UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM SAÚDE COLETIVA
HUGO DE ALMEIDA VARELA
FIBRINA RICA EM PLAQUETAS INJETÁVEL (I-PRF): CARACTERIZAÇÃO CELULAR, MORFOLÓGICA E PROTEICA
Natal/RN 2018
Hugo de Almeida Varela
FIBRINA RICA EM PLAQUETAS INJETÁVEL (I-PRF): CARACTERIZAÇÃO CELULAR, MORFOLÓGICA E PROTEICA
Tese apresentada ao Curso de Doutorado do programa Pós-Graduação em Saúde Coletiva da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Doutor em Odontologia.
Orientador(a): Prof. Dra. Aurigena Antunes de Araújo
Co-orientador: Prof. Dr. Julio CM Souza
Natal/RN 2018
Catalogação na Fonte. UFRN / Departamento de Odontologia Biblioteca Setorial de Odontologia “Prof. Alberto Moreira Campos”.
Varela, Hugo de Almeida.
Fibrina rica em plaquetas injetável (I-PRF): caracterização celular, morfológica e proteica / Hugo de Almeida Varela. - 2018.
123 f.: il.
Tese (Doutorado em Saúde Coletiva) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-graduação em Saúde Coletiva, Natal, 2018.
Orientador: Aurigena Antunes de Araujo. Coorientador: Julio Cesar Matias de Souza.
1. Fibrina Rica em Plaquetas - Tese. 2. Histologia - Tese. 3. Fatores de Crescimento - Tese. I. Araujo, Aurigena Antunes de. II. Souza, Julio Cesar Matias de. III. Título.
RN/UF/BSO BLACK D12
A defesa deste trabalho foi realizada no dia 9 de agosto de 2018, em Natal/RN, obteve o conceito “aprovado”.
COMISSÃO EXAMINADORA
Profa. Dra Renata Cimões Silveira Universidade Federal do Pernambuco 1º Examinador
Prof. Dr. Hecio Henrique Moraes
Universidade Estadual do Rio Grande do Norte 2º Examinador
Prof. Dr. José Sandro
Universidade Federal do Rio Grande do Norte 3º Examinador
Profa. Dra. Ana Rafaela Luz de Aquino Universidade Federal do Rio Grande do Norte 4º Examinador
Prof. Dra Aurigena Antunes de Araujo
Universidade Federal do Rio Grande do Norte Orientadora
DEDICATÓRIA
AGRADECIMENTOS
A Deus, por todas as bênçãos derramadas em minha vida, por seu amor incondicional, pela graça e amparo em todos os momentos.
A minha amiga, esposa e companheira Mayara. Obrigado por estar comigo nessa caminhada, sonhando e realizando sonhos ao meu lado. A minha filha Maria, inspiração, alegria e fonte de amor para os meus dias.
Aos meus pais por me ensinarem os princípios que formaram o meu caráter, pelo apoio incondicional e por sempre incentivarem as minhas escolhas.
A minha orientadora, Aurigena Antunes de Araújo, por acreditar e confiar no meu trabalho. Seguramente fui contagiado por sua paixão pela pesquisa e pela docência. Meu agradecimento especial pela disponibilidade, pelo conhecimento compartilhado, pela transparência e por se dedicar de forma tão verdadeira à vida acadêmica.
Ao professor Julio Matias, pela amizade, companheirismo, confiança, experiência e conhecimentos compartilhados.
A todos os envolvidos na Base de Pesquisa de Farmacologia, pelo apoio e incentivo. Aos meus parceiros e parceiras Rômulo, Vinícius, Roseanne, Christiane, Lorena, Taís, João, Maisie e Suzana, por me auxiliarem e dedicarem esforço, conhecimento e tempo para realização dessa pesquisa. Certamente, esse é o legado mais importante dessa experiência de pesquisa – o companheirismo e a amizade.
Aos técnicos em laboratório de farmacologia, Flávio, César e Carla, pelo apoio, esforço e dedicação durante todo o desenvolvimento da pesquisa.
Aos técnicos do laboratório de morfologia, Socorrinho, Sara e Melina, pela paciência, apoio, atenção e cuidado durante toda a pesquisa.
À professora Ana Cristina, por todo entusiasmo, colaboração e suporte para o desenvolvimento de pesquisas com os concentrados plaquetários.
A Anderson Fernandes por toda disponibilidade, paciência e instruções na elaboração deste trabalho.
Aos meus colegas de turma, mestrandos e doutorandos do PPGSCol, por fazerem desse período um momento de aprendizado tão importante.
“O que é um cientista afinal? É um homem curioso olhando pelo buraco da fechadura, o buraco da fechadura da natureza, tentando saber o que está acontecendo...”
RESUMO
Estudos experimentais demonstram o efeito da fibrina rica em plaquetas (PRF) nas técnicas de regeneração tecidual otimizando o processo de reparo; podendo ser utilizada na forma líquida (i-PRF). O objetivo dessa pesquisa foi determinar a composição celular do i-PRF, caracterizar sua morfologia a nível microscópico, investigar a expressão de proteínas envolvidas no processo de reparo e avaliar sua interação com um material biocerâmico a partir de um modelo in vitro. Materiais e métodos: Foram colhidas amostras sanguíneas de 15 voluntários humanos para comparação dos constituintes celulares entre o i-PRF e o sangue periférico. Amostras de i-PRF e de coágulos sanguíneos foram cultivadas in vitro durante 10 dias. O sobrenadante das amostras foi colhido nos intervalos 1h, 8h, 24h, 3 dias e 10 dias para quantificação dos fatores de crescimento PDGF-AB e VEGF por ELISA. Amostras foram tratadas histologicamente para caracterização morfológica e submetidas à marcação imuno-histoquímica para as proteínas IL-10, OC e TGF-β. Investigou-se a expressão gênica do fator de transcrição Colágeno tipo 1. Foram preparadas amostras do i-PRF misturadas com cerâmica bioativa granulada (HA/β-TCP) para avaliação da interação entre esses compostos através MEV. Resultados: Observou-se maior concentração de leucócitos (8.124 ± 1.419) e plaquetas (3.96x105 ± 0.72) no i-PRF em comparação ao sangue periférico (p <0.001), com uma maior proporção de linfócitos (60%) no i-PRF. Maiores níveis de VEGF foram liberados a partir do coágulo sanguíneo (1933 ± 704) em relação ao i-PRF (852 ± 376; p <0.001). Não foram observadas diferenças entre os níveis de PDGF-AB. Ensaio imuno-histoquímico demonstrou imunomarcação para TGF-β, IL-10 e Osteocalcina no grupo i-PRF. Análises por RT-PCR demonstraram aumento da expressão de Colágeno tipo 1 no grupo do i-PRF. Microscopicamente observou-se a formação de grandes aglomerados de plaquetas e fibrina e uma rede de fibrina em distribuição tridimensional espacial com a presença de linfócitos distribuídos de forma homogênea. As imagens por MEV apresentaram boa integração entre os grânulos de cerâmica e a malha de fibrina formada pelo i-PRF. Conclusões: Análises morfológicas revelaram que o processo de produção do i-PRF resulta em uma rede tridimensional de fibrina a qual incorpora plaquetas, leucócitos, colágeno tipo I, osteocalcina e fatores de crescimento. Assim, o i-PRF torna-se uma boa abordagem como um material líquido para ser associado a outros biomateriais
ABSTRACT
One of the great challenges of clinical research is the development of new biomaterials that aid in tissue regeneration and accelerate the healing process. Experimental studies demonstrate the effect of platelet rich fibrin (PRF) on tissue regeneration techniques thereby optimizing the repair process, and can also be used in liquid form (i-PRF). The objective of this research was to determine the cellular composition of i-PRF, to characterize its morphology at a microscopic level, to investigate the expression of proteins involved in the repair process and to evaluate its interaction with a bioceramic material from an in vitro model. Materials and methods: Blood samples were collected from 15 human volunteers to compare the cellular constituents between i-PRF and peripheral blood. I-PRF and blood clot samples were cultured in vitro for 10 days. The supernatant of the samples was collected at intervals of 1h, 8h, 24h, 3 days and 10 days for quantification of PDGF-AB and VEGF growth factors by ELISA. Samples were histologically treated for morphological characterization and submitted to the immunohistochemical methodology for the labeling of IL-10, OC and TGF-β proteins. The gene expression of collagen transcription factor type 1 was investigated. I-PRF samples mixed with granular bioactive ceramics (HA/β-TCP) were prepared to evaluate the interaction between these compounds through SEM. Results: A higher concentration of leukocytes (8.124 ± 1.419) and platelets (3.96x105 ± 0.72) in i-PRF
