EXTRATO ETANÓLICO OBTIDO DO COMPOSTO EXAURIDO DE Agaricus blazei NO CRESCIMENTO, ESPORULAÇÃO E GERMINAÇÃO IN VITRO DE Corynespora cassiicola E
NA INDUÇÃO DA ENZIMA PEROXIDASE EM PLANTAS DE PEPINO “JAPONÊS” UEDA, M.1*; SCHWAN-ESTRADA, K.R.F.1**; ITAKO, A.T.1; OLIVEIRA, R.R.1; AGUIAR, B.M.1 1Universidade Estadual de Maringá, Departamento de Agronomia. Av.Colombo, nº 5790, CEP 87020-900, Maringá-PR. E-mail: krfsestrada@uem.br; atitako@yahoo.com.br *Dissertação de Mestrado do 1º autor ** Bolsista produtividade CNPq
RESUMO: Os extratos de basidiocarpos de Agaricus blazei têm sido estudados na indução de resistência em plantas a doenças fúngicas em diferentes patossistemas, inclusive na cultura do pepino. Além dos basidiocarpos, o próprio substrato de cultivo (composto) poderia ser utilizado, pois, tem-se constatado a permanência do micélio do fungo no substrato e que a maioria dos produtores do A.
blazei não reutiliza os resíduos do composto descartando-o após a colheita dos cogumelos. Diante
disso, o presente trabalho teve como objetivo estudar os efeitos do extrato etanólico obtido do composto após o cultivo de A. blazei no desenvolvimento in vitro de Corynespora cassiicola e na ativação de enzimas envolvidas nos mecanismos de resistência como a peroxidase em plantas de pepino. Nos testes in vitro de crescimento micelial, esporulação e germinação, utilizando-se soluções aquosas nas concentrações de 0; 0,5; 5; 50; 500 e 5000 ppm, verificou-se que nenhuma das concentrações, incorporadas em meio de cultura BDA, inibiu o crescimento e a esporulação de C.
cassiicola, indicando a ausência de atividade antifúngica. No bioensaio com plantas de pepino,
constatou-se aumento significativo da atividade local de peroxidase (2ª folha), nas doses de 0,5 e 5 ppm, após o intervalo de indução de quatro dias, antes da inoculação com o C. cassiicola sendo que a dose de 0,5 ppm proporcionou a melhor resposta. Por meio dos resultados obtidos e pelo fato de não ter apresentado atividade antifúngica direta sobre o patógeno, nas concentrações testadas, o extrato etanólico obtido a partir do substrato de cultivo do A. blazei pode ser visto como um potencial elicitor biótico de resistência em plantas.
PALAVRAS-CHAVE: Cucumis sativus, Cogumelo Medicinal, peroxidase
ABSTRACT: The extracts of basidiocarps of Agaricus blazei have been studied in the resistance induction in plants to fungal diseases in different pathosystems, as in the cucumber culture. Besides the basidiocarps, the own cultivation’s substratum can be used, since most of the producers of A.
blazei reuse neither the residues of the discarded substratum after the crop of the mushrooms nor the
substratum inoculated that didn't produce satisfactorily. The purpose of the present work was studied the effects of ethanolic extract obtained of compost of Agaricus blazei in environment in vitro of
corynepora cassicola and induction of enzyme peroxidase in cucumber plants. In the tests of micelial
growth, esporulation and germination, using aqueous solutions in concentrations of 0; 0,5; 5; 50; 500 and 5000 ppm, it was verified that none of the incorporated concentrations in the medium BDA, inhibited the growth and the esporulation of the C. cassiicola, what suggests the non existence of fungicidal effect. In the experiment with cucumber plants a significant increase of the local activity of peroxidase was verified (2a leaf), in doses of 5 and 0,5 ppm. After the induction interval of four days, before the inoculation with C. cassiicola, the 0,5 ppm concentration showed significant differences in relation to the other doses. Based on the obtained results and for the fact of the abscense of direct antimicrobial activity on the pathogen in the tested concentrations, the ethanolic extract from the substratum of cultivation of A. blazei can be seen as a potential biotic elicitor of resistance in plants. KEYWORD: Cucumis sativus, Mushroom, peroxidase.
