Proteínas: Estrutura terciária

Proteínas

 Estrutura Primária Ligação covalente Secundária Ligação de Hs Terciária Ligações S-S e H

Interacções hidrofóbicas e electrostáticas

Forças de Van der Walls

Quaternária

Ligações de H

Proteínas

Caracterização:

 Conformação nativa/Desnaturação proteica

 Peso molecular

 Carga e pI

Proteínas



Classificação

Simples

Albumina e globulinas (globulares)

Colagénio, Fibrinogénio e queratina (fibrosas)

Conjugadas

Fracção proteica

Fracção não proteica

• Lipoproteínas

• Nucleoproteínas (Histonas, Telomerases)

• Metaloproteínas

 Metal ligado directamente à proteína

 Complexo de metal

• Glicoproteínas

Proteínas



Distribuição

Compartimento intravascular/extravascular



Catabolismo

Aminoácidos  NH₄+  NH₄+  _ureia



Balanço de N

Anabolismo/catabolismo Balanço +

Crescimento, gravidez, reparação celular

Balanço –

Proteínas

Função Exs:

Transporte TBG (transporte de hormonas da tiroide, T3 e

T4)

Apolipoproteínas Transferrina, …..

Imunidade humoral Imunoglobulinas

Manutenção pressão oncótica Todas (alb)

Enzimas Renina

Factores da coagulação Complemento

Inibidores de proteases ₁-antitripsina, ₂

-macroglobulina

Principais proteínas do plasma

Classe Proteína   sérica média (g/L)

Pre-albumina 0,25 Albumina 40 ₁-globulina ₁-antitripsina 2,9 ₁-glicoproteína ácida 1,0 ₂-globulina haptoglobina 2,0 ₂-macroglobulina 2,6 ceruloplasmina 0,35 -globulina Transferrina 3,0 Lipoprot. baixa densidade 1,0 Comp do complemento 1,0 -globulina Imunoglobulina G 14,0 Imunoglobulina A 3,5 Imunoglobulina M 1,5 Imunoglobulina D 0,03 Imunoglobulina E vestígios

Determinação das proteínas plasmáticas

 Amostra: soro não hemólisado e não lipémico

 Determinação do azoto total

 Determinação das proteínas totais

Método de Kjeldahl

Refratometria Estes métodos são influenciados por variações da temperatura, relação albumina/globulinas, hiperglicemia, hiperbilirrubinemia e hiperlipemia.

Método do Biureto

Método de Lowry

Método de Folin ciocalteau

Absorção no UV (280nm)

Ligação a corantes

Electroforese

Doseamento das proteínas totais



Método do Biureto (reacção colorimétrica; método

usado na aula laboratorial)

Fundamento: as proteínas reagem com o ião cúprico em

meio alcalino, produzindo um complexo de cor violeta. A intensidade da cor é proporcional à concentração de proteínas na amostra (avaliação espectrofotométrica)

Amostra: soro ou plasma

Hemólise acentuada interfere com a determinação

Estabilidade - temperatura de conservação

Electroforese/Focagem isoeléctrica

Electroforese Focagem isoeléctrica

Condiç separação pH constante (8,6) Gradiente de pH Meio usado Acetato de celulose Agarose

Agarose Gel poliacrilamida Gel poliacrilamida

Separação baseada Carga pI Peso molecular

Forma tempo

Aplicação Bandas estreitas Volume e área n crítica   da amostra _crítica N crítica (efeito da  ₎

Difusão Reduz resolução Neutralizada por eft focagem Temperatura Ambiente Arrefecimento, 10ºC

Electroforese

 Permite determinação semiquantitativa das proteínas do soro e

detecção de paraproteínas (Imunoglobulina produzida por um único clone de células da série B - banda discreta, por norma na região )

 Separação das proteínas – carga eléctrica

 As proteínas principais têm carga negativa a pH 8,6 e migram para o ânodo (a albumina desloca-se + rapidamente em direcção ao ânodo)

 Amostra: soro

Electroforese

 Separação em 5 bandas de acordo com a sua mobilidade:

 Albumina/ ₁-globulina/ ₂-globulina/ -globulina/ -globulina

 Com algumas técnicas – pré-albumina

 Se em excesso, bandas discretas de: PCR, -fetoproteína

 Electroforese

 As amostras de soro são colocadas em meio adequado (proteínas saturadas com tampão alcalino). As moléculas com maior carga negativa movem-se em direcção ao ânodo + rapidamente.

 Num proteinograma, observam-se 5 zonas de migração, em que a mais aniónica corresponde à albumina (menor peso molecular e maior carga eléctrica negativa) e as seguintes, respectivamente, as globulinas 1, 2,  e

.

