, sendo que após esse tempo toda a cultura foi transferida para cuvettes e a electroporação foi realizada a 1,8V e 200Ω num electroporador (Bio-Rad). A cada cuvette foram adicionados 500μL de meio SOC sem antibiótico e o volume total foi transferido para um tubo de centrífuga de 15mL, que foi colocado sob incubação a 37ºC com agitação a 225rpm durante 1 hora. Este pré-inóculo, além de permitir o início (arranque) do crescimento da cultura mais rápido, tem como objectivo permitir a expressão pela maquinaria celular do gene de resistência à ampicilina existente no plasmídio controlo pUC19 e no vector pcDNA3.1/Zeo(+) usado nas construções. Desta forma, após esta incubação, o volume total do pré-inóculo foi
plaqueado em meio LB agar (sólido) suplementado com 100μg/mL de ampicilina, e
novamente incubado a 37ºC, mas durante a noite (~16 horas). O aparecimento de colónias na placa inoculada com bactérias transformadas com pUC19 revela um teste positivo à competência das células.
2.1.7. Selecção e confirmação de colónias positivas para a clonagem
I) Selecção de colónias e extracção de DNA plasmídico em pequena escala sem kit (lise alcalina)
Das placas correspondentes às proporções de ligação 1:1 e 1:3, seleccionaram-se no
total 7 colónias isoladas que foram inoculadas em 6mL de meio LB com 100μg/mL de
ampicilina, seguindo-se incubação a 37ºC com agitação a 225rpm durante a noite. Da cultura obtida, 1,5mL foram utilizados para extracção do DNA plasmídico por lise alcalina
Mat e riai s e Mét o d o s
para confirmar que a construção foi bem sucedida. Este protocolo é realizado em pequena escala sem recurso a kit, e é utilizado nesta situação em que o DNA obtido não necessita elevada pureza. Após obtenção do pellet de células por centrifugação a 2300g, 5 minutos, a 4ºC e desprezo do sobrenadante, este foi ressuspenso em 150μL de solução I contendo 100μg/mL de RNase, lisado com 200μL de solução II e agitado por inversão. Após 2 minutos
de incubação a temperatura ambiente, o lisado foi neutralizado por inversão com 150μL de
solução III (previamente arrefecida a -20ºC), incubado a -20ºC por 9 minutos, e centrifugado durante 10 minutos, a 15700 x g. O sobrenadante obtido foi transferido para outro tubo de 1,5mL, centrifugado à mesma velocidade por 5 minutos, e novamente transferiu-se o sobrenadante para novo tubo; a este adicionou-se 500μL de isopropanol e centrifugou-se a 15700 x g durante 15 minutos, para precipitar o DNA. O pellet obtido foi lavado com 70%(v/v) de etanol e centrifugado a 15700 x g por 5 minutos, com subsequente aspiração do etanol e incubação a 37ºC durante 10 minutos para eliminação total do etanol. O DNA já seco foi resssuspendo em água destilada, desionizada e autoclavada, quantificado no NanoDrop e conservado a -20ºC.
II) Confirmação de clones positivos por hidrólise enzimática e electroforese em gel O DNA plasmídico obtido foi então sujeito a hidrólise enzimática, utilizando 1μg de DNA numa reacção com condições semelhantes às descritas em 2.1.3. O volume total da reacção foi aplicado em gel de agarose a 1% e a electroforese decorreu como descrita em 2.1.2.; após visualização do gel no ChemiDoc a identificação de construções que apresentavam duas bandas simultaneamente, correspondentes ao vector (~5000pb) e ao gene da A3G (~1200kb), confirmou a existência de clones positivos.
III) Extracção de DNA plasmídico em pequena escala por kit (miniprep) e sequenciação automática de DNA
A partir da cultura obtida no ponto I) acima, utilizaram-se os restantes 4,5mL para extrair DNA dos clones que se confirmaram ser positivos, desta vez através dos kit Invisorb Spin Plasmid Mini Two (Invitek) e JETQuick Plasmid Miniprep Spin Kit (Genomed), de forma a recolher DNA com um elevado nível de pureza, tendo sido efectuadas todas as recomendações fornecidas pelo fabricante nesse sentido. A eluição do DNA foi feita com água destilada, desionizada e autoclavada, e após quantificação no NanoDrop foi conservado a -20ºC. Mais tarde, uma alíquota foi sequenciada (Macrogen) para se poder confirmar em máxima resolução que a clonagem efectuada foi bem sucedida. Os resultados obtidos foram analisados recorrendo à aplicação Jellyfish v3.3.1.