compared to peripheral blood (p <0.001) was observed, with a higher proportion of lymphocytes (60%) in i-PRF. Higher levels of VEGF were released from the blood clot (1933 ± 704) compared to i-PRF (852 ± 376; p <0.001); no differences were observed between PDGF-AB levels. Immunohistochemical assay demonstrated expression for TGF-β, IL-10 and Osteocalcin in the i-PRF group. RT-PCR analysis showed increased expression of collagen type 1 in the i-PRF group. The formation of large platelets, fibrin clusters and a fibrin network in a three-dimensional spatial and homogeneous distribution were observed microscopically. SEM images showed good integration between the ceramic granules and the fibrin mesh formed by i-PRF. Conclusions: Morphological analyses revealed that the slow polymerization of i-PRF results in a three-dimensional fibrin network embedding platelets, leukocytes, type I collagen, osteocalcin, and growth factors. Thus, i-PRF becomes a good approach as an injectable material to be associated with other biomaterials
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Apresentação do PRP 10
Figura 2 – Apresentação do L-PRF após centrifugação 11
Figura 3 – Formação do i-PRF após centrifugação 18
Figura 4 - PRF block 20
Figura 5 – Amostragem primeiro momento experimental 28
Figura 6 – Amostragem segundo momento experimental 30
Figura 7 - Amostragem terceiro momento experimental 34
Figura 8 - Aspectos histológicos do sangue e i-PRF 37
Figura 9 - Aspectos imuno-histoquímicos do i-PRF 39
Figura 10 - Análise por MEV do i-PRF e sangue 41
Figura 11 - Análise da fibrina por FEG-MEV 41
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1 - Níveis de PDGF-AB e VEGF - i-PRF/sangue 38
Gráfico 2 - RT-PCR para Colágeno I 40
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Sequência de primers RT-PRC 33
Tabela 2 - Contagem de células - i-PRF/sangue 35
Tabela 3 - Contagem diferencial de leucócitos - i-PRF/sangue 35
Tabela 4 - Análise Bioquímica - i-PRF/sangue 36
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
µm Micrometro
µg Micrograma
β-TCP Beta fosfato tricálcico
ANOVA Análise de variância
DNA Ácido desoxirribonucleico
ELISA Ensaio de imunoabsorção enzimática
FC Fator de Crescimento
FEG-SEM Microscopia eletrônica de varredura com emissão de campo FGF Fator de crescimento para fibroblastos
g Força g de centrifugação
HA Hidroxiapatita
HE Hematoxilina & Eosina
IL Interleucina
IL-10 Interleucina-10
i-PRF Fibrina Rica em Plaquetas injetável
Kg Quilograma
L-PRF Fibrina rica em plaquetas e leucócitos
M Molar
MEV Microscopia eletrônica de varredura
ml Mililitro
mm Milímetro
NcHA Hidroxiapatita nanocristalina
nm Nanômetro
OC Osteocalcina
PAF Fator ativador de plaquetas
PBS Solução salina tamponada
PMN Leucócitos polimorfonucleares
PRF Fibrina Rica em Plaquetas
PRP Plasma rico em plaquetas
PDGF Fator de crescimento derivado de plaquetas
pH Potencial hidrogeniônico
RNA Ácido ribonucléico
RNAm RNA mensageiro
rpm. Rotações por minuto
ROG Regeneração óssea guiada
SABC Estreptavidina-biotina SPANOVA Análise de Variância
TCLE Termo de Consentimento Livre Esclarecido TGF-β Fator de Crescimento Transformante Beta TNF-α Fator de Necrose Tumoral Alfa
VEGF Fator de crescimento do endotélio vascular
SUMÁRIO
1.INTRODUÇÃO 8
2.REVISÃO DA LITERATURA 9
2.1 Concentrados plaquetários 9
2.2 Fibrina, hemostasia e reparo 12
2.3 PRF 12
2.4 Plaquetas e citocinas plaquetárias 13
2.5 Leucócitos e citocinas inflamatórias 15
2.6 PRF e apoio à imunidade natural 15
2.7 PRF na resposta cicatricial 16
2.8 PRF e angiogênese 17
2.9 i-PRF: Um PRF líquido 17
2.10 Protocolo para obtenção do i-PRF 17
2.11 Uso do PRF com substitutos ósseos 18
2.12 PRF e cerâmicas bioativa 19
2.13 Evidências do PRF no processo de reparo 21
3. OBJETIVOS 25
4. MATERIAIS E MÉTODOS – i-PRF 26
4.1 Desenho do estudo 26
4.2 Considerações éticas 26
4.3 Critérios de seleção da amostra 26
4.4 Período e local dos experimentos 27
4.5 Coleta sanguínea 27
4.6 Preparo do i-PRF 27
4.7 Momentos Experimentais 28
4.8 Análise celular e bioquímica 29
4.9 ELISA para PDGF-AB e VEGF 30
4.10 Análise histológica e imuno-histoquímica 31
4.11 Real time PCR 32
4.12 Microscopia Eletrônica de Varredura 33
5. RESULTADOS - i-PRF 35
5.1 Análise celular e bioquímica 35
5.2 Análise histopatológica 36
5.3 Liberação dos fatores de crescimento PDGF-AB e VEGF 37
5.4 Análise imuno-histoquímica 39
5.5 Expressão proteica por RT-PCR 40
5.6 Microscopia Eletrônica de Varredura 41
6. DISCUSSÃO 43
7. CONCLUSÕES - i-PRF 49
REFERÊNCIAS 50
APÊNDICES 55
ANEXOS 86
ANEXO A parecer consubstanciado do CEP 61
ANEXO B TCLE
1. INTRODUÇÃO
Um dos grandes desafios da investigação clínica é o desenvolvimento de novos produtos que auxiliem a regulação da inflamação, promovam a regeneração tecidual e acelerem o processo de cicatrização1–3. Na periodontia e implantodontia, muitos esforços têm sido feitos para diminuir o tempo de cicatrização, acelerar o processo de regeneração tecidual e de neoformação óssea. A fibrina rica em plaquetas e leucócitos (L-PRF), uma matriz autóloga de fibrina, leucócitos e plaquetas, rica em fatores de crescimento tem demonstrado otimizar o processo de reparo tecidual em diferentes aplicações4,5. O L-PRF revela uma rede de fibrina com fibras nanométricas que podem agir como arcabouço para migração, proliferação e diferenciação celular, assim como meio para armazenamento e liberação de fatores de crescimento, atuando nos processos de reparo e neo-angiogênese6,7. As ligações cruzadas formadas entre as fibras de fibrina estabilizam a arquitetura do arcabouço formado, criando uma nanoestrutura tridimensional com características mecânicas e comportamento biológico extraordinários8,9.
Em 2014, a forma líquida (injetável) da fibrina rica em plaquetas (i-PRF) foi desenvolvida a partir de mudanças na velocidade e tempo de centrifugação10. Utilizando menor velocidade de centrifugação e tubos plásticos específicos, o processo de coagulação da fibrina pode ser atrasado gerando um concentrado de leucócitos, fibrina e plaquetas na forma líquida. Essa forma de fibrina tem sido utilizada em técnicas de regeneração tecidual associada à enxertos ósseos particulados. A associação da fibrina líquida à biomateriais particulados tem-se demonstrado uma boa escolha pois a fibrina atua como uma cola, aglomerando as partículas do substituto ósseo escolhido, facilitando a sua manipulação, como também, otimizando suas propriedades biológicas no processo de reparo e regeneração por ser rica em fatores de crescimento11.
Na atualidade, são poucos os estudos descrevendo as características morfológicas, celulares e proteicas do i-PRF12,13. Diante disto, este estudo tem o objetivo de caracterizar morfologicamente a interação do i-PRF com uma cerâmica bioativa, bem como, identificar células, produtos bioquímicos, proteínas e fatores de transcrição presentes no i-PRF. Acredita-se que o i-PRF apresente vantagens do ponto de vista biológico e estrutural em relação ao coágulo sanguíneo e ao sangue periférico.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 CONCENTRADOS PLAQUETÁRIOS
O potencial regenerativo das plaquetas foi descoberto em 1974 por Ross e col14., Esses autores foram os primeiros a descreverem e demonstrarem que, isoladas do sangue periférico, as plaquetas são uma fonte autóloga de fatores de crescimento (FCs). Os FCs contidos nos grânulos alfa das plaquetas têm a capacidade de estimular a proliferação celular, a remodelação da matriz extracelular e a angiogênese15. As plaquetas são os principais elementos celulares envolvidos no processo de cicatrização, através dos processos de coagulação e pela libertação de FCs3.