INTRODUÇÃO
O pepino “japonês” (Cucumis sativus L.) possui grande suscetibilidade à mancha de corynespora, que pode causar perdas de produção de até 60%. O agente etiológico é o fungo
Corynespora cassiicola (Berk. e Curt.) Wei e as principais medidas de controle adotadas têm sido o
controle químico e a substituição de variedades (VERZIGNASSI et al., 2003). Não há estudos sobre essa doença na cultura do pepino, especificamente, a respeito dos mecanismos de resistência. Atualmente, constata-se a preocupação com o uso indiscriminado de produtos químicos na agricultura convencional e também a busca pelo uso racional destes agroquímicos, visando reduzir o impacto ao meio ambiente (SIQUEIRA, 1997). Segundo Di Piero e Pascholati (2004), a aplicação de microrganismos e de agentes abióticos pode desencadear a ativação de mecanismos de defesa nas plantas contra patógenos. Neste contexto, a indução de proteção já foi observada em pepino e em diversas culturas como batata, café, cevada, cravo, feijão, fumo, maçã, melancia, pêra, tomate e uva (PASCHOLATI e LEITE, 1995), sendo que a proteção mostra-se viável em casa de vegetação e em campo. Entretanto, segundo esses mesmos autores, o grau de envolvimento de fatores estruturais e bioquímicos pré-formados e pós-formados, nas respostas de resistência, varia entre as diferentes interações hospedeiro-patógeno.
Sobre a indução de resistência em plantas, existem diversos trabalhos relatando a utilização de extratos de basidiocarpos de Agaricus blazei (cogumelo medicinal), a partir dos quais tem-se inferido o grande potencial como indutor de resistência a doenças fúngicas de plantas cultivadas, inclusive na cultura do pepino (DI PIERO e PASCHOLATI, 2004). Além dos basidiocarpos, o próprio substrato de cultivo (composto) pode ser testado, pois se tem constatado que a maioria dos produtores de A. blazei não reutiliza os resíduos do composto descartando-o após a colheita dos cogumelos. Atualmente, existem relatos da aplicação do composto como fertilizante e condicionador de solo (BONONI, 1995) e na substituição experimental de antibióticos na avicultura (MACHADO, 2004).
Neste sentido, existem possibilidades de aplicação dos resíduos do composto de produção do cogumelo medicinal na agricultura, principalmente na agricultura orgânica em pequenas propriedades. Citam-se como exemplos de sua aplicação o uso como biofertilizante e como possível indutor de resistência a doenças em plantas. Em função deste substrato de cultivo ser obtido por compostagem de materiais celulósicos e submetido à colonização pelo micélio de A. blazei, podem ocorrer formação de princípios bioativos (WASSER et al., 2002) e/ou a produção de diversos metabólitos capazes de induzir a resistência em plantas contra fitopatógenos.
Sendo assim, o presente trabalho teve como objetivo estudar os efeitos do extrato etanólico obtido do composto (substrato de cultivo) após o cultivo de A. blazei no crescimento micelial e na
esporulação in vitro de Corynespora cassiicola e na ativação da enzima peroxidase em plântulas de pepino.
MATERIAL E MÉTODOS
Obtenção do extrato etanólico
A extração etanólica foi realizada no Laboratório de Fitopatologia da Universidade Estadual de Maringá (UEM). O extrato etanólico foi obtido a partir de 100 g do composto utilizado na produção do A.blazei com a adição de etanol 100%. A extração ocorreu a 4ºC, por 14 dias. Após este período, fez-se uma primeira filtragem com papel filtro. A fase líquida retornou ao erlenmeyer e a fase sólida (resíduos do composto) foi triturada em um liquidificador, por dois minutos. Em seguida, esse composto triturado foi reinserido no erlenmeyer com etanol 100% à solução de extração inicial. Dessa forma, a extração etanólica prosseguiu por mais nove dias, totalizando 23 dias de extração. Em seguida procedeu-se a evaporação do solvente em evaporador rotativo (temp. 43,8 a 46,9 ºC) (CARDOSO, 2003). A solução obtida foi liofilizada (-50ºC sob 0,9 mbar) e resíduo em pó (extrato etanólico) obtido foi utilizado em todos os experimentos.