Mat e riai s e Mét o d o s
2.2. Expressão proteica
Os procedimentos realizados nos seguintes pontos 2.2.1., 2.2.2. e 2.3.1. foram realizados sob condições de esterilidade numa câmara de fluxo vertical para assegurar o correcto manuseamento das culturas celulares.
2.2.1. Linha celular – HEK 293T
Uma vez obtidos clones positivos, estes foram aferidos quanto à expressão da proteína codificada em células eucariotas. Para esse efeito, recorreu-se à linha celular HEK 293T derivada de células embrionárias de rim humano (AIDS Research and Reference Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH), as quais são células epiteliais que apresentam crescimento em aderência. Estas células foram mantidas em cultura em meio DMEM completo: DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium - Lonza) suplementado com 10%(v/v) de soro fetal bovino (Thermo Scientific), 2mM L-glutamina (Lonza), 100U/mL de penicilina (Lonza), 100µg/mL de estreptomicina (Lonza), 0,25μg/mL de anfotericina B (fungizona) (Lonza). As células foram mantidas até 90% de confluência em frascos para
cultura celular de 75cm3 (Orange Scientific), a 37ºC numa estufa com atmosfera de 5% de
CO2, e foram utilizadas em ensaios até atingirem um máximo de 15 passagens.
2.2.2. Transfecção pelo método de fosfato de cálcio
Para iniciar o protocolo de transfecção, recorreu-se a uma cultura de células HEK
293T cultivadas num frasco de 75cm3 com uma confluência entre 70% a 90%. Após
contagem, foram semeadas 4 x 105 células por poço, em placas de 6 poços (34,5mm de
diâmetro dos poços – TPP, ou 34,7mm de diâmetro dos poços – Orange Scientific) e
mantidas na estufa. Cada poço de células semeadas foi usado na transfecção com DNA do clone respectivo, tendo-se reservado mais dois poços que serviram de controlo positivo e negativo: um que foi transfectado com o DNA do vector pcDNA3.1/Zeo(+) sem inserto, e outro com DNA do plasmídio pcDNA3.1/Zeo(+)-A3G-HA.
No dia seguinte, após observação das células ao microscópio (confluência entre 50% e 70%), foram preparados 2 microtubos por cada amostra de DNA a transfectar, referentes à mistura A e à mistura B. A mistura A continha o volume correspondente a 5μg de DNA, 25μL
de CaCl2 a 2,5M, e tampão TE 0,1X até perfazer 250μL; a qual foi então adicionada, gota a
gota sob agitação no vortéx, à mistura B composta por 250μL de tampão HBS 2X. Esta solução obtida, após incubação a temperatura ambiente durante 40 minutos, foi rapidamente misturada no vórtex (10 segundos) e aplicada gota a gota sobre a camada de células aderentes ao fundo do poço respectivo, de forma a distribuir homogeneamente o precipitado de pequenas partículas escuras visíveis ao microscópio. Durante os dois dias seguintes as
Mat e riai s e Mét o d o s
células permaneceram sob incubação na estufa, tendo sido substituído o meio de cultura 24 horas após transfecção por novo meio DMEM completo previamente aquecido a 37ºC.
2.2.3. Extracção e quantificação de proteínas
Ao fim de 48 horas após a transfecção, o meio foi retirado e as células foram recolhidas por ressuspensão em 1mL de tampão PBS 1X frio, transferidas para um microtubo de 1,5mL e centrifugadas a 200 x g 5 minutos a 4ºC. Depois de desprezado o sobrenadante, o pellet foi ressuspenso em 200μL de tampão de lise e passados 30 minutos de incubação em gelo centrifugou-se a 15700 x g durante 5 minutos. O sobrenadante foi recolhido para novo tubo de 1,5mL e armazenado a -80ºC.
A quantificação de proteínas dos extractos celulares foi efectuada recorrendo ao método de Bradford utilizando o reagente Bio-Rad protein assay (Bio-Rad), seguido as indicações do fabricante, num espectrofotómetro Infinite M200 (Tecan). As amostras foram normalizadas e o volume correspondente a 50μg de proteína total foi aliquotado para novo tubo, ao qual se adicionou tampão de aplicação 5X (de forma a ficar 1X no volume final), seguindo-se a desnaturação durante 5 minutos a 95ºC e armazenamento a -20ºC.