Os concentrados de plaquetas foram produzidos com o desígnio de combinar as propriedades vedantes da fibrina com os fatores de crescimento das plaquetas, proporcionando uma base ideal para a cicatrização de feridas e regeneração de tecidos15,16. No desenrolar dos anos, uma variedade de concentrados plaquetários vem se desenvolvendo e seus resultados promissores vêm sendo comprovados por diversas pesquisas17,18,19. Essa variedade inclui; a cola de fibrina, o Plasma Rico em Plaquetas (PRP) e a Fibrina Rica em Plaquetas (PRF)20. Os concentrados plaquetários podem conter até 95% de plaquetas, enquanto que o coágulo sanguíneo contém uma média de 95% de glóbulos vermelhos, apenas 5% de plaquetas e menos de 1% de glóbulos brancos21.
O maior conhecimento sobre a atividade plaquetária e os fatores liberados pelas mesmas nos processos de reparo e regeneração sugeriu o uso desses concentrados plaquetários como adjuvantes cirúrgicos22. Por exemplo, as colas de fibrina são a
primeira geração de concentrados de plaquetas utilizadas como agente hemostático em diversas técnicas cirúrgicas, com muitas aplicações na cirurgia cardiotorácica, vascular, como também em cirurgia plástica e maxilofacial23. No entanto, por tratar-se de um derivado sanguíneo, permanecia um risco potencial para transmissão de agentes patogênicos. Novas pesquisas tiveram como objetivo, portanto, o desenvolvimento de produtos autólogos (do próprio paciente). Duas categorias de concentrados autólogos de plaquetas foram então descritas:
- O plasma rico em plaquetas : PRP 24,25
Consiste em uma modificação da cola de fibrina, resultante da centrifugação do sangue do próprio paciente coletado em tubos com anticoagulante. Para o preparo do mesmo os protocolos descritos usam, geralmente, uma dupla centrifugação para aumentar a concentração de plaquetas recolhidas: a primeira centrifugação, soft spin, que leva à separação do sangue em três camadas distintas e a hard spin, onde é suposto haver uma centrifugação mais longa e mais rápida, obtendo-se, novamente, três camadas distintas26.
O PRP é colhido e utilizado sob a forma de gel o qual é conseguido pela mistura do PRP com aditivos (trombina e cloreto de cálcio) para indução da polimerização da fibrina (Figura 1). Apesar dos bons resultados biológicos obtidos com o PRP27 , são reportadas
algumas limitações quanto à utilização rotineira desta técnica; principalmente o tempo para preparo, sensibilidade técnica e o custo material necessário para produção do PRP; além da possibilidade de reações imunitárias relativas à trombina utilizada (de origem bovina)26.
Figura 1. PRP pronto para ser utilizado, são utilizadas duas seringas para mistura
do aditivo no momento da aplicação do PRP.
- A fibrina rica em plaquetas: PRF (Platelet Rich Fibrin)28
Consiste na produção de um concentrado plaquetário a partir de uma única centrifugação do sangue coletado do próprio paciente em tubos sem anticoagulantes ou outros aditivos. A polimerização da fibrina ocorre de forma natural a partir da ativação dos fatores de coagulação pelo processo de centrifugação. É de salientar que o PRF apresenta consideráveis benefícios relativamente ao PRP: simplificação do processo e baixo custo, o que tem proporcionado sua utilização clínica. Dentro da grande família do PRF foram desenvolvidos subprodutos os quais se baseiam no conceito da centrifugação do sangue imediatamente após a coleta sem o uso de aditivos29. O L-PRF1 trata-se do concentrado na forma gel (Figura 2) o qual pode ser manipulado para utilização na forma de membranas ou plugs30. O i-PRF11 trata-se do concentrado na forma líquida, podendo ter aplicação injetável ou misturado com outro biomaterial (principalmente o osso particulado - Figuras 3 e 4).
Figura 2. L-PRF após coleta do tubo centrifugado, o mesmo pode ser manipulado
para utilização como membranas ou plugs.
2.2 FIBRINA, HEMOSTASIA E REPARO
A hemostasia abrange todos os fenômenos que permitem obstrução natural de uma falha (brecha) no sistema vascular por meio de um leito de fibrina. Depende das plaquetas e sua ativação, necessárias para a formação do coágulo de fibrina o qual apresenta duas funções primordiais: Conter o sangramento e constituir uma matriz temporária para migração celular. Uma vez que a hemostasia tenha sido alcançada, o coágulo de fibrina tornará possível a regeneração tecidual.
A rede de fibrina, constitui uma matriz transitória real, um verdadeiro arcabouço para o processo de reparo. O coágulo de fibrina atuará como alicerce para que as células que possuem receptores de integrina (monócitos, fibroblastos e células endoteliais) migrem para a área ferida. A plasmina formada após a lesão vascular permite a fibrinólise e produz fibrinopeptídeos que se revelam potentes quimioatratores para células imunes como neutrófilos e monócitos21,31–34. Assim, o coágulo de fibrina é submetido a uma remodelação intensiva coordenada por diversos mediadores celulares para que novo tecido seja formado.
2.3 PRF
O PRF é um coágulo de fibrina que concentra uma grande parte das plaquetas da amostra do sangue original. A arquitetura particular desta rede de fibrina é obtida sob a influência direta do modo de polimerização da fibrina no processo de centrifugação específico da amostra, conferindo-lhe propriedades mecânicas e biológicas particulares35. Ao contrário das matrizes de fibrina obtidas nos protocolos anteriores como o PRP; o PRF é obtido sem qualquer anticoagulante, utilizando as concentrações fisiológicas de trombina. Isso resulta em uma polimerização natural e progressiva durante o processo de centrifugação.
Durante a polimerização das fibras de fibrina, são possíveis duas arquiteturas: - As junções condensadas - formadas quando a trombina está em maiores concentrações: A rede é mais rígida e não propicia a migração celular. Este é o modelo obtido com colas de fibrina e com o PRP35. Estes derivados sofrem ativação plaquetária muito rápida e
forte ocasionando a liberação de forma massiva do conteúdo plaquetário. Além disso, a rigidez e alta densidade da malha de fibrina obtida dificultam a incorporação dessas moléculas (citocinas e FCs) as quais permanecem extrínsecas (entre as malhas na suspensão coloidal). Neste caso, as citocinas e os fatores de crescimento serão eliminados rapidamente35,36.
- Junções tri-moleculares ou ramificadas - obtidas com menores concentrações de trombina: A rede de fibrina tem uma organização que lhe confere um alto grau de elasticidade, propiciando a migração celular e uma boa retenção de moléculas, como os fatores de crescimento. Este é o caso do PRF35. A rede de fibrina homogênea e elástica vem de um processo de polimerização natural e progressivo que permite uma maior incorporação de citocinas e fatores de crescimento dentro da própria rede. Estas moléculas estarão disponíveis progressivamente durante a remodelação da matriz por fibroblastos37. A liberação de citocinas e fatores de crescimento é contínua por quase 7 dias, e continua até 14º dia pós-operatório38. Essa combinação íntima de citocinas, fatores de crescimento, glicoproteínas circulantes (fibronectina, vitronectina, trombospondina) e glicosaminoglicanos (heparina, ácido hialurônico) misturados na rede de fibrina contribui para potencializar o processo de cicatrização21,39,40. A organização tridimensional da matriz de fibrina é, portanto, um elemento importante pois permite a incorporação dos vários elementos essenciais à cura, como também, a migração de populações celulares específicas.
2.4 PLAQUETAS E CITOCINAS PLAQUETÁRIAS
Na realidade, as plaquetas são os principais elementos envolvidos nesse processo, através de sua ativação e pela libertação de FCs os quais iniciam e sustentam a cicatrização26. O papel das plaquetas é inicialmente dedicado à obtenção de hemostasia durante a formação do coágulo sanguíneo. A sua ativação envolve degranulação maciça, e permite a liberação de citocinas, fatores de crescimento e outros mediadores41. As principais citocinas liberadas pelas plaquetas ativadas são42–44: O TGF-β1 (fator de crescimento transformante β-1), PDGF (fator de crescimento derivado de plaquetas), IGF (fator de crescimento semelhante a insulina),EGF (fator de crescimento epidérmico) e VEGF (fator de crescimento do endotélio vascular).