 As fracções proteicas são fixadas, coradas (Ponceau S) e quantificadas por densitometria



Variação da concentração das proteínas:

 Taxa de Síntese proteica

 Taxa de remoção das proteínas

 Volume da distribuição das proteínas

Apenas as alterações nas proteínas mais abundantes (albumina e imunoglobulinas) tem um efeito significativo na concentração total de proteína.

As alterações na concentração de proteínas plasmáticas pode fornecer uma ajuda útil na avaliação do estado de hidratação.

Proteínas do plasma

 Hipoproteinemia

 Perda excessiva

 Doença renal

 D tracto gastrointestinal

 Inflamações do sistema digestivo

 Perda de sangue  Redução de ingestão

 Deficiência de proteínas na dieta

 Deficiente absorção  Redução da síntese  Doenças hepáticas  Alterações de imunodeficiência  Catabolismo acelerado  Queimaduras  Traumas  Outras lesões  Hiperproteinemia  Desidratação  Vómito  Diarreia  Acidose diabética

 Hipoaldosteronismo (deficiência de aldosterona )

Causas das alterações das proteínas

totais do plasma

Aumento

Hipergamaglobulinemia síntese proteica Paraproteinemia

Artefacto hemoconcentração

(aplicação errada de um torniquete)

Desidratação volume de distribuição

Redução

Má nutrição/má absorção

Doença hepática síntese proteica Imunodeficiência humoral

Super-hidratação volume de distribuição

Permeabilidade capilar

Estados catabólicos  excreção /metabolismo Perda de proteínas

Proteínas do plasma

Pré-albumina

 Raramente observada como banda isolada

 Semi-vida: 8 horas

 Rica em triptofano

 Liga-se à tiroxina (T4) e triiodotironina (T3)

 Liga-se à proteína transportadora do retinol

 Concentração diminuída

 Lesão hepática

 Queimaduras

 Necrose dos tecidos

 Ingestão de salicilatos

 Concentração aumentada

 Síndromes nefróticos

Proteínas do plasma

Albumina

 Presente em maior concentração no soro (cerca de 60%)

 Tempo de semi-vida 15 a 19 dias

 Síntese: fígado

 Velocidade de síntese depende da ingestão protéica e do teor de albumina circulante

 Proteína pequena – perdas na urina quando ocorrem lesões nos glomerulos renais

Proteínas do plasma

Albumina

 Funções

 Pressão osmótica coloidal do fluído intravascular

 Tampão  Transporte  Bilirrubina  Ácidos gordos  Cálcio e magnésio  Cortisol

 Algumas drogas (salicilatos)

 Anomalias

 Redução da concentração plasmática

 Ausência de albumina (analbuminemia)

 Albumina com características moleculares anormais (bisalbuminemia) – variante de albumina – sem consequências clinicas

Hipoalbuminemia

Redução da síntese Má nutrição Má absorção (doença de Crohn) Doença hepática (crónica) Volume distribuição Permeabili// capilar - septicemia - hipoxia Excreção/degradação Síndrome nefrótico Queimaduras Hemorragias Estados catabólicos

Proteínas do plasma

Ο

Hiperalbuminemia

Ο

Desidratação

Ο

Artefacto (inadequada colheita de sangue, infusão de albumina)

Ο

A síntese de albumina pode encontrar-se elevada em

algumas situações patológicas, mas não conduz a Hiperalbuminemia

Doseamento de albumina

 Precipitação/biureto – as globulinas são precipitadas por elevadas concentrações de sais; albumina doseada no sobrenadante pela reacção do biureto

 Electroforese

 “Dye binding” – formação de complexos entre proteínas

e corantes

HABA (2-(4`-hidroxiazobenzene) benzoic acid)

BCG (bromocresol green)

apresenta boa especificidade e não sofre interferências de bilirrubina, salicilatos, hemoglobina ou lipemia quando em níveis moderados.

BCP (bromocresol purple)

Globulinas



₁

– Globulinas

- inibidores de proteases



₁

-antitripsina



Proteína de fase aguda



Função: neutralizar enzimas

“tripsin like”



Níveis

elevados

– reacções inflamatórias,

durante a gravidez e com uso de contraceptivos



Cirrose hepática juvenil

– deficiência de ATT (é

sintetizada mas não se liberta do hepatócito)



Detecção

–

imunodifusão

radial,

ensaios



₁

-glicoproteína ácida

 Formação de certas membranas e fibras (em

associação com colagéneo)

 Fonte – membrana das plaquetas

 Baixo PM, Semi vida 5 dias

 É uma proteína de fase aguda, importante no

diagnóstico e seguimento de processos inflamatórios

 Concentração aumentada Processos inflamatórios Gravidez Neoplasias Pneumonia Artrite reumatóide

 Detecção – imunodifusão radial, ens.

imunoenzimáticos