Isolado do Corynespora cassiicola
O isolado de C. cassiicola foi cedido pelo Laboratório de Fitopatologia (UEM) e mantido em meio de cultura BDA (batata-dextrose-ágar), em BOD a 23,5ºC r 2 ºC e luz fluorescente contínua (ALMEIDA e YAMASHITA, 1976). Quando necessário, o fungo foi repicado para realizar os ensaios
in vitro e in vivo.
Avaliação do crescimento micelial e esporulação
Para realizar o teste de crescimento micelial e esporulação, as soluções do extrato etanólico foram incorporadas ao BDA fundente de modo a obter-se concentrações de 0; 0,5; 5; 50; 500 e 5000 ppm e vertido em placas de Petri. Após a solidificação do meio, um disco de micélio (7 mm de diâmetro) de C. cassiicola, com 14 dias em BDA, foi repicado para o centro de cada placa, as quais foram vedadas com filme plástico e mantidas a 23,5ºC r 2ºC sob luz fluorescente contínua. As avaliações foram realizadas por meio de medições diárias do diâmetro médio das colônias (média de duas medidas diametralmente opostas), 24h após a instalação do experimento e perdurou até o momento em que as colônias fúngicas atingiram 2/3 terços do diâmetro da placa, (STANGARLIN, J.R. et al. 1999).
Após avaliar o crescimento micelial foi realizou a contagem de esporos. Para isto adicionou-se 10 mL de água destilada em cada uma das placas e a colônia foi levemente raspada. A suspensão foi
filtrada em gaze e os esporos foram contados em câmara de Neubauer e expressos em conídios por mL. Utilizou-se o delineamento experimental inteiramente casualizado (DIC) com 6 tratamentos (extrato etanólico nas concentrações de 0; 0,5; 5; 50; 500 e 5000 ppm e 5 repetições. Cada parcela foi constituída por 1 placa de Petri.
Avaliação da germinação de conídios
Para o teste de germinação adicionou-se 40 µL das soluções aquosas do extrato etanólico nas mesmas concentrações já mencionadas, e acrescentou-se 40 µL da suspensão de conídios de C.
cassiicola (1x104 conídios mL-1), nos pocinhos da placa utilizada em teste de ELISA (DI PIERO, 2003). No tratamento controle foi adicionado somente água esterilizada. A placa foi incubada a 23,5 oC sob luz fluorescente contínua. Após 3 h de incubação, a germinação dos conídios foi paralisada com adição de azul de algodão e a contagem foi ao microscópio ótico. Os resultados foram expressos em porcentagem de germinação.
Avaliação da indução de resistência em pepino
Sementes de pepino japonês, híbrido Hokushin (CU-117), foram semeadas em bandejas de poliestireno contendo substrato comercial sendo transplantadas para vasos (2,5L) (3 plantas por vaso) quando surgiu a primeira folha definitiva, parcialmente desenvolvida. Cada vaso continha solo não esterilizado e equivaleu a uma parcela experimental. Estes vasos foram mantidos em ambiente protegido até a emissão e expansão da terceira folha definitiva sendo então iniciados os tratamentos. Imediatamente antes da aplicação das soluções aquosas do extrato etanólico (0; 0,5; 5; 50; 500 e 5000 ppm), foi realizada a primeira coleta das segundas folhas (tratadas) e das terceiras folhas (não-tratadas) obtendo-se discos de tecido foliar com 1,3 cm de diâmetro de cada folha. Estes discos de folhas foram mantidos em freezer para, posteriormente, proceder a extração da enzima peroxidase. Os tratamentos foram aplicados com o auxílio de um atomizador, sendo a pulverização feita na face adaxial das segundas folhas (tratadas). Quatro dias após o tratamento e antes da inoculação, foi realizada a segunda coleta de folhas. No mesmo dia, fez-se a inoculação das plantas com suspensão de conídios (1x104 esporos mL-1). A terceira coleta foi realizada 22 dias após a inoculação.
O delineamento experimental foi inteiramente casualizado no esquema fatorial 6 x 3, com 24 tratamentos: 6 concentrações do extrato etanólico nas concentrações de 0; 0,5; 5; 50; 500 e 5000 ppm e 3 tempos de coleta: 0, 4 e 22 dias e 4 repetições por tratamento.