Os TGFs ativam os fibroblastos para formação de pro-colágeno, que resulta na deposição de colágeno e cicatrização da ferida16. Os PDGFs, associados ou não com os
TGFs, aumentam a vascularização dos tecidos, promovem a proliferação de fibroblastos, aumentam a quantidade de colágeno, estimulam produção de tecido de granulação e potencializam a osteogênese45,46. O VEGF incita o início do processo de angiogênese, a mitogênese e a permeabilidade vascular; e o EGF conduz o crescimento de tecido epitelial, proporcionando também a angiogênese. Estas substâncias transformam a cicatrização em um processo mais rápido e eficiente, beneficiando a integração de enxertos, sejam eles ósseos, cutâneos ou cartilaginosos16. Ademais, o PRF dispõe de proteínas como a fibrina, fibronectina e vitronectina, que promovem a osteocondução através de sua ação na adesão celular, além da própria ação do TGF-β e do PDGF na estimulação dos osteoclastos, aperfeiçoando a qualidade dos resultados obtidos nos enxertos ósseos2,15,22.
Quando liberado por degranulação plaquetária ou secretado ativamente por macrófagos, TGF-β1 atua como fator de crescimento parácrino, afetando principalmente fibroblastos, células indiferenciadas e os pré-osteoblastos. O TGF-β1 induz a proliferação de fibroblastos e a produção de colágeno tipos I e III48,49, estimula as células progenitoras de osteoblastos e induz a apoptose dos osteoclastos50, sendo essencial nos
processos de cicatrização e regeneração óssea em longo prazo, evoluindo para um fator de remodelação óssea16. Janssesns e col.,51 em uma ampla revisão da literatura
investigando o papel do TGF-β1 sobre o tecido ósseo, concluíram que esta citocina atua no favorecimento do reparo ósseo in vivo confirmando o potencial osteogênico deste fator de crescimento no processo de reparo ósseo.
Os FC são liberados quando ativados por um estímulo ou agregados por alguns ativadores, entre eles o TGF-β e o PDGF-AB os quais são os dois tipos em maiores concentrações. A promoção da cicatrização de tecidos moles e duros ocorre através da estimulação da produção de colágeno para melhorar a resistência da ferida e iniciar a formação do calo ósseo38. Outras moléculas liberadas por plaquetas ativadas também desempenham um papel como mediadores: Fator von Willbrand, P-selectina, fibronectina, vitronectina, osteocalcina, osteonectina, trombospondina, fibrinogênio41,44. As citocinas regulam a migração, proliferação, quimiotaxia e diferenciação celular dentro do leito de fibrina, orientando os estágios iniciais do reparo21,52. Elas particularmente modulam a atividade de neutrófilos, linfócitos e células endoteliais; diretamente
envolvidas na eliminação de agentes patogênicos e células infectadas. Assim, as plaquetas promovem as propriedades hemostáticas do PRF, como a modulação das respostas inflamatória e imune41.
Atualmente, tem sido bem documentado que as plaquetas fornecem um rico conjunto de fatores de crescimento, no entanto, o conceito de produto rico em plaquetas, por vezes foi erroneamente resumido em um conceito mágico de fatores de crescimento. Este vício por fatores de crescimento pode influenciar e provocar o esquecimento dos papéis-chave de outros agentes presentes nestes produtos derivados do sangue. Entre a crença mística, os interesses comerciais e a verdade científica são necessários vários anos para comprovar o papel fundamental da fibrina e dos leucócitos nestes produtos. Considerando-se a complexidade da coagulação e da regeneração dos tecidos, os fatores de crescimento não são os únicos atores no processo fundamental da cicatrização53.
2.5 LEUCÓCITOS E CITOCINAS INFLAMATÓRIAS
Mais de 50% do total de leucócitos da amostra inicial de sangue permanece preso dentro da rede de fibrina do PRF. Todas as populações estão representadas (linfócitos, monócitos, neutrófilos polimorfonucleares, basófilos e eosinófilos), assim como os macrófagos que são o resultado da diferenciação dos monócitos dentro dos diferentes tecidos do corpo54. No processo de obtenção do PRF, a centrifugação exerce duas funções
principais: concentrar os leucócitos dentro do coágulo e possibilitar a liberação intensa de citocinas inflamatórias pela ativação dos mesmos. Uma análise por citometria de fluxo possibilita estabelecer a fórmula leucocitária do sobrenadante e exsudado do PRF. Por extrapolação e por comparação com a fórmula do sangue total, pôde-se concluir que os linfócitos são os leucócitos mais representados na matriz do PRF35. Em 2006, Dohan e col., avaliaram a presença das seguintes citocinas no exsudado PRF55:
- IL-1β, IL-6, TNF-α: citocinas imunes capazes de estimular a imunidade.
- IL-4: citocina cicatricial capaz de regular o processo inflamatório por feedback negativo. - VEGF promovendo a neovascularização
2.6 PRF E O APOIO À IMUNIDADE NATURAL
A fibrina contribui para propriedades imunes no PRF. Durante a remodelação do coágulo, os produtos resultantes da degradação de fibrina e o fibrinogênio são capazes de modular a atividade dos neutrófilos:
- Estimulando a migração de neutrófilos.
- Elevando a expressão do receptor CD11 / CD18 na superfície dos neutrófilos, permitindo sua adesão ao endotélio e sua transmigração, assim como, a sua adesão ao fibrinogênio56.
- Regulando a fagocitose e a degradação enzimática realizada pelos neutrófilos57. As células responsáveis pela resposta imune inata são a chave das propriedades imunes do PRF. Bielecka54 descreveu o importante papel dos neutrófilos, macrófagos e plaquetas na prevenção de infecções:
- Neutrófilos, a primeira população de leucócitos presentes na ferida, têm importante papel na fagocitose de microrganismos, detritos celulares e tecidos necróticos. Pelo menos 7 proteínas produzidas por neutrófilos possuem atividade antimicrobiana54
- Monócitos, diferenciam-se em macrófagos. Eles são capazes de induzir apoptose dos neutrófilos, a fim de evitar efeitos adversos nos tecidos vizinhos. Eles então fagocitam os neutrófilos mortos, contribuindo para a progressão do processo cicatricial.
- As plaquetas, bem como os macrófagos e os neutrófilos são capazes de produzir proteínas com propriedades antimicrobianas54.
As propriedades de defesa contra infecções pelo PRF são o resultado da cooperação entre leucócitos (em particular neutrófilos e macrófagos), plaquetas e matriz de fibrina. Estudos sobre concentrados plaquetários revelam efeitos interessantes sobre algumas cepas bacterianas, sugerindo uma capacidade do PRF na prevenção de infecções58,59 . Além das vantagens na cicatrização de tecidos, também foram relatadas a redução no desconforto e dor pós-operatória54,55,58.
De acordo com o estudo de Gaddis60 a IL-10 desempenha importante papel no controle da progressão da inflamação. Um dos mais importantes supressores da inflamação é a produção da IL-10 a qual inibe a resposta imune celular através da inibição
da transcrição de citocinas pró-inflamatórias61. Apoiado pelo estudo de Liu62 o qual
demonstra a IL-10 atuando como citocina anti-reabsortiva, regulando RANKL e estimulando a produção de OPG. Estudos de Evans63 descrevem a ação da IL-10 sobre a
osteoclastogênese impedindo a formação dos osteoclastos a partir do bloqueio da diferenciação de células progenitoras da linhagem monócito-macrófago em pré-osteoclastos.
2.7 PRF NA RESPOSTA CICATRICIAL
A cicatrização de feridas é definida como um fenômeno biológico natural para a recuperação de lesões localizadas em tecidos humanos e animais através dos processos de reparo e regeneração. Geralmente dividida em 3 fases:
1 - A fase vascular e inflamatória
2 - A fase de reparação ou proliferação de tecidos 3 - A fase de remodelação ou maturação
Todos os componentes favoráveis à cicatrização e imunidade de feridas presentes em uma amostra de sangue parecem estar concentrados no PRF. Interessante destacar o papel destes constituintes em 3 processos essenciais de cura: controle de imunidade (fase inflamatória), angiogênese (fase de proliferação) e epitelização (fase de proliferação).
2.8 PRF E ANGIOGÊNESE
Angiogênese é o processo do crescimento de novos vasos sanguíneos. A matriz de fibrina, presente no PRF, seria capaz de induzir a angiogênese diretamente. A rede de fibrina constitui uma plataforma de comunicação controlando, dependendo do tamanho da ferida ou isquemia, as concentrações do fator pró-angiogênico (VEGF). Além disso, a acumulação celular no interior da matriz aumentaria a demanda de oxigênio, gerando condições hipóxicas; sinais para o processo de angiogênese. Finalmente, a fibrinólise (quebra dos polímeros de fibrina) é um sinal que indica o momento certo para desinibir a
angiogênese. Os próprios fragmentos de fibrina liberados (resultantes da fibrinólise) atuam como agentes pró-angiogênicos64.