2.2.4. Separação de proteínas por electroforese em gel de poliacrilamida com
dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE)
Para separar as proteínas extraídas das células de acordo com o tamanho molecular (em kDa), aplicaram-se as amostras desnaturadas e 5μL de marcador de pesos moleculares
(PageRuler Prestained Protein Ladder – Fermentas) num gel de poliacrilamida formado por
uma fase de gel de concentração a 4% seguido de uma fase de gel de resolução a 10% (com espessura de 1,5mm), conforme as indicações do fabricante (National Diagnostics). A electroforese das amostras e do marcador decorreu em paralelo, através do sistema Mini-PROTEAN Tetra cell (Bio-Rad) no qual os mini-géis ficaram verticalmente imersos em tampão de corrida frio, a uma voltagem constante inicial de 100V e de 120V uma vez as amostras já se encontrassem no gel de resolução, até ao nível de resolução pretendido.
2.2.5. Western blot
Após a electroforese de separação, as proteínas foram transferidas do gel para uma membrana de nitrocelulose (Hybond ECL - Amersham Biosciences). A transferência decorreu a uma amperagem constante de 250mA durante 2 horas, e através do sistema Mini Trans-Blot Cell (Bio-Rad), onde o gel e a membrana ficaram submersos em tampão de transferência frio juntamente com um bloco de gel congelado. Depois, a membrana foi incubada rapidamente em reagente de Ponceau S Solution (Sigma Aldrich) pois este marca
Mat e riai s e Mét o d o s
todas as proteínas de uma forma não-específica e dessa forma foi possível confirmar o sucesso da separação das proteínas e da transferência. Após lavagem da membrana com
tampão TBS-T (Tween 20 – VWR) para eliminar vestígios de Ponceau, esta ficou a 4ºC
durante a noite a bloquear em solução de 5%(p/v) de leite magro em pó em TBS-T.
No dia seguinte, a membrana foi incubada durante 1 hora a temperatura ambiente com
uma diluição do anticorpo α-HA conjugado com a enzima peroxidase de rábano selvagem
(HRP - horseradish peroxidase), lavada durante 10 minutos com TBS-T e repetindo a lavagem 4 vezes com novo TBS-T. Depois, a membrana foi incubada com um reagente de detecção da actividade da HRP (ECL Plus – Amersham Biosciences, ou Immobilon Western – Millipore) de acordo com as indicações do fabricante, permitindo a detecção rápida de sinal emitido por quimioluminescência por exposição da membrana a uma película fotográfica (Hyperfilm ECL - Amersham Biosciences) durante cerca de 15 minutos, sendo seguidamente revelada e fixada.
A proteína de expressão constitutiva GAPDH (37kDa) foi escolhida como controlo endógeno ara normalizara a quantidade de células presente em cada amostra. Para a sua detecção, a membrana ficou a incubar a 4ºC durante a noite com uma solução de anticorpo
primário α-GAPDH diluído, no dia seguinte foi lavada durante 5 x 10 minutos com TBS-T, e
incubada com uma diluição do anticorpo secundário ratinho, que se liga ao anticorpo
α-GAPDH. Posteriormente a mais uma série de lavagens (5 x 10 minutos), foi novamente impressionada uma película fotográfica à membrana, como descrito no parágrafo anterior.
Ao longo do decorrer do trabalho prático, devido os resultados obtidos, surgiu a necessidade de recorrer a mais técnicas para avaliar a expressão proteica:
2.2.6. Extracção diferencial de proteínas do citosol e do núcleo
Foi realizado todo o procedimento descrito em 2.2.2., com as seguintes alterações: o número de células semeadas foi de 3 x 106, uma vez que se utilizaram caixas de Petri (100mm de diâmetro – Orange Scientific) em vez de placas de 6 poços; por esse motivo a quantidade de DNA utilizada foi de 20μg.
Após 48h pós-transfecção, retirou-se o meio de cultura e as células foram lavadas com 1mL de PBS 1X frio duas vezes, na segunda lavagem as células foram ressuspensas, recolhidas para um microtubo de 1,5mL e centrifugadas a 100 x g durante 5 minutos a 4ºC, desprezando-se o sobrenadante. O pellet de células foi ressuspenso em 300μL de tampão de lise de citosol completo e depois de centrifugado a 3000 x g, 4 minutos a 4ºC, o sobrenadante contendo as proteínas do citosol foi recolhido para novo tubo e armazenado a
-80ºC. O pellet foi lavado novamente com 300μL de tampão de lise de citosol completo,
centrifugado a 3000 x g, 4 minutos a 4ºC, e o sobrenadante desprezado, para eliminar por completo as proteínas do citosol. Seguiram-se 3 lavagens do pellet com 1mL de PBS 1X e