Extração da enzima peroxidase
Os discos foliares foram pesados e macerados em almofariz de porcelana com nitrogênio líquido até a obtenção de um pó fino. A extração da enzima foi realizada pela adição de 4 mL de tampão fosfato 0,01M (pH 6,0) a 4qC. O homogeneizado foi filtrado e guardado para leitura com
espectofotômetro. Em uma cubeta de vidro, com capacidade de 3 mL, foram adicionados 2,9 mL de tampão de reação (0,153 µL de H2O2 + 0,125 µL de guaiacol em 50 mL do tampão de extração) em 0,1 mL do extrato vegetal (filtrado). A reação foi observada em espectofotômetro, na faixa de 470 nm, anotando-se as leituras em intervalos de 20 segundos, durante cinco minutos (HAMMERSCHMIDT, 1982; LUSSO e PASCHOLATI, 1999). A atividade da peroxidase foi expressa em ' abs 470 nm/min.mg peso fresco.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Avaliações do crescimento micelial, esporulação e germinação de C. cassiicola
Os resultados obtidos em relação ao diâmetro médio das colônias de C. cassiicola não mostraram diferença estatística pelo teste de Tukey ao nível de 5%.
Tabela 1. Efeito das soluções aquosas do extrato etanólico sobre o diâmetro médio das colônias, esporulação (nº de conídios x 104) e conídios germinados de C. cassiicola (%).
Concentrações do extrato (ppm) Diâmetro médio da colônia (cm) Esporulação (nº de conídios x 104 ) Conídios germinados (%)
Testemunha 7,33a 0,81ª 48,25a
0,5 7,51a 0,34ª 53,75a
5 6,93a 0,52ª 48,00a
50 7,30a 1,02ª 50,75a
500 7,42a 0,65ª 51,50a
5000 7,82a 0,99ª 50,25a
Valores seguidos da mesma letra, na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade
Os resultados de esporulação, tal como para germinação também não mostraram diferença estatística. Assim, nenhuma das concentrações das soluções aquosas do extrato etanólico incorporadas ao meio de cultura causou inibição do crescimento, esporulação e germinação de C. cassiicola, o que sugeriu a inexistência de efeito fungitóxico dos referidos extratos. De acordo com as observações de Fiori-Tutida (2003) em trabalho com os patógenos Bipolaris sorokiniana e Puccinia recondita f.sp.
tritici, o efeito fungitóxico dos extratos brutos dos cogumelos Lentinula edodes (shiitake) e de A. blazei no crescimento micelial depende da concentração utilizada, além da sensibilidade intrínseca de
Pascholati, (2004), que não verificaram efeitos inibitórios sobre Colletotrichum lagenarium quando utilizaram extratos obtidos a partir de basidiocarpos desidratados de A. blazei na proporção de 5% a 10% (v/v), incorporados em meio BDA.
No presente experimento as concentrações de extrato utilizadas foram de no máximo de 5000 ppm ou 0,5%, consideradas baixas em relação às comumente utilizadas em ensaios similares. Quanto às concentrações adotadas, deve-se ressaltar que, em função do material utilizado para obtenção do extrato etanólico, e o composto ser de natureza muito heterogênea (no caso de extratos brutos), o uso de altas concentrações poderia significar aumento do risco da presença de substâncias supressoras ao próprio elicitor (LABANCA, 2002). De acordo com Fiori-Tutida (2003), a utilização de concentrações baixas (0,1% a 4%) pode interferir na expressão do potencial fungitóxico de extratos de cogumelos. Por outro lado, Di Piero e Pascholati (2004), não só verificaram a ausência de efeito fungitóxico dos extratos aquosos, como também, um aumento significativo da germinação de conídios de
Collethotrichum lagenarium em concentrações de 10% e 20%.
Avaliação da indução da enzima peroxidase em pepino
Os dados revelaram um aumento de atividade de peroxidase entre as amostras coletadas antes e após a aplicação dos tratamentos.
Tabela 2. Níveis de atividade de peroxidase (¨Abs/min/mg peso fresco) das segundas folhas coletadas (tratadas), antes e após terem sido tratadas com soluções do extrato etanólico, em diferentes concentrações.