2.9 I-PRF: UM PRF LÍQUIDO
Em 2014, o Dr. Choukroun modificou seu protocolo, apresentando uma nova versão para a tecnologia do PRF existente. Para isso é adicionada a possibilidade de produzir, de acordo com o mesmo conceito, um PRF líquido o qual ele nomeia i-PRF (Injectable-PRF)10. Graças a um novo protocolo e, sem adição de anticoagulante ou outro aditivo, é possível obter ao final da centrifugação um PRF que possa ser injetado.
2.10 PROTOCOLO PARA OBTENÇÃO DO i-PRF
O protocolo de coleta não varia, mas os tubos utilizados são plásticos e não contém nenhuma fase mineral ou anticoagulante. As características de centrifugação também são modificadas para obter este PRF na forma líquida. A centrifugação deve ocorrer por 3 minutos a 700 rpm (400g) em temperatura ambiente. Serão obtidas no tubo após a centrifugação, não mais 3 fases distintas, mas apenas 2:
- Um concentrado de hemáceas (parte inferior do tubo/vermelha) - Um sobrenadante que constitui i-PRF (parte alaranjada)
Figura 3. Formação do i-PRF após centrifugação específica do sangue periférico.
Precauções adicionais devem ser tomadas para evitar a mistura destas duas fases, com o objetivo de não alterar as propriedades do PRF líquido. A coleta deste sobrenadante deve ser feita com auxílio de seringa com agulha diretamente no tubo. O i-PRF foi projetado para atingir os mesmos objetivos que seu precursor (i-PRF), porém na forma líquida. Contém, como o PRF, a maioria das células do sangue, nomeadamente leucócitos (monócitos, neutrófilos, linfócitos) e plaquetas. Uma das principais características do i-PRF, além de estar em forma líquida, é coagular dentro de 5 a 10 minutos após sua produção.
2.11 USO DO I-PRF COM SUBSTITUTOS ÓSSEOS
O processo de remodelação óssea após uma perda dentária pode resultar em perda do volume ósseo afetando negativamente a reabilitação oral65. O material utilizado para regeneração do tecido ósseo pode ser dividido, de acordo com sua origem em autógeno, xenógeno e sintético ou aloplástico. Dentre todos os materiais, o osso autógeno, coletado no transoperatório (intra ou extra-oralmente)é considerado globalmente como a primeira escolha para técnicas de regeneração óssea, graças a suas propriedades como osteogênese, osteoindução e osteocondução. O osso autógeno apresenta maiores taxas de neoformação óssea quando comparado aos enxertos ósseos alógenos, homógenos, xenógenos ou sintéticos (aloplásticos)66. O osso humano possui uma estrutura porosa variando de 20 a
400 μm. Essa porosidade é necessária para penetração, adesão, crescimento e proliferação de células osteogênicas, permitindo assim a formação do novo tecido ósseo67. No entanto,
a utilização do osso autógeno apresenta certas limitações e desvantagens descritas na literatura como: volume limitado, morbidade e complicações cirúrgicas68. Substitutos
ósseos com baixa taxa de reabsorção, como o osso xenógeno ou cerâmicas, têm sido escolhidos em substituição ao osso autógeno66,69,70.
O processo de regeneração óssea a partir de enxertos envolve as etapas inflamatória, revascularização, osteogênese, remodelação e incorporação ao tecido ósseo nativo. O defeito ósseo deve ser preenchido por uma matriz que favoreça as fases de adaptação, migração e diferenciação das células precursoras de osteoblastos. Como previamente descrito, as características morfológicas, mecânicas e biológicas da rede de fibrina produzida pelo PRF podem dar suporte para migração de células envolvidas nos processos de angiogênese e osteogênese, assim como servir como fonte de citocinas
responsáveis pelo processo de regeneração tecidual1,4,71.
O PRF, tanto na forma líquida (i-PRF) com na forma de membranas (L-PRF), têm sido utilizado em associação à materiais ósseos autógenos, alógenos e xenógenos46,72,73.
O derivado plaquetário é misturado com o substituo ósseo particulado para produção de um bloco bioativo denominado (PRF-Block) utilizado nas técnicas cirúrgicas para aumento e manutenção de volume do tecido ósseo74(Figura 4).
No caso de defeitos ósseos extensos, o manuseio dos substitutos ósseos durante o período transoperatório pode ser difícil. O uso do PRF injetável associado ao biomaterial de enxerto particulado apresenta-se como uma boa estratégia. A fibrina líquida é lentamente polimerizada, atuando como um aglutinante do enxerto ósseo particulado, como mostrado na Figura 3. O uso do i-PRF tem sido ampliado entre os cirurgiões orais nas técnicas de regeneração tecidual por facilitar a manipulação do material enxertado durante a cirurgia, otimizar a cicatrização de feridas, melhorar as propriedades biomecânicas de enxertos ósseos particulados e aumentar seu potencial biológico12.
Figura 4. PRF Block: Formado pela mistura de fragmentos do
L-PRF, substituto ósseo e i-PRF.
A matriz de fibrina pode atuar como uma base para outros biomateriais, favorecendo a neo-angiogênese, enquanto que o substituto ósseo atua como suporte espacial para manutenção do volume a ser regenerado e suporte para deposição da matriz óssea. Esta combinação proporciona ao enxerto a força biomecânica necessária durante as primeiras etapas do processo de reparo75. Considerando que o PRF deve ser completamente reabsorvido, não deixando partículas residuais na área a ser regenerada, deve-se ter atenção ao escolher o substituto ósseo para a mistura com PRF, uma vez que faltam dados clínicos sobre a reabsorção dessa mistura76.
Até o momento, o número de estudos que avaliam o sucesso do PRF em associação com cerâmicas bioativas em seres humanos é escasso. Uma das cerâmicas bioativas mais utilizadas é a hidroxiapatita (HA) sintética. Elgendy e col., relataram que um enxerto ósseo com hidroxiapatita nanocristalina (NcHA) em combinação com PRF demonstrou vantagens clínicas em relação ao uso da NcHA isolada, no tratamento de defeitos intra-ósseos77. Outros estudos mostraram que a HA aumenta os efeitos regenerativos do PRF no tratamento de defeitos ósseos humanos de três paredes78, e que essa combinação apresenta efeitos sinérgicos79. Em estudo realizado em calvária de coelhos os autores relataram que a combinação do PRF com um enxerto de cerâmica sintética composta de hidroxiapatita e fosfato de beta-tricálcio (HA/β-TCP) resultou em um aumento significativo na formação óssea em comparação ao uso isolado de PRF ou HA/β-TCP80. Em outro estudo em coelhos, a associação de HA/β-TCP e PRF aumentou
significativamente a formação óssea, proporcionando um melhor substrato para a cicatrização óssea81. A associação do PRF e substitutos ósseos também pode ser utilizada na colocação imediata de implantes. O uso de L-PRF misturado com um xeno-enxerto equino em uma proporção de 50/50 durante a instalação imediata de implante demonstrou resultados promissores, podendo ser um complemento adicional para a regeneração óssea guiada6.
A maioria dos enxertos ósseos apresenta propriedade osteocondutiva. Assim, o uso adjunto do i-PRF pode ser útil na regeneração óssea devido às suas propriedades osteoindutivas13. Cada substituto ósseo apresenta um perfil particular em relação ao potencial osteogênico e à taxa de remodelação. Isso deve ser levado em consideração na seleção do biomaterial a ser utilizado no procedimento de regeneração óssea66.
2.13 EVIDÊNCIAS DO PRF NO PROCESSO DE REPARO
O PRF na forma de plugs e membranas tem sido utilizado como substituto dos enxertos de tecido conjuntivo em cirurgias plásticas periodontais, defeitos intra-ósseos e defeitos de furca4. O uso das membranas de PRF como único material para
preenchimento de defeitos alveolares pós-extração mostrou-se benéfico para a preservação das dimensões das cristas alveolares horizontal e verticalmente durante o período de três e quatro meses82.
O princípio da regeneração óssea guiada (ROG) é manter o volume criado cirurgicamente, evitando a penetração células epiteliais e fibroblastos no leito ósseo criado, favorecendo a migração de células envolvidas nos processos de angiogênese e osteogênese66,83 . Visando a regeneração do tecido ósseo, uma barreira física é utilizada prevenindo o crescimento de células não osteogênicas, derivadas do tecido conjuntivo da mucosa alveolar e do epitélio, permitindo o crescimento de células angiogênicas e osteogênicas derivadas do espaço ósseo medular as quais repovoam a região possibilitando a regeneração do defeito ósseo84.
O PRF na forma de membranas (L-PRF) pode agir como barreira, evitando a entrada de células epiteliais durante o processo de reparo do alvéolo dentário; podendo também, ser utilizado em cirurgias para implante, auxiliando no processo de manutenção do biótipo gengival, permitindo o ganho de tecido queratinizado30. As membranas
(L-PRF) também apresentam grande eficácia no fechamento de perfurações da membrana de Schenedeiran em cirurgia de sinus lift, evitando complicações adicionais85,86. Todavia,
ainda existe discussão na literatura sobre a efetividade do uso do L-PRF como barreira, principalmente por sua rápida degradação87; alguns autores defendem que uma membrana
de colágeno é necessária para evitar a inclusão de células epiteliais em grandes defeitos ósseos88. Um estudo in vitro encontrou resultados favoráveis para a membrana L-PRF como arcabouço para a proliferação de células do periósteo humano quando comparado às membranas de colágeno42. Em outro estudo preliminar realizado em humanos, um resultado semelhante foi relatado para a membrana L-PRF em termos de percentagens de formação de osso vital e enxerto xenógeno residual quando comparados à membrana de colágeno para cobrir uma janela lateral após sinus lift89.
L-PRF pode ser utilizado como único material de preenchimento nos casos de sinus lift associado à colocação de implante em mesmo tempo cirúrgico, uma vez que o
implante possibilita a manutenção da membrana no seio maxilar em posição elevada31,76– 78. O PRF Block também pode ser utilizado como material de preenchimento em cirurgias
de sinus lift90,91. A instalação de implantes nos defeitos ósseos tratados com L-PRF
também apresentou maior estabilidade em comparação a defeitos não tratados4. Foram relatados bons resultados entre a associação do L-PRF e a instalação de implantes imediatos, tanto como material de preenchimento como material para revestimento do implante93,94.
O desenvolvimento, a proliferação e a diferenciação dos osteoblastos ocorre nos primeiros 14 dias do processo de ROG95 , havendo a deposição de uma matriz provisória entre os dias 7 e 14; portanto, é de fundamental importância a presença dos fatores VEGF e TGF nos momentos iniciais do processo de regeneração. He e colab., relataram que o PRF libera níveis máximos de TGF-β1 no dia 1438. Ensaios clínicos randomizados controlados envolvendo a associação do PRF e enxertos alógenos são escassos. No entanto, os trabalhos existentes demostraram resultados significativos83,96–101. O uso em associação ao enxerto xenógeno pode neutralizar a reabsorção no sentido vestíbulo-lingual. No entanto, o uso do PRF como material de preenchimento de alvéolos tem sido questionado, pois poderia interferir no processo de reparo natural do alvéolo102,103.
Partículas de enxertos xenógenos podem estar presentes no local enxertado por um longo período de tempo (maior do que 9 meses), onde não foram completamente reabsorvidas104. Esses remanescentes podem diminuir o contato final do osso-implante
(BIC) em regiões onde implantes osseointegrados forem instalados105. Já o PRF pode ser
completamente absorvido, aumentando assim a proporção de osso “vital”. Lekovic e col., relataram que o L-PRF pode melhorar os parâmetros clínicos ligados aos defeitos periodontais intra-ósseos humanos106.
A combinação do L-PRF com enxertos xenógenos demonstrou bons resultados na redução da profundidade de sondagem de bolsas periodontais e no ganho de tecido ósseo em cirurgias de sinus lift107, apresentando tempo reduzido para reparo ósseo108. No entanto, em outro trabalho a aplicação de PRF em combinação com osso bovino desproteinizado não trouxe vantagem nem desvantagem em cirurgias de sinus lift após um período de cicatrização de 6 meses109. Alguns estudos com animais não relataram efeito adicional do PRF na regeneração óssea. Em um estudo realizado em calvária de coelho, os pesquisadores perceberam que o PRF não parecia proporcionar nenhum efeito adicional sobre a cinética, qualidade e quantidade de tecido ósseo formado110. Faot e col.,
também relataram que o tratamento com PRF não aumentou a regeneração óssea em defeitos de tíbia de coelho de tamanho não crítico após 28 dias111.
Ainda há falta de estudos randomizados controlados que avaliem a eficácia do PRF para a regeneração em grandes defeitos ósseos. Ezirganli e col., recomendam que o PRF não fosse usado como um único material na ROG, mas em associação ao enxerto ósseo bovino desproteinizado ou ao fosfato de cálcio bifásico em vez disso112.
Andrade e col113 descreveram o perfil hematológico de quatro formas líquidas de fibrina rica em plaquetas obtidas através de quatro protocolos diferentes. Os autores observaram que os leucócitos, plaquetas, linfócitos, monócitos e contagem de neutrófilos eram significativamente maiores no protocolo do i-PRF. No entanto, estudos futuros são necessários para avaliar o potencial biológico de cada formulação113. Em estudo in vitro foi demonstrado que o i-PRF possui a capacidade de liberar maiores concentrações de vários fatores de crescimento e induzir maior migração de fibroblastos e expressão de PDGF, TGF-β e colágeno tipo 1 quando comparado ao PRP114. Estudos in vitro têm demonstrado influência positiva do i-PRF sobre o desenvolvimento de fibroblastos e osteoblastos13,114. Alguns estudos utilizaram PRF e/ou cerâmicas bioativas nano porosas como arcabouço para células estromais mesenquimais apresentando resultados positivos83,115. No entanto, os autores afirmam que novas pesquisas são necessárias para validar o uso do i-PRF como um agente bioativo capaz de estimular a regeneração tecidual12.
O uso do PRF tem apresentado benefícios nos processos de reparo ósseo e osseointegração, estudos in vivo têm sido desenvolvidos para avaliação da combinação do PRF no processo de reparo tecidual17. O PRF pode ser produzido a partir de uma
técnica simples seguindo um protocolo correto30 e sua associação com outros biomateriais pode reduzir os custos finais do tratamento; uma vez que menor quantidade do substituto ósseo será necessária para o preenchimento do defeito ósseo. A correta manipulação do PRF, assim como, o uso de membranas/plugs associado a outros biomateriais no leito cirúrgico deve ser realizada de maneira criteriosa para obtenção dos benefícios desta técnica4.
3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
O objetivo do presente trabalho foi caracterizar o i-PRF a nível morfológico, celular e proteico.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Caracterizar o i-PRF a nível histológico
Quantificar a liberação e cinética dos fatores de crescimento PDGF-AB e VEGF.
Avaliar a imunomarcação das proteínas IL-10, Osteocalcina e TGF-β. Investigar a expressão gênica do fator de transcrição Colágeno tipo 1 Descrever a interação do i-PRF com material cerâmico (HA/β-TCP) a
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 DESENHO DO ESTUDO
Realizou-se um ensaio pré-clínico, in vitro, controlado.
4.2 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS
O estudo foi aprovado pelo Comissão de Ética em Pesquisa da UFRN 1.817.827 (Anexo A) seguindo as normas do Colégio Brasileiro de Experimentação. Sangue periférico foi coletado de 15 voluntários (selecionados entre a equipe de funcionários e alunos do Departamento de Biofísica e Farmacologia da UFRN) que seguiram os critérios de inclusão e exclusão do presente trabalho e concordaram participar da pesquisa mediante autorização em TCLE (Anexo B).
4.3 CRITÉRIOS DE SELEÇÃO DA AMOSTRA
4.3.1 CRITÉRIOS DE INCLUSÃO
Voluntários do sexo masculino com idade entre 25 e 35 anos, sem histórico de tabagismo, alcoolismo, uso de drogas ou qualquer medicamento nas 4 semanas prévias à coleta sanguínea; apresentando pressão arterial e frequência cardíaca normais (segundo as normas da Sociedade Brasileira de Cardiologia) no momento da coleta. O quadro de saúde geral do voluntário foi avaliado pelo pesquisador responsável pelo estudo através do questionário de saúde (Anexo C). Após a coleta sanguínea também foi realizado hemograma completo para avaliação sanguínea a nível celular.
4.3.2 CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO
Voluntários que mesmo cumprindo os critérios de inclusão apresentassem valores no hemograma diferentes dos padrões hematológicos de normalidade segundo as diretrizes da Associação Brasileira de Hematologia e Hemoterapia116.
4.4 LOCAL E PERÍODO DOS EXPERIMENTOS
Todos os procedimentos experimentais e laboratoriais, incluindo o preparo e a coleta de materiais orgânicos e os diferentes tipos de análise foram realizados pelo laboratório de Farmacologia do Centro de Biociências da UFRN, com o auxílio dos Departamentos de Morfologia (DEMOR), Engenharia de Materiais (DEMAT) e Patologia oral (PATOL), no período de novembro de 2016 a setembro de 2017.