Atividade da enzima peroxidase (ǻ470nm/min/mg proteína) Concentrações do
extrato (ppm) 0 dias 4 dias 22 dias
Testemunha 10,1a 20,2ª 23,6a
0,5 18,2a 55,2b 33,0a
5 35,0b 49,3b 29,8a
50 10,3a 23,0a 25,4a
500 17,5a 20,1ª 37,1a
5000 11,0a 32,8ª 39,7a
Valores seguidos da mesma letra, na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
Os níveis de peroxidase mais elevados, no intervalo de 0 a 4 dias de aplicação, foram encontrados nas duas menores concentrações (0,5 e 5 ppm). Assim, partindo-se de níveis variados de atividade da peroxidase, verificou-se que, no início do experimento, as parcelas referentes àquelas
duas doses, já se apresentavam mais elevadas que as demais parcelas, porém para a avaliação do possível efeito de indução, buscou-se comparar os níveis iniciais (sem aplicação), com os níveis 4 dias após a aplicação dos tratamentos, onde se pode visualizar uma diferença significativa para cada tratamento individualmente.
A atividade da peroxidase das amostras coletadas antes da aplicação em relação àquelas coletadas 4 dias após a aplicação, apenas a dose de 0,5 ppm, provocou aumento significativo, até mesmo em relação ao valor obtido com a testemunha. Essa elevação da atividade de peroxidase não se manteve até o final do experimento, com a presença do C. cassiicola (22 dias após a aplicação), indicando inclusive, queda da atividade. Nas terceiras folhas, diferentemente das segundas folhas, não houve nenhuma alteração significativa das atividades de peroxidase, 4 dias após a aplicação dos tratamentos em relação aos níveis iniciais, e nem entre os tratamentos individualmente, indicando que não houve efeito sistêmico nas terceiras folhas.
Tabela 3. Níveis de atividade de peroxidase (¨Abs/min/mg peso fresco) das terceiras folhas coletadas (não-tratadas), antes e após terem sido tratadas com soluções do extrato etanólico, em diferentes concentrações.
Atividade da enzima peroxidase (ǻ470nm/min/mg proteína) Concentrações do
extrato (ppm) 0 dias 4 dias 22 dias
Testemunha 16,5a 29,6ª 22,0a
0,5 26,2a 40,5ª 27,6a
5 10,5a 26,3ª 26,5a
50 12,2a 23,0a 23,1a
500 15,5a 33,9ª 20,0a
5000 18,3a 31,2ª 29,2a
Valores seguidos da mesma letra, na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. Também como nas segundas folhas, a infecção causada por C. cassiicola não estimulou qualquer alteração quanto ao aumento da atividade da peroxidase.
Segundo Di Piero e Pascholati (2004), que verificaram aumento da peroxidase em pepino, após 12 dias do tratamento com solução aquosa de basidiocarpos de A. blazei (ABL99/29), o efeito de proteção contra Colletotrichum lagenarium foi dependente da concentração de extrato utilizada, sendo que a 10% (v/v) o efeito foi apenas local e o efeito sistêmico só foi observado a partir da concentração de 20% (v/v).
Embora a expressão do aumento da atividade da peroxidase tenha sido sutil, reforça-se a hipótese do efeito de proteção, baseando-se no fato de que um dos principais mecanismos de defesa em pepino durante a SAR (Resistência Sistêmica Adquirida) é a lignificação que, por sua vez, está associada à atividade das peroxidases (NICHOLSON e HAMMERSCHMIDT, 1992). Sendo assim, de acordo com Di Piero e Pascholati (2004), a elevação do nível de atividade da peroxidase, isoladamente, não representa a resposta de defesa via indução da SAR, pois esta é uma característica multicomponente, mas abre a perspectiva de que outros mecanismos, não avaliados, possam ter sido ativados, uma vez que as diversas rotas metabólicas interagem e é esperado que alterações da atividade das peroxidases envolvam também alterações de outras enzimas presentes na mesma rota metabólica (LABANCA,2002).
CONCLUSÕES
O extrato etanólico obtido a partir do substrato de cultivo de A. blazei não apresentou atividade antimicrobiana direta nos testes in vitro e a aplicação de soluções aquosas do extrato etanólico, em plantas de pepino, provocou aumento significativo da atividade de peroxidase.
Com os resultados obtidos no trabalho, abre-se a perspectiva de que a purificação do extrato possa ser realizada, com a devida identificação do componente indutor, e conseqüentemente, a determinação da dose adequada do mesmo, capaz de agir de forma eficaz e duradoura no controle da mancha-alvo em pepino.
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