4.5 COLETA SANGUÍNEA
Após preenchimento de formulário de avaliação de saúde (Anexo C), assinatura do TCLE (Anexo B), aferição da pressão arterial e frequência cardíaca do voluntário; foram coletadas amostras do sangue periférico de cada indivíduo a partir do acesso venoso no braço do mesmo, sendo algumas amostras destinadas para produção do i-PRF e outras amostras para análise sanguínea básica (hemograma completo) e testes com sangue periférico. A coleta foi realizada a partir de uma única punção feita com o uso de scalp (scalp BD vacuteiner®, 21G), sendo o material coletado em tubos vacuteiner (BD vacuteiner®). A coleta foi realizada por profissional habilitado em sala reservada seguindo todas as normas de biossegurança.
4.6 PREPARO DO i-PRF
Para preparo do i-PRF, foram colhidos 9 ml de sangue periférico em tubo plástico específico (Vacutainer, Process for PRF, Nice, France) e imediatamente centrifugado a 700rpm durante 3 minutos a temperatura ambiente utilizando centrífuga de bancada específica para essa finalidade (Intra-spin system, Intra-Lock, Boca-Raton, FL, EUA). Imediatamente após o processo de centrifugação, 2ml da camada de fluido amarelado (i-PRF) é aspirada o mais próximo possível da região do concentrado de hemácias com auxílio de pipeta.
4.7 MOMENTOS EXPERIMENTAIS
Os experimentos realizados foram divididos em três grandes momentos, com intervalo mínimo de tempo de 15 dias entre estes:
Em um primeiro momento foram realizadas as coletas sanguíneas para análise celular e bioquímica entre o i-PRF e o sangue periférico de 15 voluntários (Figura 5).
Em um segundo momento foram realizadas novas coletas sanguíneas de 8 voluntários (entre os 15 inicialmente selecionados) direcionadas ao preparo das amostras de sangue e i-PRF para análises por ELISA, HE e RT-PCR. Foi realizada, novamente, análise sanguínea básica para avaliação do quadro geral de saúde dos voluntários (Figura 6).
Em um terceiro momento foram realizadas novas coletas sanguíneas de 6 voluntários (entre os 8 voluntários selecionados no segundo momento) para o preparo de amostras de sangue e i-PRF para análises por MEV. Foi realizada, pela terceira vez, análise sanguínea básica para avaliação do quadro geral de saúde dos voluntários (Figura 7).
n=15 23ml/voluntário
4.8 ANÁLISE CELULAR E BIOQUÍMICA
De um total de 15 voluntários, foram colhidos 23 ml de sangue por indivíduo, sendo dois tubos (9ml / sem anticoagulantes) para produção do i-PRF e um tubo (5ml / com anticoagulante) para análises sanguíneas diretas. As amostras de i-PRF (imediatamente após processo de centrifugação) e sangue periférico de cada voluntário, (total de 15 amostras por grupo) foram analisadas a partir de aparelho de contagem automatizada por impedância CELL-DYN Sapphire (Abbott Diagnostics, Santa Clara, CA, EUA) para os seguintes grupos celulares: Contagem de hemáceas, contagem de plaquetas e contagem diferencial de leucócitos. As amostras também foram submetidas às análises bioquímicas para os seguintes marcadores: glicose, creatinina, colesterol total, ureia, triglicérides, ácido úrico, ALT/TGP, albumina, proteínas totais e globulina.
OBS: As coletas foram realizadas no próprio ambiente do laboratório de análises clínicas para que a análise do i-PRF, imediatamente após processo de centrifugação, fosse realizada na sua forma líquida; o mais rápido possível antes de sua geleificação o que poderia criar alguma discrepância nos resultados produzidos.
4.9 ELISA
As amostras com 2ml sangue periférico e 2ml de i-PRF (2 amostras por indivíduo de um total de 8 voluntários) foram transferidas para poços separados em placas com 6 poços. Após 20 minutos em repouso, as amostras foram cobertas com 2ml de meio de cultura (DMEM) e incubadas em estufa de CO2 (5%) a 37 Co. Nos intervalos de tempo
1h, 8h, 24h, 72h e 240h todo o meio de cultura (2ml) foi (aspirado) coletado e o mesmo volume foi adicionado ao poço com novo DMEM. O volume de 2ml aspirado foi armazenado em freezer a -80Co para análises posteriores. A metodologia foi adaptada do trabalho de Miron, 201712. Os fatores PDGF-AB e VEGF foram avaliados através de exame de imunoreatividade ELISA (Quantikine, R&D Systems, Minneapolis, MN, EUA) a partir do material aspirado; todas as determinações foram realizadas em duplicata e conforme as orientações do fabricante do kit.
4.10 ANÁLISE HISTOLÓGICA E IMUNO-HISTOQUÍMICA
Amostras de 1ml de sangue coagulado e 1ml de i-PRF (seis amostras por voluntário, total de 8 voluntários) foram transferidas para poços separados em placas de 24 poços, após processo de coagulação (20 min em temperatura ambiente), as amostras foram cobertas com 1ml de DMEM e incubadas em estufa de CO2 a 5% e 37 Co. Nos
intervalos de tempo, 1 hora, 3 dias e 7 dias, todo material do poço foi coletado e fixado em formaldeído tamponado a 10% para análises histológicas (HE, imuno-histoquímica e RT-PCR).
Após fixação, as amostras foram tratadas segundo protocolo desenvolvido por este grupo de pesquisa (a metodologia encontra-se em processo de patenteamento/anexo D junto ao Núcleo de Inovação Tecnológica da UFRN e, portanto, não pode ser divulgada publicamente até 2019) para análise histológica; foram produzidas secções de 3 μm as quais foram fixadas em lâminas e coradas a partir do protocolo de coloração por Hematoxilina-Eosina (HE). Os espécimes (3 lâminas por amostra) foram avaliados em microscópio de luz (Câmara digital MC 80 DX® - Microscópio Axioskop 2 plus® - (Zeiss, Jena, Alemanha), por dois patologistas de forma independente.
Para ensaio imuno-histoquímico secções com 3 μm de espessura foram transferidas para lâminas especiais cobertas por gelatina, sendo posteriormente cada secção desparafinizada e reidratada. Os cortes do i-PRF e sangue periférico foram lavados com 0,3% Triton X – 100 em tampão fosfato, submetidos a recuperação antigência com peroxidase endógena (3% de peróxido de hidrogênio) e incubados com os seguintes anticorpos primários (Santa Cruz Biotechnology, Interprise, Brasil) durante a noite a 4oC: IL-10, 1: 50; TGF- β1, 1: 100 e Osteocalcina 1:400. Os cortes foram
lavados com tampão fostato e incubados com os anticorpos de estreptavidina-HPR-conjugado secundário (Biocare médicos, Concord, CA, EUA) durante 30 minutos. A imuno-reatividade para IL-10, TGF-β1 e OC foi visualizada utilizando um kit para detecção colorimétrica seguindo as instruções do fabricante (TrekAvidin-HRP rótulo + kit, Biocare médicos, Dako, EUA).
As lâminas foram selecionadas e encaminhadas ao departamento de patologia oral da UFRN para produção de imagens digitalizadas através do scanner Pannoramic MIDI (3D HISTECH, Budapeste, Hungria) e analisadas a partir do software Pannoramic Viewer (3D HISTECH, Budapeste, Hungria).
4.11 REAL TIME PCR (RT-PCR)
As amostras de 1ml sangue coagulado e 1ml de i-PRF foram transferidas para poços separados em placas de 24 poços (6 amostras por indivíduo de um total de 8 voluntários). Após 20 minutos em repouso, as mesmas foram cobertas com 1ml de DMEM e incubadas em estufa de CO2 a 5% e 37 Co. Nos intervalos de tempo 1h, 3 dias
e 7 dias, todo material do poço foi coletado, transferido para eppendorf (2ml) e armazenado em freezer -80Co. Em seguida, realizou-se análise da expressão do RNAm para fatores proteicos listados abaixo a partir de RT-PCR. A análise foi realizada com o iniciador SYBR Green Master Mix. As amostras de RNA total foram extraídas dos eppendorfs com o reagente Trizol (Life Technologies, CA) e depois isoladas e purificadas com um sistema de isolamento de RNA SV (Promega Corporation, USA). A concentração de RNA foi determinada medindo a densidade óptica a um comprimento de onda de 260nm (OD260), com uma unidade de densidade equivalente a 40µg/ml de RNA. O cDNA foi produzido a partir do RNA isolado (5 µg) em uma mistura reacional contendo 4 µl de tampão de reação 5x, 2 µl de dNTP (10mM), 20 unidades de inibidor de RNase, 200 unidades de transcriptase reversa de mieloblastose aviária e 0,5g de Primer oligo DT (High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit, Foster City, CA) em um volume total de 20 µl. Deixou-se prosseguir a reação a 42oC durante 60 minutos e depois extinguiu-se por aquecimento a 70oC durante 10 minutos. Metodologia adaptada de Wang, 201713.
A expressão gênica foi avaliada por amplificação por PCR com os pares de iniciadores (Tabela 1) em placas contidas no termociclador Step-One-Plus (Applied Biosystems, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Para cada 1xPCR Master Mix, foram adicionados 2,5 µl de cDNA em um volume final de 20 µl. As condições de PCR foram as seguintes: 95oC durante 5 minutos, 40 ciclos de 30s a 95oC, 30s a 52-60oC, 60s a 72oC. A quantidade relativa comparada ao padrão foi calculada pelo método Ct comparativo, em que Ct é o número do ciclo no qual o nível de fluorescência excede primeiro o limiar. Os valores de Ct reportados foram obtidos subtraindo os valores de Ct detectados para o gene alvo daquele detectado para um gene de referência, nomeado, GADPH. A especificidade dos produtos PCR foi confirmada com as curvas de Melting.
Collagen Type I F: GATGGATTCCAGTTCGAGTATG R: GTTTGGGTTGCTTGTGTTTG GADPH F: GTCAGTGGTGGACCTGACCT R: AGGGGAGATTCAGTGTGGTG
4.12 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA (MEV):
Amostras do i-PRF e amostras de sangue periférico foram preparadas a partir da coleta sanguínea de seis voluntários. As amostras foram gotejadas sobre discos de titânio e armazenadas por 20 minutos em câmara úmida formando um biofilme sobre os mesmos. Amostras do i-PRF foram misturadas aos grânulos da cerâmica bioativa HA/β-TCP (Straumann® BoneCeramic, Basel, Switzerland) e armazenadas por 20 minutos em câmara úmida formando o PRF Block. Foram produzidas (por voluntário) 2 amostras de sangue sobre discos de titânio, 2 amostras do i-PRF sobre discos de titânio, 1 amostra de i-PRF associado à biocerâmica (PRF block); além de duas amostras da biocerâmica pura e duas amostras do disco de titânio sem aditivos. As amostras foram lavadas, fixadas, desidratadas e metalizadas para análise em MEV segundo Ota-Tsuzuki117. O microscópio eletrônico de varredura (MEV-Hitachi TM 3000) foi utilizado para avaliação morfológica do sangue e do i-PRF sobre uma superfície metálica e do i-PRF associado à biocerâmica, empregando a detecção por elétrons secundários, operando em 10kV. As magnificações empregadas para obtenção das imagens foram padronizadas em 50x, 200x, 1500x, 3000x e 10000x em três diferentes áreas para cada amostra. Para análises em aumento da ordem de 10000x a 35000x foram utilizadas as mesmas amostras utilizando a microscopia eletrônica de varredura com emissão de campo (FEG-SEM-Carl Zeiss Supra 35-VP) operando a 3kV. As imagens produzidas foram avaliadas através de software de imagens (CorelDRAW Graphics Suit X7, Londres, RU) para medidas da espussuras das fibras formadas em três pontos distintos por imagem. As análises foram realizadas no Departamento de Engenharia de Materiais (DEMAT) da UFRN.
Tabela 1: Sequência de primers
4.13 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Para análise dos dados, as informações coletadas foram inseridas em um banco de dados do software Statistical Package for Social Sciences (SPSS trial) na versão 20.0.
As amostras colhidas de cada voluntário foram divididas em dois grupos (Grupo Sangue e Grupo i-PRF) sendo as mesmas avaliadas de forma pareada. Os valores para comparação intergrupo e intragrupo foram apresentados a partir de médias e desvios padrão. O teste t Student foi utilizado para verificar a diferença entre as médias das variáveis analisadas adotando-se p<0.05 como valor significativo. Para análise dos dados do ELISA (onde houve a variável tempo) foi realizado o teste SPANOVA; Diferenças intergrupo e intragrupo foram consideradas significativas quando o valor de significância p apresentou ser menor do que 0.05.
5. RESULTADOS
5.1 ANÁLISE CELULAR E BIOQUÍMICA
Apesar da variabilidade entre os indivíduos estudados, os achados revelaram maior concentração de leucócitos e plaquetas no i-PRF em comparação ao sangue periférico, estando presente uma diferença entre o porcentual de linfócitos e neutrófilos em maior proporção de linfócitos no grupo do i-PRF em relação ao grupo do sangue periférico (Tabelas 2 e 3). Em relação aos achados bioquímicos investigados, não houve diferença entre o i-PRF e o sangue periférico (Tabela 4).
Tabela 2: Contagem de células entre sangue e i-PRF. Natal/RN, 2018.
Leucócitos Média (Desvio) Hemáceas Média (Desvio) Plaquetas Média (Desvio) Sangue 6.470 (1.419) 5.19x103 (0.51) 2.97x105 (0.79) i-PRF 8.124 (1.038) 0.69x103 (0.64) 3.96x105 (0.72) P 0.66 <0.001 0.001
p correspondente ao teste t para amostras pareadas.
Tabela 3: Percentual dos grupos de leucócitos entre sangue e i-PRF. Natal/RN, 2018.
Tipo Celular Sangue
Média i-PRF Média p Neutrófilos(%) 49.5 33.8 0.001 Linfócitos (%) 44.7 60.0 0.001 Basófilos (%) 0.0 0.0 Monócitos (%) 5.5 5.0 0.604 Eosinófilos (%) 0.8 1.2 0.124 Total (100%) 100 100
Tabela 4: Análises bioquímicas entre sangue e i-PRF. Natal/RN, 2018. Análise Bioquímica i-PRF Média/Desvio Sangue Média/Desvio p Glicemia em jejum (mg/dL) 96/29 97/28 0.95 Colesterol total (mg/dL) 198/38 202/40 0.99 Triglicérides (mg/dL) 162/66 169/62 0.31 Ureia (mg/dL) 39/14 40/14 0.94 Creatinina (mg/dL) 0.8/0.3 0.9/0.3 0.29 Ácido Úrico (mg/dL) 4.4/2.1 4.4/2.1 0.66 AST/TGO (U/L) 39/15 40/17 1.00 ALT/TGP (U/L) 31/14 30/14 0.95 Albumina (g/dL) 4,6/0.5 4,6/0.5 0.86 Proteínas totais (g/dL) 7,4/0,45 7,5/0,44 1.00 Globulina (g/dL) 2.9/0.3 2.8/0.3 0.85
p correspondente ao teste t para amostras pareadas.
5.2 ACHADOS HISTOLÓGICOS
A partir da coloração por HE pôde-se constatar que o i-PRF apresenta uma malha de fibrina rica em plaquetas envolta por leucócitos (principalmente linfócitos) e alguns eritrócitos (fig.8B). Após o intervalo de cultura por 10 dias o i-PRF preserva suas características morfológicas enquanto o coágulo sanguíneo passa a exibir áreas de material amorfo sugestivo de hemólise e perda da estrutura morfológica dos eritrócitos (fig.8D).
5.3 LIBERAÇÃO DE FATORES DE CRESCIMENTO ENTRE SANGUE E i- PRF
Em relação ao fator de crescimento PDGF-AB, não foi encontrada diferença estatística entre o i-PRF e o coágulo sanguíneo, no entanto, no intervalo de tempo de 10 dias percebe-se decréscimo da liberação deste fator de crescimento pelos dois grupos, com o coágulo sanguíneo apresentando maior diminuição em relação ao i-PRF. Em relação ao VEGF observou-se maior liberação deste fator pelo grupo do coágulo sanguíneo em relação ao i-PRF a partir das 24h de análise. O coágulo sanguíneo continua a liberação de VEGF em maiores proporções atingindo um pico nesta concentração nos intervalos de 3 dias e 10 dias, enquanto o i-PRF a partir do terceiro dia apresenta um decréscimo da liberação deste fator com sua menor taxa de produção ao décimo dia de experimento (Tabela 5 e Gráfico 1).
Figura 8. Achados microscópicos representativos do coágulo sanguíneo (A) e do i-PRF (B) após 24h e após 7 dias (C e D). As
imagens do coágulo sanguíneo após 7 dias apresentam áreas de material amorfo sugestivo de hemólise (triângulos). Observa-se ainda, preObserva-sença de leucócitos (linfócitos) de aspectos usuais (Observa-setas) e grumos de fibrina associados a agregação plaquetária (estrelas), completando o quadro histológico. (Scanner blades Viewer – H&E, 400X). Natal/RN, 2018.
